A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה מתאר בדיקת חסימה עבור מעכבי PD-1/PD-L1 באמצעות טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח. היא משתמשת באסטרטגיית אימוביליזציה דו-שלבית ומערכת חיץ מותאמת למדידה מדויקת של יחידות תגובה, מה שמקל על הערכת שיעורי החסימה של תרכובות או תרופות ביולוגיות. בנוסף, הוא תומך בזיהוי תפוקה גבוהה של מעכבי PD-1/PD-L1.
שיבוש האינטראקציה PD-1/PD-L1 הוא אסטרטגיה מבטיחה לאימונותרפיה של סרטן. פלטפורמות סינון אמינות חיוניות להערכת היעילות של מעכבי PD-1/PD-L1. בדיקת חסימת PD-1/PD-L1 אנושית שהוקמה בעבר תוך שימוש בטכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח (SPR) (פלטפורמת סינון SPR מעכב PD-1/PD-L1 מהדור הראשון) הדגימה תוצאות דומות לאלו שהושגו באמצעות פלואורסצנציה הומוגנית בפתרון זמן (HTRF) ומבחנים מבוססי תאים, עם פוטנציאל להקרנה בקנה מידה גדול. כאן, מוצגת גרסה אופטימלית של בדיקה זו (פלטפורמת סינון SPR מעכב PD-1/PD-L1 מהדור השני), הכוללת תהליך צימוד דו-שלבי המשלב צימוד אמין וביו-סטרפטווידין כדי לשפר את בקרת הכיוון PD-1 על השבב ולהפחית את צריכת החלבון PD-1. הפלטפורמה המעודכנת אומתה בהצלחה באמצעות מעכב PD-1/PD-L1 BMS-1166, והראה השפעות חסימה דומות לשיטה הקודמת המבוססת על SPR וטכניקות מבוססות אחרות כגון ELISA. תוצאות אלה מאשרות את מהימנות הגישה. פלטפורמת סינון SPR אופטימלית זו מציעה כלי בעל תפוקה גבוהה ואמין לזיהוי מעכבי PD-1/PD-L1 חדשים, קידום מחקר אימונותרפיה לסרטן והדגשת הפוטנציאל של SPR בבדיקת מעכבי מחסום חיסוני.
טיפולי חסימת מחסום חיסוני, במיוחד אלה המכוונים למוות תאי מתוכנת-1 (PD-1) וליגנד מוות תאי מתוכנן 1 (PD-L1), עומדים בחזית האסטרטגיות האימונותרפיות לסרטן. טיפולים נגד PD-1/PD-L1 קיבלו אישור לשימוש בסוגי סרטן שונים, כגון סרטן המטולוגי, עור, ריאה, כבד, שלפוחית השתן וסרטן הכליות1. PD-1 הוא גליקופרוטאין טרנסממברני השייך למשפחת העל של האימונוגלובולין, המאופיין בתחום דמוי משתנה אימונוגלובולין יחיד (IgV) בטרמינל N, גבעול של כ-20 חומצות אמינו המפריד בין תחום ה-IgV לקרום הפלזמה, תחום טרנסממברני, וזנב ציטופלזמי המכיל מוטיבים של איתות מבוססי טירוזין2. PD-L1, המזוהה כאחד הליגנדים ל-PD-1, הוא חלבון טרנסממברני מסוג I הכולל אזור טרנסממברני, שני תחומים חוץ-תאיים - קבוע אימונוגלובולין (IgC) ו-IgV - ותחום ציטופלזמי קצר יחסית המפעיל מסלולי איתות תוך תאיים3. המסלול המעכב PD-1/PD-L1 משמש כמחסום חיסוני קריטי המווסת את הפעלת תאי T ואת האוטואימוניות4. PD-1 מתבטא בתאי T, שם הוא מקיים אינטראקציה עם PD-L1, מעכב איתות קולטני תאי T וחוסם את הגירוי של מולקולות CD28 ו-CD80 על תאים מציגי אנטיגן ותאי T5. רקמות סרטניות מנצלות את המנגנון הפיזיולוגי הזה על ידי ביטוי יתר של PD-L1 בשלב הבריחה, ובכך יוצרות סביבה מדכאת חיסון המקדמת צמיחה והתקדמות של הגידול6. מעכבי PD-1 ו-PD-L1 משבשים אינטראקציה זו, ומאפשרים למערכת החיסון להתחמק מדיכוי המושרה על ידי הגידול וליזום מחדשאת תהליך המוות של תאי הגידול בתיווך תאי T.
בהתבסס על היסודות שהונחו על ידי התפקיד הבולט של טיפולי חסימת מחסום חיסוני, הפיתוח של מעכבי PD-1/PD-L1 סימן התקדמות משמעותית באימונותרפיה לסרטן. מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר תשעה מעכבי נקודות ביקורת חיסוניות המכוונים באופן ספציפי למסלול PD-1/PD-L1. אלה כוללים שישה מעכבי PD-1 - פמברוליזומאב, דוסטרלימאב, ניבולומאב, סמיפלימאב, אוריפלימאב וטיסלליזומאב - ושלושה מעכבי PD-L1 - אטזוליזומאב, אבלומאב ודורבלומאב 8,9. טיפולים אלה נוצלו ביעילות לטיפול במגוון סוגי סרטן, כגון מלנומה, סרטן ריאות, סרטן דרכי השתן, סרטן צוואר הרחם, סרטן הקיבה או הוושט וגידולים מוצקים אחרים10. למרות יעילותם, טיפולים מבוססי נוגדנים חד-שבטיים מתמודדים עם מגבלות משמעותיות, כולל שיעורי תגובה נמוכים, עלויות גבוהות, מחצית חיים ממושכת, תופעות לוואי חמורות הקשורות למערכת החיסון והגבלות על מתן תוך ורידי או תת עורי 11,12,13. כתוצאה מכך, המחקר מתמקד יותר ויותר בפיתוח מעכבי מולקולות קטנות המכוונים לציר PD-1/PD-L1. מולקולות קטנות אלו מציעות יתרונות מובהקים, כגון חדירה תאית משופרת, אפנון של מטרות ביולוגיות מגוונות, זמינות ביולוגית משופרת דרך הפה והפחתת עלויות, במטרה להשיג תוצאות טיפוליות דומות עם פחות תופעות לוואי14. עם זאת, הפיתוח של מעכבי מולקולות קטנות המכוונים לאינטראקציה PD-1/PD-L1 נמצא בשלביו המוקדמים, בעיקר בשל היעדר פלטפורמת סינון אמינה בעלת תפוקה גבוהה. פלטפורמות כאלה חיוניות להערכה מהירה של ספריות עצומות של מולקולות קטנות ולזיהוי תרכובות עופרת לצורך אימות ואופטימיזציה נוספים. התגברות על אתגר זה היא קריטית לקידום אימונותרפיה לסרטן.
טכנולוגיית תהודה פלזמון פני השטח (SPR) משמשת באופן נרחב באיתור ביומולקולות שונות, כולל אנטיגנים של נוגדנים, אנזימים, חומצות גרעין ותרופות, והיא יעילה במיוחד בבדיקת תרופות של מולקולות קטנות15,16. בניגוד לטכניקות ביופיזיקליות אחרות, SPR מציעה גילוי ללא תוויות, נתונים קינטיים בזמן אמת וטווח זיהוי רחב. לעומת זאת, קלורימטריית טיטרציה איזותרמית חסרה תובנות קינטיות בזמן אמת ודורשת נפחי דגימה גדולים יותר, מה שמגביל את התפוקה. תרמופורזיס בקנה מידה מיקרו נוטה להפרעות חוצץ ואינו יכול לספק נתונים קינטיים, בעוד שלאינטרפרומטריית שכבה ביולוגית יש מגבלות ספציפיות ליישום המבוססות על גודל ותכונות מולקולריות. פלואורסצנציה הומוגנית שנפתרה בזמן דורשת תיוג ורגישה להפרעות פלואורסצנטיות. אנו מכירים בכך ש-HTRF היא טכנולוגיה מתאימה נוספת לחקר מעכבי PD-1/PD-L1. מגבלה אינהרנטית אחת של HTRF, בהשוואה ל-SPR, היא כיבוי פלואורסצנטי הנגרם על ידי אינטראקציות חיצוניות עם תהליך העירור התוך-מולקולרי (למשל, העברת אלקטרונים, FRET והלבנה), הרגישות נמוכה מדי בתהליך סינון התרופות בגלל טווח החלונות הקטן, והפרעות מתרכובות ספרייה פלואורסצנטיות או חלבונים ביולוגיים17. תכונות אלו ממקמות את SPR ככלי מעולה לגילוי תרופות. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי SPR מסוגל לקבוע את אפקט החסימה של מולקולות קטנות כנגד PD-1/PD-L1, וזה יתרון על פני טכניקות אחרות הדורשות דרישות טכנולוגיות תיוג גבוהות, שלבים מרובים, ספציפיות ירודה ועלות גבוהה בתהליך גילוי התרופות18.
מחקר זה מציג פלטפורמה מבוססת SPR אופטימלית, המשלבת תהליך צימוד דו-שלבי המשתמש הן בצימוד אמין והן בצימוד ביו-סטרפטווידין כדי לשפר את כיוון PD-1 על השבב ולמזער את השימוש בחלבון. גישה מעודכנת זו אומתה בהצלחה באמצעות מעכב PD-1/PD-L1 BMS-1166 כקלסר בקרה חיובי, המדגים השפעות חסימה דומות הן לשיטת ה-SPR הקודמת שלנו והן לטכניקות מבוססות אחרות כגון ELISA19,20. זה לא רק מאשר את האמינות ויכולת השחזור של הפרוטוקול שלנו, אלא גם ממחיש את היעילות של הפלטפורמה המותאמת שלנו בהקלת סריקה בתפוקה גבוהה של מעכבי PD-1/PD-L1. השילוב של שלב לכידת הביו-סטרפטווידין מספק כיוון חלבון מכוון אתר ולא אקראי, ומאפשר ריכוז PD-1 מופחת (40 מיקרוגרם/מ"ל לעומת 10 מיקרוגרם/מ"ל) וחיסכון בעלויות על ידי מתן אפשרות למשתמש הקצה לשתק סטרפטווידין (SA) לשבב CM5, חלופה זולה יותר לשבבי SA משותקים. זה הופך אותו ליתרון עבור הקרנות בקנה מידה גדול וחסכוני של ספריות תרכובות/פפטידים. למרות ששיטות אפיון נוספות, כולל בדיקות in silico, in vitro ו-in vivo, חיוניות להערכת הפוטנציאל הקליני של מעכבי PD-1/PD-L1 נגד סרטן, פלטפורמת הסינון המשופרת מבוססת ה-SPR שלנו בולטת ככלי יעיל להקרנה בקנה מידה גדול של מעכבי PD-1/PD-L1.
הריאגנטים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.
1. קיבוע של חלבון הסטרפטווידין (SA) על שבב CM5
2. קיבוע של חלבון PD-1 על שבב SA
3. סקאוטינג התחדשות עבור PD-1 ו-PD-L1
4. אימות אינטראקציה PD-1/PD-L1
הערה: לצורך אימות, דוח18 שפורסם בעבר לווה בהתאמות קלות.
5. בדיקת חסימת PD-1/PD-L1 עם מעכב מולקולות קטנות: BMS-1166
הערה: עבור בדיקת המצור, דוח18 שפורסם בעבר לווה בהתאמות קלות.
קיבוע של SA על שבב CM5
הנתונים נותחו באמצעות הפלט ממכשיר ה-SPR ותוכנת הניתוח הנלווית המצביעים על השגה מוצלחת של ה-RU היעד (2000 RU) של חלבון SA בתא זרימה 1 ותא זרימה 2. תאי זרימה 1 ו-2 היו משותקים עם SA (40 מיקרוגרם/מ"ל) על משטח שבב CM5 עם תגובה סופית של 1902.3 RU בתא זרימה 1 (
במהלך העשורים האחרונים, גישות אימונותרפיות שונות - כולל חיסונים לסרטן, מעכבי נקודות ביקורת חיסוניות וטיפולים בתאי T CAR - קידמו משמעותית את הטיפול בסרטן21. נקודות ביקורת חיסוניות ממלאות תפקיד מכריע במניעת נזק אגבי בתיווך תאי חיסון במהלך תגובות פתוגניות ובדיכו...
למחברים אין מה לחשוף.
המחברים מכירים במתקן הליבה של RI-INBRE באוניברסיטת רוד איילנד, הנתמך על ידי מענק P20GM103430 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR), מרכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). מחקר זה נתמך על ידי פרס מענק פיילוט מהמכללה לרוקחות באוניברסיטת רוד איילנד, פרס מענק קטן ממרכז מדעי החיים של רוד איילנד (RILSH), ומענק קרן רוד איילנד, כולם הוענקו לצ'אנג ליו, Ph.D.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mM NaOH | Cytiva Life Sciences | 100358 | |
50 mM NaOH | Fisher Scientific | 905376 | |
96-Well Polystyrene Microplates | Cytiva Life Sciences | BR100503 | |
Amine Coupling Kit | Cytiva Life Sciences | 35120 | |
Biacore T200 SPR System and Evaluation Software 3.2 | Cytiva Life Sciences | 28975001 | |
Biotinylated Human PD-1 Fc, Avitag Protein | Acro Biosystems | PD1-H82F1 | |
BMS1166 | MedChemExpress | HY-102011 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNase Free Water | Fisher Scientific | 188506 | |
Glycine 1.5 | Cytiva Life Sciences | BR100354 | |
Glycine 2.0 | Cytiva Life Sciences | BR100355 | |
Glycine 2.5 | Cytiva Life Sciences | BR100356 | |
Glycine 3.0 | Cytiva Life Sciences | BR100357 | |
HBS-EP+ Buffer | Cytiva Life Sciences | BR100669 | |
Human PD-L1 Fc Tag Protein | Acro Biosystems | PD-1-H5258 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
Microplate Foil, 96-Well | Cytiva Life Sciences | 28975816 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Plastic Vials 7 mm | Cytiva Life Sciences | BR100212 | |
Rubber Caps, Type 3 | Cytiva Life Sciences | BR100502 | |
Series S Sensor Chip CM5 | Cytiva Life Sciences | 29149603 | |
Sodium Acetate 4.5 | Cytiva Life Sciences | 100350 | |
Sodium Acetate 5.0 | Cytiva Life Sciences | 100351 | |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved