Identificazione degli inibitori PD-1/PD-L1 con la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie

Riepilogo

Questo protocollo descrive un test di blocco per inibitori di PD-1/PD-L1 utilizzando la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie. Impiega una strategia di immobilizzazione in due fasi e un sistema tampone su misura per misurare con precisione le unità di risposta, facilitando la valutazione dei tassi di blocco per composti o farmaci biologici. Inoltre, supporta l'identificazione ad alto rendimento degli inibitori PD-1/PD-L1.

Abstract

L'interruzione dell'interazione PD-1/PD-L1 è una strategia promettente per l'immunoterapia del cancro. Piattaforme di screening affidabili sono essenziali per valutare l'efficacia degli inibitori di PD-1/PD-L1. Un test di blocco PD-1/PD-L1 umano precedentemente stabilito che utilizza la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) (piattaforma di screening SPR inibitore PD-1/PD-L1 di prima generazione) ha dimostrato risultati paragonabili a quelli ottenuti attraverso la fluorescenza omogenea risolta nel tempo (HTRF) e i saggi basati su cellule, con un potenziale per lo screening su larga scala. In questo articolo, viene presentata una versione ottimizzata di questo test (piattaforma di screening SPR con inibitore PD-1/PD-L1 di seconda generazione), caratterizzata da un processo di accoppiamento a doppia fase che combina l'accoppiamento di ammina e bio-streptavidina per migliorare il controllo dell'orientamento PD-1 sul chip e ridurre il consumo di proteina PD-1. La piattaforma aggiornata è stata convalidata con successo utilizzando l'inibitore PD-1/PD-L1 BMS-1166, mostrando effetti di blocco paragonabili al precedente metodo basato su SPR e ad altre tecniche consolidate come l'ELISA. Questi risultati confermano l'affidabilità dell'approccio. Questa piattaforma ottimizzata per lo screening SPR offre uno strumento affidabile e ad alto rendimento per identificare nuovi inibitori di PD-1/PD-L1, far progredire la ricerca sull'immunoterapia del cancro ed evidenziare il potenziale di SPR nello screening degli inibitori del checkpoint immunitario.

Introduzione

Le terapie di blocco dei checkpoint immunitari, in particolare quelle mirate alla morte cellulare programmata-1 (PD-1) e al ligando 1 della morte cellulare programmata (PD-L1), sono all'avanguardia nelle strategie di immunoterapia del cancro. Le terapie anti-PD-1/PD-L1 hanno ricevuto l'approvazione per l'uso in vari tipi di cancro, come i tumori ematologici, cutanei, polmonari, epatici, della vescica urinaria e renali¹. PD-1 è una glicoproteina transmembrana appartenente alla superfamiglia delle immunoglobuline, caratterizzata da un singolo dominio immunoglobulina variabile (IgV) al N-terminale, un gambo di circa 20 amminoacidi che separa il dominio IgV dalla membrana plasmatica, un dominio transmembrana e una coda citoplasmatica contenente motivi di segnalazione a base di tirosina². PD-L1, identificata come uno dei ligandi per PD-1, è una proteina transmembrana di tipo I caratterizzata da una regione transmembrana, due domini extracellulari - costante delle immunoglobuline (IgC) e IgV - e un dominio citoplasmatico relativamente corto che innesca le vie di segnalazione intracellulare³. La via inibitoria PD-1/PD-L1 funge da checkpoint immunitario critico che regola l'attivazione delle cellule T e l'autoimmunità⁴. PD-1 è espresso sulle cellule T, dove interagisce con PD-L1, inibisce la segnalazione del recettore delle cellule T e blocca la stimolazione delle molecole CD28 e CD80 sulle cellule presentanti l'antigene e sulle cellule T⁵. I tessuti tumorali sfruttano questo meccanismo fisiologico sovraesprimendo PD-L1 durante la fase di fuga, creando così un ambiente immunosoppressivo che promuove la crescita e la progressione del tumore⁶. Gli inibitori di PD-1 e PD-L1 interrompono questa interazione, consentendo al sistema immunitario di eludere la soppressione indotta dal tumore e di riavviare il processo di morte delle cellule tumorali mediato dalle cellule T⁷.

Basandosi sul ruolo di primo piano delle terapie di blocco dei checkpoint immunitari, lo sviluppo degli inibitori PD-1/PD-L1 ha segnato un progresso significativo nell'immunoterapia del cancro. La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato nove inibitori del checkpoint immunitario che mirano specificamente alla via PD-1/PD-L1. Questi includono sei inibitori PD-1 - pembrolizumab, dostarlimab, nivolumab, cemiplimab, oripalimab e tislelizumab - e tre inibitori PD-L1 - atezolizumab, avelumab e durvalumab ^8,9. Queste terapie sono state efficacemente utilizzate per trattare una varietà di tumori, come il melanoma, il cancro ai polmoni, il cancro uroteliale, il cancro cervicale, il cancro gastrico o gastroesofageo e altri tumori solidi¹⁰. Nonostante la loro efficacia, le terapie a base di anticorpi monoclonali devono affrontare limitazioni significative, tra cui bassi tassi di risposta, costi elevati, emivite prolungate, gravi eventi avversi immuno-correlati e restrizioni alla somministrazione endovenosa o sottocutanea 11,12,13. Di conseguenza, la ricerca è sempre più focalizzata sullo sviluppo di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio l'asse PD-1/PD-L1. Queste piccole molecole offrono vantaggi distinti, come una migliore penetrazione cellulare, la modulazione di diversi bersagli biologici, una maggiore biodisponibilità orale e costi ridotti, con l'obiettivo di ottenere risultati terapeutici comparabili con meno effetti avversi¹⁴. Tuttavia, lo sviluppo di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio l'interazione PD-1/PD-L1 è nelle sue fasi iniziali, principalmente a causa della mancanza di una piattaforma di screening affidabile ad alto rendimento. Tali piattaforme sono essenziali per valutare rapidamente vaste librerie di piccole molecole e identificare composti guida per un'ulteriore convalida e ottimizzazione. Superare questa sfida è fondamentale per far progredire l'immunoterapia del cancro.

La tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è ampiamente impiegata nel rilevamento di varie biomolecole, tra cui antigeni anticorpali, enzimi, acidi nucleici e farmaci, ed è particolarmente efficace nello screening di farmaci di piccole molecole^15,16. A differenza di altre tecniche biofisiche, SPR offre un rilevamento senza marcatura, dati cinetici in tempo reale e un ampio intervallo di rilevamento. Al contrario, la calorimetria a titolazione isotermica non dispone di informazioni cinetiche in tempo reale e richiede volumi di campione maggiori, limitando la produttività. La termoforesi su microscala è soggetta a interferenze tampone e non è in grado di fornire dati cinetici, mentre l'interferometria a biostrati presenta limitazioni specifiche per l'applicazione in base alle dimensioni e alle proprietà molecolari. La fluorescenza omogenea risolta nel tempo richiede la marcatura ed è suscettibile alle interferenze fluorescenti. Riconosciamo che l'HTRF è un'altra tecnologia adatta per esplorare gli inibitori di PD-1/PD-L1. Una limitazione intrinseca dell'HTRF, rispetto all'SPR, è l'estinzione della fluorescenza causata da interazioni esterne con il processo di eccitazione intramolecolare (ad esempio, trasferimento di elettroni, FRET e sbiancamento), la sensibilità è troppo bassa nel processo di screening dei farmaci a causa del piccolo intervallo di finestre e l'interferenza di composti di librerie fluorescenti o proteine biologiche¹⁷. Queste caratteristiche posizionano l'SPR come uno strumento superiore per la scoperta di farmaci. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che l'SPR è in grado di determinare l'effetto di blocco di piccole molecole contro PD-1/PD-L1, il che è vantaggioso rispetto ad altre tecniche che richiedono elevati requisiti di tecnologia di etichettatura, passaggi multipli, scarsa specificità e costi elevati nel processo di scoperta di farmaci¹⁸.

Questo studio introduce una piattaforma ottimizzata basata su SPR, che integra un processo di accoppiamento a doppia fase che utilizza sia l'accoppiamento amminico che quello bio-streptavidina per migliorare l'orientamento di PD-1 sul chip e ridurre al minimo l'uso di proteine. Questo approccio aggiornato è stato convalidato con successo utilizzando l'inibitore PD-1/PD-L1 BMS-1166 come legante di controllo positivo, dimostrando effetti di blocco paragonabili sia al nostro precedente metodo SPR che ad altre tecniche consolidate come ELISA^19,20. Questo non solo conferma l'affidabilità e la riproducibilità del nostro protocollo, ma illustra anche l'efficacia della nostra piattaforma modificata nel facilitare lo screening ad alto rendimento degli inibitori PD-1/PD-L1. L'incorporazione della fase di cattura della bio-streptavidina fornisce un orientamento della proteina diretto al sito piuttosto che casuale, consentendo una ridotta concentrazione di PD-1 (40 μg/mL rispetto a 10 μg/mL) e risparmi sui costi consentendo all'utente finale di immobilizzare la streptavidina (SA) su un chip CM5, un'alternativa meno costosa ai chip SA pre-immobilizzati commercializzati. Ciò lo rende vantaggioso per screening su larga scala ed economici di librerie di composti/peptidi. Sebbene ulteriori metodi di caratterizzazione, tra cui saggi in silico, in vitro e in vivo, siano essenziali per valutare il potenziale clinico degli inibitori di PD-1/PD-L1 contro il cancro, la nostra piattaforma di screening avanzata basata su SPR si distingue come uno strumento efficiente per lo screening su larga scala degli inibitori di PD-1/PD-L1.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Immobilizzazione della proteina streptavidina (SA) sul chip CM5

1. Imposta il metodo di immobilizzazione sullo strumento SPR: apri/ nuovo modello di procedura guidata , scegli l'immobilizzazione, imposta il tipo di chip su CM5 e fai scorrere le celle per ciclo su 1. Controllare l'immobilizzazione della cella di flusso 1 e della cella di flusso 2.
   1. Imposta Ammina come metodo di immobilizzazione. Obiettivo impostato per il livello immobilizzato, concentrazione del ligando: 40 μg/mL di streptavidina, livello target: 2000 RU, soluzione di lavaggio: 50 mM NaOH. Quindi, controlla l'adescamento prima di eseguire.
2. Preparare le seguenti provette: R2 B1 e R2 C1 - 40 μg/mL di streptavidina; R2 B2 e R2 C2: 50 mM di NaOH; R2 B3 e R2 C3: EDC; R2 B4 e R2 C4: SSN; R2 B5 e R2 C5: vuoto; R2 B6 e R2 C6: Etanolammina.
   NOTA: EDC e NHS attivano i gruppi carbossilici sul chip CM5, consentendo l'accoppiamento covalente con le ammine sul ligando. L'etanolammina viene utilizzata come tampone bloccante per prevenire il legame aspecifico durante l'immobilizzazione.
3. Diluire 20 mL di tampone HBS-EP+ 10× in 180 mL di acqua deionizzata (DI) per preparare 200 mL di soluzione tampone 1× HBS-EP+.
4. Aggiungere 1 mL di acqua priva di DNasi a 1 mg di streptavidina e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, diluire la soluzione di streptavidina a 40 μg/mL in tampone acetato (pH 4,5). Preparare i reagenti del kit di reagenti Amine Coupling secondo le istruzioni del produttore e posizionare tutti i layout dei reagenti pertinenti come indicato al punto 1.2.
5. Sostituire il chip del sensore di manutenzione con il chip CM5, quindi posizionare la provetta A nel tampone 1× HBS-EP+ preparato, riaprire il metodo di immobilizzazione e inserire le provette secondo il layout del passaggio 1.2. Eseguire il metodo e salvare il file dei risultati.
6. Manutenzione post-corsa: sostituire il chip CM5 con il chip del sensore di manutenzione, posizionare il tubo A in una bottiglia piena di acqua deionizzata ed eseguire l'adescamento. Dopo aver estratto il chip CM5, lavare il chip con alcune gocce di acqua deionizzata e asciugarlo all'aria. Posizionare il chip in una provetta da 50 ml a 4 °C.
   NOTA: L'SA immobilizzato consente al chip CM5 di funzionare come un chip SA.

2. Immobilizzazione della proteina PD-1 sul chip SA

1. Impostare il metodo di immobilizzazione sullo strumento SPR: aprire/nuovo modello della procedura guidata , scegliere l'immobilizzazione, impostare il tipo di chip su SA e far scorrere le celle per ciclo su 1. Controllare immobilizzare la cella di flusso 1 e la cella 2.
   1. Impostare la cattura SA-biotina come metodo. Per la cella 1 impostare l'immobilizzazione in bianco, per la cella 2 puntare al livello immobilizzato, 10 μg/mL PD-1 come ligando, livello target: 4000 RU, quindi controllare l'indice prima di eseguire.
      NOTA: Preparare i seguenti tubi - R2 B1 e R2 C1: 1 M di NaCl, 50 mM di NaOH; R2 B2 e R2 C2: 50% isopropanolo/50 mM di NaOH/1 m di NaCl; R2 C3: 10 μg/mL PD-1.
2. Sciogliere 58,44 mg di NaCl in 1 mL di 50 mM di NaOH per preparare 1 M di NaCl e 50 mM di soluzione di NaOH. Sciogliere 58,44 mg di NaCl e 4,0 mg di NaOH in 500 μL di acqua, quindi aggiungere 500 μL di isopropanolo per preparare la soluzione di isopropanolo al 50%/50 mM di NaOH/1 M di NaCl.
3. Preparare la soluzione di PD-1: aggiungere 200 μL di acqua priva di DNasi a 100 μg di PD-1 umano biotinilato (Fc e Avitagged) e stabilizzare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi diluire a 10 μg/mL in tampone acetato (pH 5,0).
4. Posizionare tutti i layout dei reagenti come descritto al punto 2.1. Posizionare la provetta A nella soluzione tampone di corsa HBS-EP+ 1×, quindi espellere il chip del sensore di manutenzione e inserire il chip SA (chip CM5 rivestito dalla proteina streptavidina del passaggio 1). Riaprire il metodo di immobilizzazione, inserire il rack dei reagenti 2 e controllare le posizioni, quindi eseguire il metodo per il tempo di esecuzione stimato.
5. Ripetere il passaggio 1.6.

3. Scouting della rigenerazione per PD-1 e PD-L1

1. Impostare il metodo di ricerca della rigenerazione: aprire/nuovo modello di procedura guidata , scegliere la ricerca della rigenerazione, impostare il percorso del flusso: 2-1, 4-3, tipo di chip su SA, controllare il ciclo di condizionamento dell'esecuzione, registrare la soluzione come HBS-EP+, tempo di contatto come 30 s, numero di iniezioni come 3, soluzione come PD-L1, tempo di contatto: 30 s, portata: 30 μL/min.
   1. Per i parametri di rigenerazione, la portata è di 30 μL/min e il periodo di stabilizzazione è di 300 s. Nel disegno sperimentale, impostare il numero di condizioni su 4 e il numero di cicli per ciascuna condizione su 2. Impostare le condizioni su 4, soluzione rigenerante: glicina 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, tempi di contatto: 30 s, quindi controllare l'adescamento prima dell'esecuzione.
2. Impostare ciascuna concentrazione di PD-L1 come posizione separata del pozzetto del campione in un layout di micropiastra a 96 pozzetti: da R1 A1 a R1 A9: 1 μM PD-L1; da R1 A10 a R1 A12: tampone HBS-EP+; R1 B1: Glicina 1,5; R1 B2: Glicina 2; R1 B3: Glicina 2,5; R1 B4: Glicina 3.
   NOTA: Come tampone di rigenerazione viene utilizzato un tampone di glicina con pH diverso.
3. Preparare la soluzione di PD-L1: aggiungere 200 μL di acqua priva di DNasi a 100 μg di proteina Fc Tag umana PD-L1 (9,42 μM), quindi diluire a 1 μM in tampone HBS-EP+.
4. Collocare tutti i reagenti pertinenti nel layout come descritto al punto 3.2. Posizionare la provetta A nel tampone HBS-EP+ da 1×, quindi sostituire il chip del sensore di manutenzione con il chip SA. Riaprire il metodo di ricerca della rigenerazione , seguire la posizione della provetta dal passaggio 3.2, inserire il rack dei reagenti, quindi eseguire il metodo per il tempo di esecuzione stimato.
5. Ripetere il passaggio 1.6.

4. Validazione dell'interazione PD-1/PD-L1

NOTA: Per la convalida, è stato seguito un rapporto¹⁸ pubblicato in precedenza con piccoli aggiustamenti.

1. Utilizzare gli stessi parametri del report pubblicato in Impostazioni generali, Fasi del saggio e Tipi di ciclo, impostare il tempo di contatto su 60 s, il tempo di dissociazione su 60 s e la velocità di flusso su 30 μL/min. In Variabili di metodo, Variabili di valutazione e Comandi, utilizzare la stessa impostazione, ad eccezione dell'utilizzo di Glicina 2.0 come Rigenerazione, impostare la velocità di flusso a 30 μL/min, passare attraverso il percorso del flusso di 1, 2, 3, 4.
   1. Quindi imposta la corsa e scegli il percorso del flusso: 2-1, 4-3. Input PD-L1 con concentrazioni da 0 μM, 0,037 μM, 0,111 μM, 0,333 μM e un peso molecolare di 51.300 Da. Controllare tutte le fasi del test per la verifica e selezionare il primo prima della corsa.
   2. Quindi impostare ciascuna concentrazione di PD-L1 come posizione separata del pozzetto del campione in un layout del rack reagenti 2: R2 B1: PD-L1 0 μM; R2 B2: PD-L1 0,037 μM; R2 B3: PD-L1 0,111 μM; R2 B4: PD-L1 0,333 μM; R2 A1: Glicina 2.0 come tampone di rigenerazione; R2 A2: HBS-EP+ come buffer di avvio.
2. Preparare 200 mL di soluzione tampone 1× HBS-EP+. Preparare le concentrazioni di PD-L1: diluire la proteina PD-L1 a 9,42 μM a 0,333 μM, 0,111 μM e 0,037 μM in HBS-EP+. Posizionare quindi tutti i reagenti pertinenti nel layout come descritto al punto 4.1.2.
   1. Inserire la provetta A nella soluzione tampone di corsa HBS-EP+ da 1×, espellere il chip del sensore di manutenzione e inserire il chip SA. Riaprire il metodo di ricerca della rigenerazione , seguire il posizionamento della provetta dal passaggio 4.1, inserire il rack dei reagenti 2 ed eseguire il metodo per la durata stimata.
3. Ripetere il passaggio 1.6.

5. Saggio di blocco PD-1/PD-L1 con inibitore di piccole molecole: BMS-1166

NOTA: Per il test del blocco, è stato seguito un rapporto¹⁸ precedentemente pubblicato con piccoli aggiustamenti.

1. Utilizzare gli stessi parametri del report pubblicato in Impostazioni generali, Fasi del saggio e Tipi di ciclo, impostare il tempo di contatto su 60 s, il tempo di dissociazione su 60 s e la velocità di flusso su 30 μL/min. Anche le variabili di metodo, le variabili di valutazione e i comandi utilizzano la stessa impostazione, ad eccezione dell'utilizzo di glicina 2.0 come rigenerazione, impostando la velocità di flusso a 30 μL/min, passando attraverso il percorso del flusso di 1, 2, 3, 4.
   1. Quindi imposta la corsa e scegli il percorso del flusso: 2-1, 4-3. Inserire la soluzione del campione: PD-L1 (0,111 μM, peso molecolare di 51.300 Da) con BMS-1166 a 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM, 3,125 μM. Controllare tutte le fasi del test per la verifica e selezionare il primo prima della corsa.
   2. Quindi impostare ciascuna concentrazione di PD-L1 come posizione separata del pozzetto del campione in un layout del rack reagenti 2: R2 B1: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM; R2 B3: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,625 μM; R2 B4: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM; R2 A1: Glicina 2.0 per la rigenerazione.
2. Preparare 200 mL di soluzione tampone 1× HBS-EP+. Preparare la miscela BMS-1166/PD-L1: Sciogliere 5 mg di BMS-1166 in 77,99 μL di dimetilsolfossido (DMSO) per preparare una soluzione madre da 100 mM. Diluire la soluzione madre con la proteina PD-L1 (0,11 μM) alle concentrazioni target di BMS-1166 a 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM e 3,125 μM in HBS-EP+. Posizionare tutti i reagenti pertinenti come descritto al punto 5.1.2.
   1. Posizionare la provetta A nella soluzione tampone di corsa HBS-EP+ da 1×, quindi espellere il chip del sensore di manutenzione e inserire il chip SA. Riaprire il metodo di ricerca della rigenerazione , seguire la posizione della provetta dal punto 5.1 e inserire il rack dei reagenti 2, quindi eseguire il metodo per il tempo di esecuzione stimato.
3. Ripetere il passaggio 1.6.

Risultati

Immobilizzazione di SA su chip CM5
I dati sono stati analizzati tramite l'output dello strumento SPR e del software di analisi associato, indicando il raggiungimento dell'UR target (2000 UR) della proteina SA sulla cella di flusso 1 e sulla cella di flusso 2. Le celle di flusso 1 e 2 sono state immobilizzate con SA (40 μg/mL) sulla superficie del chip CM5 con una risposta finale di 1902,3 RU sulla cella di flusso 1 (Figura 1A) e...

Discussione

Negli ultimi decenni, vari approcci immunoterapici, tra cui vaccini antitumorali, inibitori del checkpoint immunitario e terapie con cellule T CAR, hanno fatto progredire significativamente il trattamento del cancro²¹. I checkpoint immunitari svolgono un ruolo cruciale nella prevenzione del danno collaterale mediato dalle cellule immunitarie durante le risposte patogene e nella soppressione dell'autoimmunità. Un esempio chiave è l'interazione tra PD-L1 e PD-1, c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mM NaOH	Cytiva Life Sciences	100358
50 mM NaOH	Fisher Scientific	905376
96-Well Polystyrene Microplates	Cytiva Life Sciences	BR100503
Amine Coupling Kit	Cytiva Life Sciences	35120
Biacore T200 SPR System and Evaluation Software 3.2	Cytiva Life Sciences	28975001
Biotinylated Human PD-1 Fc, Avitag Protein	Acro Biosystems	PD1-H82F1
BMS1166	MedChemExpress	HY-102011
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855
DNase Free Water	Fisher Scientific	188506
Glycine 1.5	Cytiva Life Sciences	BR100354
Glycine 2.0	Cytiva Life Sciences	BR100355
Glycine 2.5	Cytiva Life Sciences	BR100356
Glycine 3.0	Cytiva Life Sciences	BR100357
HBS-EP+ Buffer	Cytiva Life Sciences	BR100669
Human PD-L1 Fc Tag Protein	Acro Biosystems	PD-1-H5258
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Microplate Foil, 96-Well	Cytiva Life Sciences	28975816
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
Plastic Vials 7 mm	Cytiva Life Sciences	BR100212
Rubber Caps, Type 3	Cytiva Life Sciences	BR100502
Series S Sensor Chip CM5	Cytiva Life Sciences	29149603
Sodium Acetate 4.5	Cytiva Life Sciences	100350
Sodium Acetate 5.0	Cytiva Life Sciences	100351
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762