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Method Article
Questo protocollo descrive un test di blocco per inibitori di PD-1/PD-L1 utilizzando la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie. Impiega una strategia di immobilizzazione in due fasi e un sistema tampone su misura per misurare con precisione le unità di risposta, facilitando la valutazione dei tassi di blocco per composti o farmaci biologici. Inoltre, supporta l'identificazione ad alto rendimento degli inibitori PD-1/PD-L1.
L'interruzione dell'interazione PD-1/PD-L1 è una strategia promettente per l'immunoterapia del cancro. Piattaforme di screening affidabili sono essenziali per valutare l'efficacia degli inibitori di PD-1/PD-L1. Un test di blocco PD-1/PD-L1 umano precedentemente stabilito che utilizza la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) (piattaforma di screening SPR inibitore PD-1/PD-L1 di prima generazione) ha dimostrato risultati paragonabili a quelli ottenuti attraverso la fluorescenza omogenea risolta nel tempo (HTRF) e i saggi basati su cellule, con un potenziale per lo screening su larga scala. In questo articolo, viene presentata una versione ottimizzata di questo test (piattaforma di screening SPR con inibitore PD-1/PD-L1 di seconda generazione), caratterizzata da un processo di accoppiamento a doppia fase che combina l'accoppiamento di ammina e bio-streptavidina per migliorare il controllo dell'orientamento PD-1 sul chip e ridurre il consumo di proteina PD-1. La piattaforma aggiornata è stata convalidata con successo utilizzando l'inibitore PD-1/PD-L1 BMS-1166, mostrando effetti di blocco paragonabili al precedente metodo basato su SPR e ad altre tecniche consolidate come l'ELISA. Questi risultati confermano l'affidabilità dell'approccio. Questa piattaforma ottimizzata per lo screening SPR offre uno strumento affidabile e ad alto rendimento per identificare nuovi inibitori di PD-1/PD-L1, far progredire la ricerca sull'immunoterapia del cancro ed evidenziare il potenziale di SPR nello screening degli inibitori del checkpoint immunitario.
Le terapie di blocco dei checkpoint immunitari, in particolare quelle mirate alla morte cellulare programmata-1 (PD-1) e al ligando 1 della morte cellulare programmata (PD-L1), sono all'avanguardia nelle strategie di immunoterapia del cancro. Le terapie anti-PD-1/PD-L1 hanno ricevuto l'approvazione per l'uso in vari tipi di cancro, come i tumori ematologici, cutanei, polmonari, epatici, della vescica urinaria e renali1. PD-1 è una glicoproteina transmembrana appartenente alla superfamiglia delle immunoglobuline, caratterizzata da un singolo dominio immunoglobulina variabile (IgV) al N-terminale, un gambo di circa 20 amminoacidi che separa il dominio IgV dalla membrana plasmatica, un dominio transmembrana e una coda citoplasmatica contenente motivi di segnalazione a base di tirosina2. PD-L1, identificata come uno dei ligandi per PD-1, è una proteina transmembrana di tipo I caratterizzata da una regione transmembrana, due domini extracellulari - costante delle immunoglobuline (IgC) e IgV - e un dominio citoplasmatico relativamente corto che innesca le vie di segnalazione intracellulare3. La via inibitoria PD-1/PD-L1 funge da checkpoint immunitario critico che regola l'attivazione delle cellule T e l'autoimmunità4. PD-1 è espresso sulle cellule T, dove interagisce con PD-L1, inibisce la segnalazione del recettore delle cellule T e blocca la stimolazione delle molecole CD28 e CD80 sulle cellule presentanti l'antigene e sulle cellule T5. I tessuti tumorali sfruttano questo meccanismo fisiologico sovraesprimendo PD-L1 durante la fase di fuga, creando così un ambiente immunosoppressivo che promuove la crescita e la progressione del tumore6. Gli inibitori di PD-1 e PD-L1 interrompono questa interazione, consentendo al sistema immunitario di eludere la soppressione indotta dal tumore e di riavviare il processo di morte delle cellule tumorali mediato dalle cellule T7.
Basandosi sul ruolo di primo piano delle terapie di blocco dei checkpoint immunitari, lo sviluppo degli inibitori PD-1/PD-L1 ha segnato un progresso significativo nell'immunoterapia del cancro. La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato nove inibitori del checkpoint immunitario che mirano specificamente alla via PD-1/PD-L1. Questi includono sei inibitori PD-1 - pembrolizumab, dostarlimab, nivolumab, cemiplimab, oripalimab e tislelizumab - e tre inibitori PD-L1 - atezolizumab, avelumab e durvalumab 8,9. Queste terapie sono state efficacemente utilizzate per trattare una varietà di tumori, come il melanoma, il cancro ai polmoni, il cancro uroteliale, il cancro cervicale, il cancro gastrico o gastroesofageo e altri tumori solidi10. Nonostante la loro efficacia, le terapie a base di anticorpi monoclonali devono affrontare limitazioni significative, tra cui bassi tassi di risposta, costi elevati, emivite prolungate, gravi eventi avversi immuno-correlati e restrizioni alla somministrazione endovenosa o sottocutanea 11,12,13. Di conseguenza, la ricerca è sempre più focalizzata sullo sviluppo di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio l'asse PD-1/PD-L1. Queste piccole molecole offrono vantaggi distinti, come una migliore penetrazione cellulare, la modulazione di diversi bersagli biologici, una maggiore biodisponibilità orale e costi ridotti, con l'obiettivo di ottenere risultati terapeutici comparabili con meno effetti avversi14. Tuttavia, lo sviluppo di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio l'interazione PD-1/PD-L1 è nelle sue fasi iniziali, principalmente a causa della mancanza di una piattaforma di screening affidabile ad alto rendimento. Tali piattaforme sono essenziali per valutare rapidamente vaste librerie di piccole molecole e identificare composti guida per un'ulteriore convalida e ottimizzazione. Superare questa sfida è fondamentale per far progredire l'immunoterapia del cancro.
La tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è ampiamente impiegata nel rilevamento di varie biomolecole, tra cui antigeni anticorpali, enzimi, acidi nucleici e farmaci, ed è particolarmente efficace nello screening di farmaci di piccole molecole15,16. A differenza di altre tecniche biofisiche, SPR offre un rilevamento senza marcatura, dati cinetici in tempo reale e un ampio intervallo di rilevamento. Al contrario, la calorimetria a titolazione isotermica non dispone di informazioni cinetiche in tempo reale e richiede volumi di campione maggiori, limitando la produttività. La termoforesi su microscala è soggetta a interferenze tampone e non è in grado di fornire dati cinetici, mentre l'interferometria a biostrati presenta limitazioni specifiche per l'applicazione in base alle dimensioni e alle proprietà molecolari. La fluorescenza omogenea risolta nel tempo richiede la marcatura ed è suscettibile alle interferenze fluorescenti. Riconosciamo che l'HTRF è un'altra tecnologia adatta per esplorare gli inibitori di PD-1/PD-L1. Una limitazione intrinseca dell'HTRF, rispetto all'SPR, è l'estinzione della fluorescenza causata da interazioni esterne con il processo di eccitazione intramolecolare (ad esempio, trasferimento di elettroni, FRET e sbiancamento), la sensibilità è troppo bassa nel processo di screening dei farmaci a causa del piccolo intervallo di finestre e l'interferenza di composti di librerie fluorescenti o proteine biologiche17. Queste caratteristiche posizionano l'SPR come uno strumento superiore per la scoperta di farmaci. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che l'SPR è in grado di determinare l'effetto di blocco di piccole molecole contro PD-1/PD-L1, il che è vantaggioso rispetto ad altre tecniche che richiedono elevati requisiti di tecnologia di etichettatura, passaggi multipli, scarsa specificità e costi elevati nel processo di scoperta di farmaci18.
Questo studio introduce una piattaforma ottimizzata basata su SPR, che integra un processo di accoppiamento a doppia fase che utilizza sia l'accoppiamento amminico che quello bio-streptavidina per migliorare l'orientamento di PD-1 sul chip e ridurre al minimo l'uso di proteine. Questo approccio aggiornato è stato convalidato con successo utilizzando l'inibitore PD-1/PD-L1 BMS-1166 come legante di controllo positivo, dimostrando effetti di blocco paragonabili sia al nostro precedente metodo SPR che ad altre tecniche consolidate come ELISA19,20. Questo non solo conferma l'affidabilità e la riproducibilità del nostro protocollo, ma illustra anche l'efficacia della nostra piattaforma modificata nel facilitare lo screening ad alto rendimento degli inibitori PD-1/PD-L1. L'incorporazione della fase di cattura della bio-streptavidina fornisce un orientamento della proteina diretto al sito piuttosto che casuale, consentendo una ridotta concentrazione di PD-1 (40 μg/mL rispetto a 10 μg/mL) e risparmi sui costi consentendo all'utente finale di immobilizzare la streptavidina (SA) su un chip CM5, un'alternativa meno costosa ai chip SA pre-immobilizzati commercializzati. Ciò lo rende vantaggioso per screening su larga scala ed economici di librerie di composti/peptidi. Sebbene ulteriori metodi di caratterizzazione, tra cui saggi in silico, in vitro e in vivo, siano essenziali per valutare il potenziale clinico degli inibitori di PD-1/PD-L1 contro il cancro, la nostra piattaforma di screening avanzata basata su SPR si distingue come uno strumento efficiente per lo screening su larga scala degli inibitori di PD-1/PD-L1.
I reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Immobilizzazione della proteina streptavidina (SA) sul chip CM5
2. Immobilizzazione della proteina PD-1 sul chip SA
3. Scouting della rigenerazione per PD-1 e PD-L1
4. Validazione dell'interazione PD-1/PD-L1
NOTA: Per la convalida, è stato seguito un rapporto18 pubblicato in precedenza con piccoli aggiustamenti.
5. Saggio di blocco PD-1/PD-L1 con inibitore di piccole molecole: BMS-1166
NOTA: Per il test del blocco, è stato seguito un rapporto18 precedentemente pubblicato con piccoli aggiustamenti.
Immobilizzazione di SA su chip CM5
I dati sono stati analizzati tramite l'output dello strumento SPR e del software di analisi associato, indicando il raggiungimento dell'UR target (2000 UR) della proteina SA sulla cella di flusso 1 e sulla cella di flusso 2. Le celle di flusso 1 e 2 sono state immobilizzate con SA (40 μg/mL) sulla superficie del chip CM5 con una risposta finale di 1902,3 RU sulla cella di flusso 1 (Figura 1A) e...
Negli ultimi decenni, vari approcci immunoterapici, tra cui vaccini antitumorali, inibitori del checkpoint immunitario e terapie con cellule T CAR, hanno fatto progredire significativamente il trattamento del cancro21. I checkpoint immunitari svolgono un ruolo cruciale nella prevenzione del danno collaterale mediato dalle cellule immunitarie durante le risposte patogene e nella soppressione dell'autoimmunità. Un esempio chiave è l'interazione tra PD-L1 e PD-1, c...
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori riconoscono la struttura principale RI-INBRE presso l'Università del Rhode Island, supportata da Grant P20GM103430 del National Center for Research Resources (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH). Questa ricerca è stata supportata da un Pilot Grant Award dal College of Pharmacy dell'Università del Rhode Island, da un Small Grant Award dal Rhode Island Life Science Hub (RILSH) e da una borsa di studio della Rhode Island Foundation, tutti assegnati a Chang Liu, Ph.D.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mM NaOH | Cytiva Life Sciences | 100358 | |
50 mM NaOH | Fisher Scientific | 905376 | |
96-Well Polystyrene Microplates | Cytiva Life Sciences | BR100503 | |
Amine Coupling Kit | Cytiva Life Sciences | 35120 | |
Biacore T200 SPR System and Evaluation Software 3.2 | Cytiva Life Sciences | 28975001 | |
Biotinylated Human PD-1 Fc, Avitag Protein | Acro Biosystems | PD1-H82F1 | |
BMS1166 | MedChemExpress | HY-102011 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNase Free Water | Fisher Scientific | 188506 | |
Glycine 1.5 | Cytiva Life Sciences | BR100354 | |
Glycine 2.0 | Cytiva Life Sciences | BR100355 | |
Glycine 2.5 | Cytiva Life Sciences | BR100356 | |
Glycine 3.0 | Cytiva Life Sciences | BR100357 | |
HBS-EP+ Buffer | Cytiva Life Sciences | BR100669 | |
Human PD-L1 Fc Tag Protein | Acro Biosystems | PD-1-H5258 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
Microplate Foil, 96-Well | Cytiva Life Sciences | 28975816 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Plastic Vials 7 mm | Cytiva Life Sciences | BR100212 | |
Rubber Caps, Type 3 | Cytiva Life Sciences | BR100502 | |
Series S Sensor Chip CM5 | Cytiva Life Sciences | 29149603 | |
Sodium Acetate 4.5 | Cytiva Life Sciences | 100350 | |
Sodium Acetate 5.0 | Cytiva Life Sciences | 100351 | |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 |
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