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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit un test de blocage des inhibiteurs de-1/-L1 à l’aide de la technologie de résonance plasmonique de surface. Il utilise une stratégie d’immobilisation en deux étapes et un système tampon adapté pour mesurer avec précision les unités d’intervention, facilitant ainsi l’évaluation des taux de blocage des composés ou des produits biologiques. De plus, il prend en charge l’identification à haut débit des inhibiteurs de-1/-L1.

Résumé

La perturbation de l’interaction-1/-L1 est une stratégie prometteuse pour l’immunothérapie du cancer. Des plateformes de dépistage fiables sont essentielles pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs de-1/-L1. Un test de blocage-1/-L1 humain précédemment établi utilisant la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) (plateforme de criblage SPR d’inhibiteurs de-1/-L1 de première génération) a démontré des résultats comparables à ceux obtenus par des tests de fluorescence homogène résolue dans le temps (HTRF) et des tests cellulaires, avec un potentiel de criblage à grande échelle. Dans cet article, une version optimisée de ce test (plateforme de criblage SPR d’inhibiteurs de-1/-L1 de deuxième génération) est présentée, avec un processus de couplage en deux étapes qui combine le couplage d’amines et de bio-streptavidines pour améliorer le contrôle de l’orientation de-1 sur la puce et réduire la consommation de protéines-1. La plateforme mise à jour a été validée avec succès à l’aide de l’inhibiteur de-1/-L1 BMS-1166, montrant des effets de blocage comparables à la méthode précédente basée sur la SPR et à d’autres techniques établies telles que ELISA. Ces résultats confirment la fiabilité de l’approche. Cette plateforme de dépistage SPR optimisée offre un outil fiable et à haut débit pour identifier de nouveaux inhibiteurs de-1/-L1, faire progresser la recherche sur l’immunothérapie du cancer et mettre en évidence le potentiel de la SPR dans le dépistage des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire.

Introduction

Les thérapies par blocage des points de contrôle immunitaires, en particulier celles ciblant la mort cellulaire programmée-1 (-1) et la mort cellulaire programmée-ligand 1 (-L1), sont à l’avant-garde des stratégies d’immunothérapie du cancer. Les thérapies anti--1/-L1 ont reçu l’approbation pour une utilisation dans divers types de cancer, telsque les cancers hématologiques, cutanés, pulmonaires, hépatiques, de la vessie et du rein1. -1 est une glycoprotéine transmembranaire appartenant à la superfamille des immunoglobulines, caractérisée par un seul domaine de type variable immunoglobuline (IgV) au niveau N-terminal, une tige d’environ 20 acides aminés séparant le domaine IgV de la membrane plasmique, un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique contenant des motifs de signalisation basés sur la tyrosine2. -L1, identifiée comme l’un des ligands de-1, est une protéine transmembranaire de type I caractérisée par une région transmembranaire, deux domaines extracellulaires - la constante d’immunoglobuline (IgC) et l’IgV - et un domaine cytoplasmique relativement court qui déclenche les voies de signalisation intracellulaires3. La voie inhibitrice-1/-L1 sert de point de contrôle immunitaire critique qui régule l’activation des lymphocytes T et l’auto-immunité4. -1 est exprimé sur les lymphocytes T, où il interagit avec-L1, inhibe la signalisation des récepteurs des lymphocytes T et bloque la stimulation des molécules CD28 et CD80 sur les cellules présentatrices d’antigène et les lymphocytes T5. Les tissus cancéreux exploitent ce mécanisme physiologique en surexprimant-L1 pendant la phase d’échappement, créant ainsi un environnement immunosuppresseur qui favorise la croissance etla progression tumorale6. Les inhibiteurs de-1 et de-L1 perturbent cette interaction, permettant au système immunitaire d’échapper à la suppression induite par la tumeur et de relancer le processus de mort des cellules tumorales médié par les lymphocytes T7.

S’appuyant sur le rôle prépondérant des thérapies de blocage des points de contrôle immunitaires, le développement d’inhibiteurs de-1/-L1 a marqué une avancée significative dans l’immunothérapie du cancer. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé neuf inhibiteurs de point de contrôle immunitaire qui ciblent spécifiquement la voie-1/-L1. Il s’agit notamment de six inhibiteurs de-1 - pembrolizumab, dostarlimab, nivolumab, cemiplimab, oripalimab et tislelizumab - et de trois inhibiteurs de-L1 - atezolizumab, avelumab et durvalumab 8,9. Ces thérapies ont été efficacement utilisées pour traiter une variété de cancers, tels que le mélanome, le cancer du poumon, le cancer urothélial, le cancer du col de l’utérus, le cancer gastrique ou gastro-œsophagien et d’autres tumeurs solides10. Malgré leur efficacité, les traitements à base d’anticorps monoclonaux se heurtent à d’importantes limites, notamment de faibles taux de réponse, des coûts élevés, des demi-vies prolongées, des effets indésirables graves liés au système immunitaire et des restrictions à l’administration intraveineuse ou sous-cutanée 11,12,13. Par conséquent, la recherche se concentre de plus en plus sur le développement de petites molécules inhibitrices ciblant l’axe-1/-L1. Ces petites molécules offrent des avantages distincts, tels qu’une meilleure pénétration cellulaire, la modulation de diverses cibles biologiques, une biodisponibilité orale accrue et des coûts réduits, dans le but d’obtenir des résultats thérapeutiques comparables avec moins d’effets indésirables14. Cependant, le développement d’inhibiteurs de petites molécules ciblant l’interaction-1/-L1 n’en est qu’à ses débuts, principalement en raison de l’absence d’une plateforme de criblage fiable à haut débit. De telles plateformes sont essentielles pour évaluer rapidement de vastes bibliothèques de petites molécules et identifier les principaux composés en vue d’une validation et d’une optimisation plus poussées. Il est essentiel de surmonter ce défi pour faire progresser l’immunothérapie du cancer.

La technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) est largement utilisée dans la détection de diverses biomolécules, y compris les antigènes d’anticorps, les enzymes, les acides nucléiques et les médicaments, et est particulièrement efficace dans le criblage de petites molécules15,16. Contrairement à d’autres techniques biophysiques, la SPR offre une détection sans marquage, des données cinétiques en temps réel et une large plage de détection. En revanche, la titration calorimétrie isotherme manque d’informations cinétiques en temps réel et nécessite des volumes d’échantillons plus importants, ce qui limite le débit. La thermophorèse à l’échelle microscopique est sujette aux interférences de tampon et ne peut pas fournir de données cinétiques, tandis que l’interférométrie de biocouche présente des limites spécifiques à l’application en fonction de la taille et des propriétés moléculaires. La fluorescence homogène résolue dans le temps nécessite un marquage et est sensible aux interférences fluorescentes. Nous reconnaissons que le HTRF est une autre technologie appropriée pour explorer les inhibiteurs de-1/-L1. L’une des limites inhérentes à la HTRF, par rapport à la SPR, est l’extinction de la fluorescence causée par des interactions externes avec le processus d’excitation intramoléculaire (par exemple, le transfert d’électrons, le FRET et le blanchiment), la sensibilité est trop faible dans le processus de criblage de médicaments en raison de la petite plage fenêtre et de l’interférence des composés de la bibliothèque fluorescente ou des protéines biologiques17. Ces caractéristiques positionnent la SPR comme un outil supérieur pour la découverte de médicaments. Nos études précédentes ont démontré que la SPR est capable de déterminer l’effet de blocage de petites molécules contre-1/-L1, ce qui est avantageux par rapport à d’autres techniques qui nécessitent des exigences élevées en matière de technologie de marquage, plusieurs étapes, une faible spécificité et un coût élevé dans le processus de découverte de médicaments18.

Cette étude présente une plate-forme optimisée basée sur la SPR, intégrant un processus de couplage en deux étapes qui utilise à la fois le couplage des amines et de la bio-streptavidine pour améliorer l’orientation de-1 sur la puce et minimiser l’utilisation de protéines. Cette approche mise à jour a été validée avec succès en utilisant l’inhibiteur de-1/-L1 BMS-1166 comme liant de contrôle positif, démontrant des effets de blocage comparables à la fois à notre méthode SPR précédente et à d’autres techniques établies telles que ELISA19,20. Cela confirme non seulement la fiabilité et la reproductibilité de notre protocole, mais illustre également l’efficacité de notre plateforme modifiée pour faciliter le criblage à haut débit des inhibiteurs de-1/-L1. L’incorporation de l’étape de capture de la bio-streptavidine permet une orientation protéique dirigée vers le site plutôt que de manière aléatoire, ce qui permet de réduire la concentration de-1 (40 μg/mL contre 10 μg/mL) et de réaliser des économies en permettant à l’utilisateur final d’immobiliser la streptavidine (SA) sur une puce CM5, une alternative moins coûteuse aux puces SA pré-immobilisées commercialisées. Cela le rend avantageux pour les criblages à grande échelle et rentables de banques de composés/peptides. Bien que des méthodes de caractérisation supplémentaires, y compris des essais in silico, in vitro et in vivo, soient essentielles pour évaluer le potentiel clinique des inhibiteurs de-1/-L1 contre le cancer, notre plateforme de dépistage améliorée basée sur la SPR se distingue comme un outil efficace pour le dépistage à grande échelle des inhibiteurs de-1/-L1.

Protocole

Les réactifs et l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Immobilisation de la protéine streptavidine (SA) sur la puce CM5

  1. Configurez la méthode d’immobilisation sur l’instrument SPR : Ouvrir/Nouveau modèle d’assistant , choisir l’immobilisation, définir le type de puce sur CM5 et les cellules de flux par cycle sur 1. Vérifiez la cellule d’immobilisation 1 et la cellule d’écoulement 2.
    1. Définissez Amine comme méthode d’immobilisation. Objectif fixé pour le niveau immobilisé, concentration en ligand : 40 μg/mL de streptavidine, niveau cible : 2000 RU, solution de lavage : 50 mM de NaOH. Ensuite, vérifiez prime avant de courir.
  2. Préparez les tubes suivants : R2 B1 et R2 C1 - 40 μg/mL de streptavidine ; R2 B2 et R2 C2 : 50 mM de NaOH ; R2 B3 et R2 C3 : EDC ; R2 B4 et R2 C4 : ENM ; R2 B5 et R2 C5 : Vide ; R2 B6 et R2 C6 : Éthanolamine.
    REMARQUE : EDC et NHS activent les groupes carboxyle sur la puce CM5, permettant le couplage covalent avec les amines sur le ligand. L’éthanolamine est utilisée comme tampon bloquant pour empêcher la liaison non spécifique lors de l’immobilisation.
  3. Diluer 20 mL de tampon HBS-EP+ 10× dans 180 mL d’eau désionisée (DI) pour préparer 200 mL de solution tampon 1× de courant HBS-EP+.
  4. Ajouter 1 mL d’eau exempte de DNase à 1 mg de streptavidine et incuber à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, diluez la solution de streptavidine à 40 μg/mL dans un tampon d’acétate (pH 4,5). Préparez les réactifs du kit de réactifs Amine Coupling conformément aux instructions du fabricant et placez toutes les dispositions pertinentes des réactifs comme indiqué à l’étape 1.2.
  5. Remplacez la puce du capteur de maintenance par la puce CM5, puis placez le tube A dans le tampon HBS-EP+ 1× préparé, rouvrez la méthode d’immobilisation et insérez les tubes conformément à la disposition de l’étape 1.2. Exécutez la méthode et enregistrez le fichier de résultats.
  6. Maintenance post-course : remplacez la puce CM5 par la puce du capteur de maintenance, placez le tube A dans une bouteille remplie d’eau déminéralisée et exécutez l’amorçage. Après avoir retiré la puce CM5, lavez-la avec quelques gouttes d’eau DI et séchez-la à l’air. Placez la puce dans un tube de 50 ml à 4 °C.
    REMARQUE : Le SA immobilisé permet à la puce CM5 de fonctionner comme une puce SA.

2. Immobilisation de la protéine-1 sur la puce SA

  1. Définissez la méthode d’immobilisation sur l’instrument SPR : Ouvrir/Nouveau modèle d’assistant , choisissez l’immobilisation, définissez le type de puce sur SA et les cellules de flux par cycle sur 1. Vérifiez les cellules d’immobilisation 1 et 2.
    1. Définissez la capture de la biotine SA comme méthode. Pour l’ensemble de la cellule 1, l’immobilisation à blanc, pour l’ensemble de la cellule 2, visez le niveau immobilisé, 10 μg/mL de-1 comme ligand, niveau cible : 4000 RU, puis vérifiez l’amorce avant de courir.
      REMARQUE : Préparez les tubes suivants - R2 B1 et R2 C1 : 1 M de NaCl, 50 mM de NaOH ; R2 B2 et R2 C2 : 50 % d’isopropanol/50 mM de NaOH/1 M de NaCl ; R2 C3 : 10 μg/mL de-1.
  2. Dissoudre 58,44 mg de NaCl dans 1 mL de 50 mM de NaOH pour préparer 1 M de NaCl et 50 mM de solution de NaOH. Dissoudre 58,44 mg de NaCl et 4,0 mg de NaOH dans de l’eau de 500 μL, puis ajouter 500 μL d’isopropanol pour préparer la solution d’isopropanol à 50 % d’isopropanol/50 mM de NaOH/1 M de NaCl.
  3. Préparez la solution de-1 : Ajoutez 200 μL d’eau exempte de DNase à 100 μg de-1 humain biotinylé (Fc et Avitagged) et stabilisez à température ambiante pendant 30 min, puis diluez à 10 μg/mL dans un tampon d’acétate (pH 5,0).
  4. Placez toutes les dispositions de réactifs comme décrit à l’étape 2.1. Placez le tube A dans la solution de tampon de fonctionnement HBS-EP+ 1×, puis éjectez la puce du capteur de maintenance et insérez la puce SA (puce CM5 recouverte de protéine streptavidine de l’étape 1). Rouvrez la méthode d’immobilisation, insérez le rack de réactifs 2 et vérifiez les positions, puis exécutez la méthode pendant la durée d’exécution estimée.
  5. Répétez l’étape 1.6.

3. Recherche de régénération pour-1 et-L1

  1. Configurez la méthode de dépistage de régénération : Ouvrir/Nouveau modèle d’assistant , choisissez Filtrage de régénération, définir le chemin d’écoulement : 2-1, 4-3, le type de puce sur SA, vérifier le cycle de conditionnement, enregistrer la solution en tant que HBS-EP+, le temps de contact en 30 s, le nombre d’injections en tant que 3, la solution en tant que -L1, temps de contact : 30 s, débit : 30 μL/min.
    1. Pour les paramètres de régénération, le débit est de 30 μL/min et la période de stabilisation est de 300 s. Dans le plan expérimental, définissez le nombre de conditions sur 4 et le nombre de cycles pour chaque condition sur 2. Réglez les conditions sur 4, solution de régénération : Glycine 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, temps de contact : 30 s, puis vérifiez l’amorçage avant de courir.
  2. Définir chaque concentration de-L1 comme position de puits d’échantillon distincte dans une disposition de microplaque à 96 puits : R1 A1 à R1 A9 : 1 μM-L1 ; R1 A10 à R1 A12 : tampon HBS-EP+ ; R1 B1 : Glycine 1,5 ; R1 B2 : Glycine 2 ; R1 B3 : Glycine 2,5 ; R1 B4 : Glycine 3.
    REMARQUE : Un tampon glycine avec un pH différent est utilisé comme tampon de régénération.
  3. Préparez la solution de-L1 : Ajoutez 200 μL d’eau exempte de DNase à 100 μg de protéine humaine-L1 Fc Tag (9,42 μM), puis diluez à 1 μM dans un tampon HBS-EP+.
  4. Placez tous les réactifs pertinents dans la disposition décrite à l’étape 3.2. Placez le tube A dans la mémoire tampon HBS-EP+ de 1×, puis remplacez la puce du capteur de maintenance par la puce SA. Rouvrez la méthode de reconnaissance de régénération , suivez la position du tube à l’étape 3.2, insérez le rack de réactifs, puis exécutez la méthode pendant la durée d’exécution estimée.
  5. Répétez l’étape 1.6.

4. Validation de l’interaction-1/-L1

REMARQUE : Aux fins de validation, un rapport18 publié précédemment a été suivi de modifications mineures.

  1. Utilisez les mêmes paramètres que le rapport publié sous Paramètres généraux, Étapes de dosage et Types de cycles, réglez le temps de contact sur 60 s, le temps de dissociation sur 60 s et le débit sur 30 μL/min. Sous les variables de méthode, les variables d’évaluation et les commandes, utilisez le même réglage, sauf pour l’utilisation de Glycine 2.0 comme Régénération, réglez le débit à 30 μL/min, passe par le chemin d’écoulement de 1, 2, 3, 4.
    1. Configurez ensuite exécuter et choisissez le chemin d’écoulement : 2-1, 4-3. Entrez-L1 avec des concentrations de 0 μM, 0,037 μM, 0,111 μM, 0,333 μM et une masse moléculaire de 51 300 Da. Vérifiez toutes les étapes de test pour vérification et sélectionnez Prime avant l’exécution.
    2. Réglez ensuite chaque concentration de-L1 en tant que position de puits d’échantillon distincte dans une disposition de rack de réactifs 2 : R2 B1 :-L1 0 μM ; R2 B2 :-L1 0,037 μM ; R2 B3 :-L1 0,111 μM ; R2 B4 :-L1 0,333 μM ; R2 A1 : Glycine 2.0 comme tampon de régénération ; R2 A2 : HBS-EP+ comme tampon de démarrage.
  2. Préparez 200 ml de solution tampon courante HBS-EP+ 1×. Préparer les concentrations de-L1 : diluer la protéine-L1 à 9,42 μM à 0,333 μM, 0,111 μM et 0,037 μM dans HBS-EP+. Placez ensuite tous les réactifs pertinents dans la disposition comme décrit à l’étape 4.1.2.
    1. Insérez le tube A dans la solution tampon de fonctionnement HBS-EP+ 1×, éjectez la puce du capteur de maintenance et insérez la puce SA. Rouvrez la méthode de dépistage de régénération , suivez le positionnement du tube de l’étape 4.1, insérez le rack de réactifs 2 et exécutez la méthode pendant la durée estimée.
  3. Répétez l’étape 1.6.

5. Test de blocage de-1/-L1 avec inhibiteur de petites molécules : BMS-1166

REMARQUE : Pour l’essai de blocus, un rapport18 publié précédemment a été suivi de quelques ajustements mineurs.

  1. Utilisez les mêmes paramètres que le rapport publié sous Paramètres généraux, Étapes de dosage et Types de cycles, réglez le temps de contact sur 60 s, le temps de dissociation sur 60 s et le débit sur 30 μL/min. Sous les variables de méthode, les variables d’évaluation et les commandes utilisent également le même réglage, à l’exception de l’utilisation de Glycine 2.0 comme régénération, règle le débit à 30 μL/min, passe par le chemin d’écoulement de 1, 2, 3, 4.
    1. Configurez ensuite exécuter et choisissez le chemin d’écoulement : 2-1, 4-3. Entrez la solution d’échantillon :-L1 (0,111 μM, poids moléculaire de 51 300 Da) avec BMS-1166 à 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM, 3,125 μM. Vérifiez toutes les étapes de test pour la vérification et sélectionnez l’amorce avant l’analyse.
    2. Réglez ensuite chaque concentration de-L1 comme position de puits d’échantillon distincte dans une disposition de rack de réactifs 2 : R2 B1 :-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2 :-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM ; R2 B3 :-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,625 μM ; R2 B4 :-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM ; R2 A1 : Glycine 2.0 pour la régénération.
  2. Préparez 200 ml de solution tampon courante HBS-EP+ 1×. Préparez le mélange BMS-1166/-L1 : Dissoudre 5 mg de BMS-1166 dans 77,99 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de 100 mM. Diluer la solution mère avec la protéine-L1 (0,11 μM) aux concentrations cibles de BMS-1166 à 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM et 3,125 μM dans HBS-EP+. Placez toutes les dispositions de réactifs appropriées comme décrit à l’étape 5.1.2.
    1. Placez le tube A dans la solution tampon de fonctionnement HBS-EP+ 1×, puis éjectez la puce du capteur de maintenance et insérez la puce SA. Rouvrez la méthode de dépistage de régénération , suivez la position du tube à partir de la position 5.1 et, insérez le rack de réactifs 2, puis exécutez la méthode pendant la durée d’exécution estimée.
  3. Répétez l’étape 1.6.

Résultats

Immobilisation de SA sur puce CM5
Les données ont été analysées à l’aide des résultats de l’instrument SPR et du logiciel d’analyse associé, indiquant l’atteinte réussie de l’EF cible (2000 EF) de la protéine SA sur les cellules d’écoulement 1 et 2. Les cellules d’écoulement 1 et 2 ont été immobilisées avec de l’AS (40 μg/mL) à la surface de la puce CM5 avec une réponse finale de 1902,3 RU sur la cellule d’écoulement 1 (

Discussion

Au cours des dernières décennies, diverses approches d’immunothérapie, notamment les vaccins contre le cancer, les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires et les thérapies à base de cellules CAR-T, ont considérablement fait progresser le traitement du cancer21. Les points de contrôle immunitaires jouent un rôle crucial dans la prévention des dommages collatéraux médiés par les cellules immunitaires lors des réponses pathogènes et dans la su...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs saluent la plateforme RI-INBRE de l’Université de Rhode Island, soutenue par des P20GM103430 de subvention du National Center for Research Resources (NCRR), une composante des National Institutes of Health (NIH). Cette recherche a été soutenue par une subvention pilote du College of Pharmacy de l’Université de Rhode Island, une subvention de petite taille du Rhode Island Life Science Hub (RILSH) et une subvention de la Fondation du Rhode Island, toutes attribuées à Chang Liu, Ph.D.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mM NaOHCytiva Life Sciences100358
50 mM NaOHFisher Scientific905376
96-Well Polystyrene MicroplatesCytiva Life SciencesBR100503
Amine Coupling KitCytiva Life Sciences35120
Biacore T200 SPR System and Evaluation Software 3.2Cytiva Life Sciences28975001
Biotinylated Human PD-1 Fc, Avitag ProteinAcro BiosystemsPD1-H82F1
BMS1166MedChemExpressHY-102011
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855
DNase Free WaterFisher Scientific188506
Glycine 1.5Cytiva Life SciencesBR100354
Glycine 2.0Cytiva Life SciencesBR100355
Glycine 2.5Cytiva Life SciencesBR100356
Glycine 3.0Cytiva Life SciencesBR100357
HBS-EP+ BufferCytiva Life SciencesBR100669
Human PD-L1 Fc Tag ProteinAcro BiosystemsPD-1-H5258
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Microplate Foil, 96-Well Cytiva Life Sciences28975816
NaClSigma-Aldrich746398
Plastic Vials 7 mmCytiva Life SciencesBR100212
Rubber Caps, Type 3Cytiva Life SciencesBR100502
Series S Sensor Chip CM5Cytiva Life Sciences29149603
Sodium Acetate 4.5Cytiva Life Sciences100350
Sodium Acetate 5.0Cytiva Life Sciences100351
StreptavidinSigma-AldrichS4762

Références

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