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Method Article
Ce protocole décrit un test de blocage des inhibiteurs de-1/-L1 à l’aide de la technologie de résonance plasmonique de surface. Il utilise une stratégie d’immobilisation en deux étapes et un système tampon adapté pour mesurer avec précision les unités d’intervention, facilitant ainsi l’évaluation des taux de blocage des composés ou des produits biologiques. De plus, il prend en charge l’identification à haut débit des inhibiteurs de-1/-L1.
La perturbation de l’interaction-1/-L1 est une stratégie prometteuse pour l’immunothérapie du cancer. Des plateformes de dépistage fiables sont essentielles pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs de-1/-L1. Un test de blocage-1/-L1 humain précédemment établi utilisant la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) (plateforme de criblage SPR d’inhibiteurs de-1/-L1 de première génération) a démontré des résultats comparables à ceux obtenus par des tests de fluorescence homogène résolue dans le temps (HTRF) et des tests cellulaires, avec un potentiel de criblage à grande échelle. Dans cet article, une version optimisée de ce test (plateforme de criblage SPR d’inhibiteurs de-1/-L1 de deuxième génération) est présentée, avec un processus de couplage en deux étapes qui combine le couplage d’amines et de bio-streptavidines pour améliorer le contrôle de l’orientation de-1 sur la puce et réduire la consommation de protéines-1. La plateforme mise à jour a été validée avec succès à l’aide de l’inhibiteur de-1/-L1 BMS-1166, montrant des effets de blocage comparables à la méthode précédente basée sur la SPR et à d’autres techniques établies telles que ELISA. Ces résultats confirment la fiabilité de l’approche. Cette plateforme de dépistage SPR optimisée offre un outil fiable et à haut débit pour identifier de nouveaux inhibiteurs de-1/-L1, faire progresser la recherche sur l’immunothérapie du cancer et mettre en évidence le potentiel de la SPR dans le dépistage des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire.
Les thérapies par blocage des points de contrôle immunitaires, en particulier celles ciblant la mort cellulaire programmée-1 (-1) et la mort cellulaire programmée-ligand 1 (-L1), sont à l’avant-garde des stratégies d’immunothérapie du cancer. Les thérapies anti--1/-L1 ont reçu l’approbation pour une utilisation dans divers types de cancer, telsque les cancers hématologiques, cutanés, pulmonaires, hépatiques, de la vessie et du rein1. -1 est une glycoprotéine transmembranaire appartenant à la superfamille des immunoglobulines, caractérisée par un seul domaine de type variable immunoglobuline (IgV) au niveau N-terminal, une tige d’environ 20 acides aminés séparant le domaine IgV de la membrane plasmique, un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique contenant des motifs de signalisation basés sur la tyrosine2. -L1, identifiée comme l’un des ligands de-1, est une protéine transmembranaire de type I caractérisée par une région transmembranaire, deux domaines extracellulaires - la constante d’immunoglobuline (IgC) et l’IgV - et un domaine cytoplasmique relativement court qui déclenche les voies de signalisation intracellulaires3. La voie inhibitrice-1/-L1 sert de point de contrôle immunitaire critique qui régule l’activation des lymphocytes T et l’auto-immunité4. -1 est exprimé sur les lymphocytes T, où il interagit avec-L1, inhibe la signalisation des récepteurs des lymphocytes T et bloque la stimulation des molécules CD28 et CD80 sur les cellules présentatrices d’antigène et les lymphocytes T5. Les tissus cancéreux exploitent ce mécanisme physiologique en surexprimant-L1 pendant la phase d’échappement, créant ainsi un environnement immunosuppresseur qui favorise la croissance etla progression tumorale6. Les inhibiteurs de-1 et de-L1 perturbent cette interaction, permettant au système immunitaire d’échapper à la suppression induite par la tumeur et de relancer le processus de mort des cellules tumorales médié par les lymphocytes T7.
S’appuyant sur le rôle prépondérant des thérapies de blocage des points de contrôle immunitaires, le développement d’inhibiteurs de-1/-L1 a marqué une avancée significative dans l’immunothérapie du cancer. La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé neuf inhibiteurs de point de contrôle immunitaire qui ciblent spécifiquement la voie-1/-L1. Il s’agit notamment de six inhibiteurs de-1 - pembrolizumab, dostarlimab, nivolumab, cemiplimab, oripalimab et tislelizumab - et de trois inhibiteurs de-L1 - atezolizumab, avelumab et durvalumab 8,9. Ces thérapies ont été efficacement utilisées pour traiter une variété de cancers, tels que le mélanome, le cancer du poumon, le cancer urothélial, le cancer du col de l’utérus, le cancer gastrique ou gastro-œsophagien et d’autres tumeurs solides10. Malgré leur efficacité, les traitements à base d’anticorps monoclonaux se heurtent à d’importantes limites, notamment de faibles taux de réponse, des coûts élevés, des demi-vies prolongées, des effets indésirables graves liés au système immunitaire et des restrictions à l’administration intraveineuse ou sous-cutanée 11,12,13. Par conséquent, la recherche se concentre de plus en plus sur le développement de petites molécules inhibitrices ciblant l’axe-1/-L1. Ces petites molécules offrent des avantages distincts, tels qu’une meilleure pénétration cellulaire, la modulation de diverses cibles biologiques, une biodisponibilité orale accrue et des coûts réduits, dans le but d’obtenir des résultats thérapeutiques comparables avec moins d’effets indésirables14. Cependant, le développement d’inhibiteurs de petites molécules ciblant l’interaction-1/-L1 n’en est qu’à ses débuts, principalement en raison de l’absence d’une plateforme de criblage fiable à haut débit. De telles plateformes sont essentielles pour évaluer rapidement de vastes bibliothèques de petites molécules et identifier les principaux composés en vue d’une validation et d’une optimisation plus poussées. Il est essentiel de surmonter ce défi pour faire progresser l’immunothérapie du cancer.
La technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) est largement utilisée dans la détection de diverses biomolécules, y compris les antigènes d’anticorps, les enzymes, les acides nucléiques et les médicaments, et est particulièrement efficace dans le criblage de petites molécules15,16. Contrairement à d’autres techniques biophysiques, la SPR offre une détection sans marquage, des données cinétiques en temps réel et une large plage de détection. En revanche, la titration calorimétrie isotherme manque d’informations cinétiques en temps réel et nécessite des volumes d’échantillons plus importants, ce qui limite le débit. La thermophorèse à l’échelle microscopique est sujette aux interférences de tampon et ne peut pas fournir de données cinétiques, tandis que l’interférométrie de biocouche présente des limites spécifiques à l’application en fonction de la taille et des propriétés moléculaires. La fluorescence homogène résolue dans le temps nécessite un marquage et est sensible aux interférences fluorescentes. Nous reconnaissons que le HTRF est une autre technologie appropriée pour explorer les inhibiteurs de-1/-L1. L’une des limites inhérentes à la HTRF, par rapport à la SPR, est l’extinction de la fluorescence causée par des interactions externes avec le processus d’excitation intramoléculaire (par exemple, le transfert d’électrons, le FRET et le blanchiment), la sensibilité est trop faible dans le processus de criblage de médicaments en raison de la petite plage fenêtre et de l’interférence des composés de la bibliothèque fluorescente ou des protéines biologiques17. Ces caractéristiques positionnent la SPR comme un outil supérieur pour la découverte de médicaments. Nos études précédentes ont démontré que la SPR est capable de déterminer l’effet de blocage de petites molécules contre-1/-L1, ce qui est avantageux par rapport à d’autres techniques qui nécessitent des exigences élevées en matière de technologie de marquage, plusieurs étapes, une faible spécificité et un coût élevé dans le processus de découverte de médicaments18.
Cette étude présente une plate-forme optimisée basée sur la SPR, intégrant un processus de couplage en deux étapes qui utilise à la fois le couplage des amines et de la bio-streptavidine pour améliorer l’orientation de-1 sur la puce et minimiser l’utilisation de protéines. Cette approche mise à jour a été validée avec succès en utilisant l’inhibiteur de-1/-L1 BMS-1166 comme liant de contrôle positif, démontrant des effets de blocage comparables à la fois à notre méthode SPR précédente et à d’autres techniques établies telles que ELISA19,20. Cela confirme non seulement la fiabilité et la reproductibilité de notre protocole, mais illustre également l’efficacité de notre plateforme modifiée pour faciliter le criblage à haut débit des inhibiteurs de-1/-L1. L’incorporation de l’étape de capture de la bio-streptavidine permet une orientation protéique dirigée vers le site plutôt que de manière aléatoire, ce qui permet de réduire la concentration de-1 (40 μg/mL contre 10 μg/mL) et de réaliser des économies en permettant à l’utilisateur final d’immobiliser la streptavidine (SA) sur une puce CM5, une alternative moins coûteuse aux puces SA pré-immobilisées commercialisées. Cela le rend avantageux pour les criblages à grande échelle et rentables de banques de composés/peptides. Bien que des méthodes de caractérisation supplémentaires, y compris des essais in silico, in vitro et in vivo, soient essentielles pour évaluer le potentiel clinique des inhibiteurs de-1/-L1 contre le cancer, notre plateforme de dépistage améliorée basée sur la SPR se distingue comme un outil efficace pour le dépistage à grande échelle des inhibiteurs de-1/-L1.
Les réactifs et l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Immobilisation de la protéine streptavidine (SA) sur la puce CM5
2. Immobilisation de la protéine-1 sur la puce SA
3. Recherche de régénération pour-1 et-L1
4. Validation de l’interaction-1/-L1
REMARQUE : Aux fins de validation, un rapport18 publié précédemment a été suivi de modifications mineures.
5. Test de blocage de-1/-L1 avec inhibiteur de petites molécules : BMS-1166
REMARQUE : Pour l’essai de blocus, un rapport18 publié précédemment a été suivi de quelques ajustements mineurs.
Immobilisation de SA sur puce CM5
Les données ont été analysées à l’aide des résultats de l’instrument SPR et du logiciel d’analyse associé, indiquant l’atteinte réussie de l’EF cible (2000 EF) de la protéine SA sur les cellules d’écoulement 1 et 2. Les cellules d’écoulement 1 et 2 ont été immobilisées avec de l’AS (40 μg/mL) à la surface de la puce CM5 avec une réponse finale de 1902,3 RU sur la cellule d’écoulement 1 (
Au cours des dernières décennies, diverses approches d’immunothérapie, notamment les vaccins contre le cancer, les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires et les thérapies à base de cellules CAR-T, ont considérablement fait progresser le traitement du cancer21. Les points de contrôle immunitaires jouent un rôle crucial dans la prévention des dommages collatéraux médiés par les cellules immunitaires lors des réponses pathogènes et dans la su...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Les auteurs saluent la plateforme RI-INBRE de l’Université de Rhode Island, soutenue par des P20GM103430 de subvention du National Center for Research Resources (NCRR), une composante des National Institutes of Health (NIH). Cette recherche a été soutenue par une subvention pilote du College of Pharmacy de l’Université de Rhode Island, une subvention de petite taille du Rhode Island Life Science Hub (RILSH) et une subvention de la Fondation du Rhode Island, toutes attribuées à Chang Liu, Ph.D.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mM NaOH | Cytiva Life Sciences | 100358 | |
50 mM NaOH | Fisher Scientific | 905376 | |
96-Well Polystyrene Microplates | Cytiva Life Sciences | BR100503 | |
Amine Coupling Kit | Cytiva Life Sciences | 35120 | |
Biacore T200 SPR System and Evaluation Software 3.2 | Cytiva Life Sciences | 28975001 | |
Biotinylated Human PD-1 Fc, Avitag Protein | Acro Biosystems | PD1-H82F1 | |
BMS1166 | MedChemExpress | HY-102011 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNase Free Water | Fisher Scientific | 188506 | |
Glycine 1.5 | Cytiva Life Sciences | BR100354 | |
Glycine 2.0 | Cytiva Life Sciences | BR100355 | |
Glycine 2.5 | Cytiva Life Sciences | BR100356 | |
Glycine 3.0 | Cytiva Life Sciences | BR100357 | |
HBS-EP+ Buffer | Cytiva Life Sciences | BR100669 | |
Human PD-L1 Fc Tag Protein | Acro Biosystems | PD-1-H5258 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
Microplate Foil, 96-Well | Cytiva Life Sciences | 28975816 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Plastic Vials 7 mm | Cytiva Life Sciences | BR100212 | |
Rubber Caps, Type 3 | Cytiva Life Sciences | BR100502 | |
Series S Sensor Chip CM5 | Cytiva Life Sciences | 29149603 | |
Sodium Acetate 4.5 | Cytiva Life Sciences | 100350 | |
Sodium Acetate 5.0 | Cytiva Life Sciences | 100351 | |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 |
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