מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

Summary

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 3 מתוך 3.

Abstract

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם.

Protocol

פיצול hESCs מ Matrigel כדי Matrigel

בדרך כלל צלחת 6-ומחוברות היטב hESCs על Matrigel ניתן לפצל 1:03-01:05 עוד צלחת Matrigel, עם בארות להפוך ומחוברות שוב 4-5 ימים לאחר פיצול.

1. CM וצלחות Matrigel מוכנים כמתואר לעיל לפני הפיצול.
2. ביום של פיצול, לשטוף היטב עבור כל פיצול עם 1 × PBS, pH7.4, להוסיף 1ml של 1mg/ml Dispase (לדלל פתרון מניות 5mg/ml עם DMEM/F12 התקשורת) זה טוב, דגירה על 37 ° C במשך 3 דקות.
3. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם 1 × PBS, pH7.4, להוסיף 1ml של ES התקשורת ללא bFGF, השתמש מגרד תא לגרד את מושבות בתחתית הבאר, לאסוף את hESCs מושעה בצינור בז 50 מ"ל, ו גלולה ידי צנטריפוגה 200 גרם ב 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. כדי בצלחת מחדש hESCs על צלחות Matrigel, תחילה לשטוף את הצלחות Matrigel עם DMEM/F12 ולהוסיף 2.5ml של CM בתוספת 10ng/ml bFGF לכל טוב. Resuspend hESC גלולה בהיקף מתאים של CM בתוספת 10ng/ml bFGF, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה שלוש פעמים. (הערה: כאשר hESCs עבור פיצול באים צלחות Matrigel, גושים קל מאוד לשבור, ולכן שלושה סיבובים של pipetting מספיק ועוד pipetting עלול לשבש את יתר המושבות ולהפוך תאים בודדים). Aliquot 0.5 מ"ל של השעיה hESC גושים לכל גם הצלחת Matrigel 6-היטב כדי להשיג 3ml לכל גם נפח סופי. מניחים את צלחת 37 ° C חממה.

זיהוי סמנים pluripotency ידי מיקרוסקופית immunofluorescence

מיקרוסקופיה immunofluorescence משמש כדי לבחון את הביטוי של סמנים hESC pluripotency אוקטובר-4-4 ו SSEA במהלך culturing.

1. לשאוב מדיה מאחד לשטוף היטב עם 1 × PBS, pH 7.4. הוסף 2ml של פורמלדהיד 3.7% ל גם לתקן עבור 10 דקות.
2. לשטוף עם 1xPBS, pH 7.4, להוסיף מתנול 2ml אל הבאר מקום -20 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
3. לשטוף עם 1xPBS, pH 7.4, ולחסום עם 1ml של serume שור 0.2% אלבומין (BSA) עבור 5 דקות.
4. הוסף 1ml של נוגדן אוקטובר-4 או anti-h/mSSEA-4 (1:200 דילול ב -0.2% BSA), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה. (הערה: עבור מכתים SSEA-4, לעבור ישירות לשלב 6)
5. לשטוף שלוש פעמים עם 1xPBS, pH 7.4, להוסיף FITC-מצומדות ארנב IgG (1:500 דילול ב -0.2% BSA), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
6. לשטוף 3 פעמים עם 1xPBS, pH 7.4, ולשים ירידה של פתרון הרכבה (יכול להכיל DAPI אם להדמיה גרעינית הרצוי) במרכז היטב. שים coverslip על גבי התאים, חותם עם לק, ולהעריך על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.

אדם בתאי גזע עובריים קבלות

ES התקשורת (תא גזע עובריים התקשורת):

DMEM/F12 - 400ml
נוק סרום תחליף - 100 מ"ל
שאינם חיוניים חומצות אמינו - 5 מ"ל
200mm GlutaMax / BME פתרון - 5 מ"ל
פניצילין / סטרפטומיצין - 5 מ"ל

מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה hESC בבקבוקים 500ml ב 4 ° C. טוב לכל היותר שבועיים.

MEF התרבות מדיה:

DMEM - 1000ml
FBS - 100 מ"ל
שאינם חיוניים חומצות אמינו - 10 מ"ל
גלוטמין - 10 מ"ל
Penicllin / סטרפטומיצין - 10 מ"ל

מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה MEF ב 4 ° C.

הפתרון 200mm Glutamax / BME:

Glutamax - 100 מ"ל
β-mercaptoethanol (פתרון במלאי ב 14.3M) - 140 μ1
מערבבים היטב שני פתרונות ואז 10ml מנות aliquot. שמור aliquots ב -20 ° C.
bFGF פתרון (הריכוז הסופי של המניה: 10 מיקרוגרם / מ"ל):
bFGF (FGF2) - 50 מיקרוגרם
0.1% ב BSA 1xPBS, pH 7.4 - 5 מ"ל

ממיסים 50 מיקרוגרם bFGF ב BSA 0.1% 5 מ"ל לעשות המניה 10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot לתוך μl 500 חלקים. חנות ב -80 ° C.

Collagenase IV פתרון (1mg/ml):

Collagenase IV - 50 מ"ג
DMEM/F12 מדיה - 50 מ"ל

מוסיפים את אבקת IV collagenase לצינור בז 50 מ"ל. ב למכסה המנוע, לערבב 50 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת סטרילית. הפתרון וורטקס דקות 1 <. כדי לוודא את אבקת מתמוסס. ב למכסה המנוע, לעבור 0.22 מיקרומטר לסנן לתוך צינור חדש סטרילי בז 50 מ"ל. פתרון זה הוא טוב לכל היותר 2 שבועות מאוחסנים 4 ° C.

Dispase פתרון (1mg/ml):

Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 מדיה - 8ml

Dispase מסחרי Aliquot 5mg/ml פתרון ולאחסן ב -20 ° C. מדולל dispase כדי 1mg/ml באמצעות DMEM/F12. פתרון זה יכולים להישמר במשך שבוע 1 ב 4 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זו סדרה של 3 סרטונים מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תאים מזין (וידאו 1), כיצד מעבר להם Matrigel תא ללא מזין צלחות (וידאו 2), וכיצד לשמור על hESCs ידי passaging במזין Matrigel תא ללא תנאים (וידאו 3). מחקרים קודמים הראו כי רבים ותחזוקה של, hESCs קיימא מובחן דו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152