С MEFs к Матригель 3: пассажи из ЭСК Матригель на Матригель

Резюме

В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована. Часть 3 из 3.

Аннотация

В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована.

протокол

Разделение ЭСК из Матригель к Матригель

Обычно сливной 6-луночный планшет из ЭСК на Матригель можно разделить 1:3 до 1:5 до другого Матригель табличка со скважин становится вырожденным снова через 4-5 дней после расщепления.

1. CM и Матригель пластин приготовленного, как описано выше, до расщепления.
2. В день расщепления, мыть каждую лунку для расщепления с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл 1mg/ml Dispase (разбавленный 5mg/ml маточного раствора с DMEM/F12 средств массовой информации) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° C в течение 3 мин.
3. Промыть каждую лунку три раза с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл ES СМИ без bFGF, с помощью мобильного скребок, чтобы очистить колонии со дна колодца, собирать приостановлено ЭСК в 50 мл трубки сокола, и гранул путем центрифугирования на 200 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Для повторного пластины ЭСК на пластинах Матригель, первой стирки Матригель пластин с DMEM/F12 и добавить 2,5 мл СМ дополнена 10ng/ml bFGF на лунку. Ресуспендируют чЭСК пеллет в соответствующий объем СМ дополнена 10ng/ml bFGF, пипетка клеточной суспензии вверх и вниз три раза. (ПРИМЕЧАНИЕ: При ЭСК для расщепления происходят из Матригель пластин, сгустки очень легко сломать, поэтому три раунда пипетирования достаточно и больше пипетки может чрезмерно нарушить колоний и сделать отдельные клетки.) Алиготе 0,5 мл чЭСК сгустки суспензии в а из 6-луночный планшет Матригель для достижения 3 мл на лунку, как конечного объема. Место пластины в 37 ° С инкубатор.

Обнаружение маркеров плюрипотентности помощью иммунофлуоресценции микроскопии

Иммунофлуоресценции микроскопии для изучения экспрессии маркеров плюрипотентности чЭСК Oct-4 и SSEA-4 во время культивирования.

1. Аспирируйте средств массовой информации из одной ямы и промыть 1 х PBS, рН 7,4. Добавить 2 мл 3,7% формальдегид и зафиксировать в течение 10 мин.
2. Промыть 1xPBS, рН 7,4, добавляют 2 мл метанола к колодцу и место при температуре -20 ° С в течение 2 мин.
3. Промыть 1xPBS, рН 7,4, а блок с 1 мл 0,2% бычьего serume альбумина (БСА) в течение 5 мин.
4. Добавить 1 мл Oct-4 или anti-h/mSSEA-4 антител (1:200 разведения в 0,2% BSA), и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч или при температуре 4 ° С в течение ночи. (ПРИМЕЧАНИЕ: для SSEA-4 окрашивания, перейти к пункту 6)
5. Промыть трижды 1xPBS, рН 7,4, добавляют FITC-сопряженных кролика IgG (1:500 разведения в 0,2% BSA), и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
6. Промыть 3 раза 1xPBS, рН 7,4, и поместить каплю решение для монтажа (может содержать DAPI если ядерная визуализация желанию) в центре хорошо. Положите покровное на вершине клетки, печать с лаком для ногтей, а также оценить с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.

Человека эмбриональных стволовых клеток поступлений

ES СМИ (средств массовой информации эмбриональных стволовых клеток):

DMEM/F12 - 400 мл
Нокаут сыворотки Replacer - 100мл
Номера для незаменимых аминокислот - 5 мл
200 мМ GlutaMax / BME раствор - 5 мл
Пенициллин / стрептомицин - 5 мл

Хорошо перемешайте и храните окончательный медиа-культуры чЭСК в 500 мл бутылки при температуре 4 ° C. Хорошо для не более двух недель.

MEF Культура СМИ:

DMEM - 1000 мл
FBS - 100 мл
Номера для незаменимых аминокислот - 10 мл
Глютамин - 10мл
Penicllin / стрептомицин - 10 мл

Хорошо перемешайте и храните окончательный медиа-культуры MEF при 4 ° C.

200 мМ Glutamax / BME Решение:

Glutamax - 100мл
β-меркаптоэтанол (Stock решение в 14.3M) - 140 μ1
Смешайте два решения хорошо, а затем часть аликвоту 10 мл. Держите аликвоты при -20 ° C.
bFGF Решение (конечная концентрация складе: 10 мкг / мл):
bFGF (FGF2) - 50 мкг
0,1% BSA в 1xPBS, рН 7,4 - 5 мл

Растворите 50 мкг bFGF в 5 мл 0,1% БСА, чтобы сделать 10 мкг / мл состава. Алиготе в 500 мкл порции. Хранить при температуре -80 ° C.

Коллагеназы IV Решение (1mg/ml):

Коллагеназы IV - 50 мг
DMEM/F12 СМИ - 50 мл

Добавить порошок коллагеназы IV в 50 мл трубки сокола. В капот, смешать в 50 мл стерильного DMEM/F12 СМИ. Vortex решение для <1 мин. чтобы убедиться, что порошок не растворится. В капот, проходят через 0,22 мкм фильтр в новые стерильные 50 мл трубки сокола. Это решение хорошо для не более 2 недель хранили при 4 ° C.

Dispase Решение (1mg/ml):

Dispase 5mg/ml - 2 мл
DMEM/F12 СМИ - 8 мл

Алиготе коммерческих Dispase 5mg/ml решение и хранить при температуре -20 ° C. Развести dispase к 1mg/ml использованием DMEM/F12. Это решение может храниться в течение 1 недели при температуре 4 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта серия 3 видео демонстрирует, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерных клеток (видео 1), как прохождение их Матригель подачи бесклеточной пластин (видео 2), и как поддерживать ЭСК путем пассажей в Матригель подачи бесклет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152