ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

Summary

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ה-DNA immunoprecipitation מפוגל (MeDIP). MeDIP היא הליך יומיים כי סלקטיבי תמציות שברי DNA מפוגל ממדגם הדנ"א הגנומי באמצעות נוגדנים עם ספציפיות עבור 5-methylcytosine (אנטי 5 MC).

Abstract

זיהוי תבניות מתילציה DNA היא הליך שכיח במחקר של אפיגנטיקה, כמו מתילציה ידוע כבעל השפעה משמעותית על ביטוי גנים, והיא מעורבת עם התפתחות המחלה נורמלית, כמו גם

Protocol

ה-DNA מיצוי הכנת המדגם

דנ"א ממגוון רחב של מדגמים שונים (תאים בתרבית, טרי קפוא, כמו גם פורמלין-קבוע רקמות פרפין מוטבע) יכול לשמש MeDIP. חשוב להשתמש DNA מטוהרים ללא חלבונים הקשורים כמו ההיסטונים. חשוב גם כדי להסיר RNA ככל האפשר מן המדגם, כפי שהוא יכול להפריע quantitation הן DNA ו מחייב נוגדנים. כמות ה-DNA המשמש MeDIP יכול לנוע בין 200 ל ng מיקרוגרם 1 בהתאם לכמות ה-DNA זמין. כדי להמחיש זאת בפרוטוקול, 1 מיקרוגרם של ה-DNA ישמשו. פרוטוקול הבאה תספק איכות גבוהה DNA גדילי כפול מתוך תאים בתרבית. פרוטוקולים אחרים צריכים להיות מועסקים להפקת דנ"א מסוגים מדגם אחר.

1. הוסף 400 μl של חיץ העיכול על גלולה תא צינור Eppendorf 1.7 מ"ל.
2. הוספת 100 מיקרוגרם של proteinase K כדי הצינור, דגירה לילה בשעה 50 ° C.
3. הוסף 500 μl פנול pH 7 ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
4. ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
6. חזור על שלבים 3 עד 5 פעם.
7. הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
8. ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
10. הוסף 40 מיקרוגרם של RNase A ו דגירה 1 שעות בשעה 37 ° C.
11. הוסף 500 μl פנול pH 7 ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
12. ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
13. הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
14. חזור על שלבים 11 עד 13 פעם.
15. הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
16. ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
17. הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
18. הוספת נפח 1/10th 3 נתרן אצטט M (40 μl) ומערבבים היטב.
19. הוסף 2 כרכים (900 μl) של אתנול 100%, לערבב היטב, מקום -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
20. ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
21. הסר אתנול, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורית.
22. הוסף 500 μl 70% אתנול קר לשטוף. ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
23. הסר אתנול 70%, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורי על ידי pipetting.
24. האוויר היבש גלולה עם מכסה פתוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל עקבות של אתנול שיורית.
25. Resuspend-DNA של μl 50 dH2O מעוקרים לילה בשעה 4 ° C.
26. לכמת את הדנ"א בעזרת ספקטרופוטומטר NanoDrop. _{260: 280} יחס של 1.8 הוא אידיאלי.
27. קביעת איכות דנ"א טווח גודל על ג'ל agarose עם סולם 100 נ"ב. משהו כמו 10 ננוגרם של הדנ"א הגנומי ניתן להריץ על 1.7% agarose ג'ל ואחריו מכתים באמצעות צבע כי הוא רגיש מאוד כמויות קטנות של דנ"א כגון זהב SYBR.
28. ב הגליל האחד siliconized לפי המדגם, להכין 1 מיקרוגרם של ה-DNA בהיקף כולל של 50 μl עם שאר נפח מורכב עם מעוקרים DH ₂ O.

ה-DNA SONICATION

Sonication דנ"א פרוטוקול MeDIP חייב להתבצע בתוך צינורות siliconzied למנוע מחייב ספציפית של חלבונים שאינם קירות צינור. פעמים sonication אופטימלית עבור דגימות DNA מבוססים על מידת הפיצול דגימת DNA כפי שנקבע מן אלקטרופורזה בג'ל (שלב 27). לדוגמה, ה-DNA המופק תאים בתרבית צריך להיות משקל מולקולרי גבוה מאוד, יהיה בהמשך דורשים sonication יותר DNA שנלקחו דגימות ארכיוני אשר לעתים מושפל חלקית. אם הדגימות של משקל מולקולרי גבוה באופן אחיד, סביר בשלב זה להמשיך עם sonication כמתואר בלי לבדוק כל דגימה בנפרד פרוטוקול זה. אם הדגימות מקוטעת כמו עם דגימות ארכיוני, יהיה צורך להתאים את ההליך sonication סביר ידי הפחתת פעמים sonication להשיג 300-100bp שברים. אם אתה מצפה לתהליך דגימות מפורקים חלקית, אופטימיזציה של הפרמטרים sonication יכול להתבצע על מדגם מייצג מאלה של עניין. בהתבסס על מידת הפיצול DNA שנצפה מן ג'ל אלקטרופורזה (שלב 27), הנסיין יכול לקבוע מראש את הזמן sonication אופטימלית למדגם. כאן אנו מתארים שיטה להשיג שברי 300-1000 bp-DNA על ידי sonication עם מכשיר sonicating אוטומטיות (Bioruptor מ Diagenode, UCD-200 TM) באמצעות משקל מולקולרי גבוה DNA.

1. מים Biorupter חייב להיות 4 ° C.
2. Sonicate במשך 7 דקות על הגדרות אוטומטי (30 שניות על 30 שניות ליד כוח מרבי).
3. הסרה של 800 ננוגרם (40 μl) של המוצר במקום sonicated וב siliconized צינור 1.7 מ"ל צנטריפוגות עבור immunoprecipitation (IP) תגובה.
4. מניחים בצד הנותרים 200 ננוגרם (10 μl) לשמש קלט (IN) DNA הפניה (חנות ב 4 ° C).

IMMUNOPRECIPITATON של ה-DNA מפוגל

1. לפגל את ה-DNA אשר ישמשו עבור התגובה IP (800 ננוגרם) בשעה 95 ° C במשך 10 דקות באמבט מים.
2. מצננים מיד על הקרח. בואו DNA מגניב לגמרי (כ 5 דקות על קרח) לפני שתמשיך לשלב הבא.
3. הוסף 5 נוגדנים חד שבטיים מיקרוגרם.
4. הוסף חוצץ ה-IP (משמש בטמפרטורת החדר במשך פרוטוקול זה) נפח סופי של μl 500.
5. דגירה עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס מסתובב מחזיק צינור.
6. רגע לפני שלב 5 תושלם, להכין Dynabeads ידי שטיפה (שלבים 6-11). ראשית, resuspend החרוזים ביסודיות על ידי בקבוקון vortexing.
7. העברת 30 μl (~ 2 x 10 ⁷⁾ Dynabeads resuspended לכל תגובה פלוס 1, לתוך צינור siliconized חדש (למשל, אם עושים 8 תגובות, להסיר חרוזים מספיק 9 μl, כלומר 270).
8. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
9. פיפטה את supernatant. בעת הסרת supernatant, אל תיגע חרוזים נגד בתוך הקיר (איפה החרוזים למשוך המגנט) עם קצה פיפטה.
10. הוצא את הצינור מתוך המגנט, ו resuspend החרוזים בנפח עודף של חיץ IP (750 μl-1000 μl). מניחים את הצינור בחזרה על המדף מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
11. חזור על לשטוף פעם נוספת, ולאחר מכן resuspend החרוזים שטף במאגר ה-IP בהיקף המקורי הוסר בשלב 7.
12. הוסף 30 μl של Dynabeads שטף התגובה לכל IP
13. דגירה של בעל צינור מסתובב עבור 2 שעות על 4 ° C.
14. לאחר דגירה הושלמה, במקום הצינור על מתלה מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
15. פיפטה את supernatant. הימנע מנגיעה הקיר הפנימי של הצינור (איפה החרוזים למשוך המגנט) עם קצה פיפטה. הוסף 500 μl של חוצץ ה-IP. מערבבים את תכולת שפופרת והחזיר אותו על מתלה מגנטי במשך 2 דקות. חזור על לשטוף עם חיץ 500 IP ul פעם אחת.
16. לאחר הסרת supernatant מן לשטוף האחרון, resuspend את החרוזים 400 μl של חיץ העיכול.
17. פנקו את התגובה עם 100 מיקרוגרם של proteinase K ו דגירה לילה בשעה 50 ° C.

טיהור DNA IMMUNOPRECIPITATED

1. הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ו מערבולת ביסודיות.
2. ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
4. חזור על שלבים 1 עד 3 אם שלבי הביניים בין שכבות מימית ואורגנית מופיע מעוננים.
5. מוסיפים 1 / 10 נפח ^ה 3 נתרן אצטט M (40 μl) ו מערבולת.
6. הוסף 1 μl של גליקוגן (20 מיקרוגרם / μl) ו מערבולת.
7. הוסף 2 כרכים (1000 μl) של אתנול 100%, וורטקס, ומקום בו -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
8. ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
9. הסר אתנול, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורית.
10. הוסף 500 μl 70% אתנול קר לשטוף. בקצרה וורטקס, ואת ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
11. הסר אתנול 70%, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורי על ידי pipetting.
12. האוויר היבש גלולה עם מכסה פתוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל עקבות של אתנול שיורית.
13. Resuspend DNA גלולה ב μl 10 מעוקרים DH ₂ 0.

אימות BY PCR

1. אתה יכול לבדוק על מנת להבטיח כי הליך MeDIP שלך עובד על ידי ביצוע פרוטוקול MeDIP באמצעות DNA אנושי רגיל (זכר או נקבה), ולאחר מכן assaying אזור ידוע להיות מועשר עבור מתילציה.
2. הסרה של 30% מהתוצר MeDIP אל צינור ה-PCR, ועוד 30% של המוצר MeDIP אל צינור אחר PCR.
3. שים 10 ng של IN-DNA לתוך צינור ה-PCR, ו - 10 ננוגרם של IN-DNA לתוך צינור אחר PCR. אתה צריך עכשיו יש ארבעה תגובות נפרדות PCR להגדיר.
4. בצע באמצעות PCR H19 ו CTRL primers כמפורט בטבלה 1.
5. להכין שתי mastermixes (אחד עבור כל קבוצה פריימר) לתגובות PCR עם נפח 12.5 הכולל μl כפי שמתואר בטבלה 2.
6. Thermocycle PCR באמצעות התנאים המפורטים בטבלה 3.
7. הפעלה 5 μl של מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose 2% עבור להדמיה.
8. התוצאות הצפויות MeDIP מוצלח מוצגים בלוח 4.

טבלאות

טבלה 1: H19 ו CTRL primers עבור אימות PCR.

פריימר הגדר	קדימה פריימר	הפוך פריימר	מוצר הצפוי גודל
H19	H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag	H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa	174 נ"ב
CTRL (שליטה)	CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa	CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt	139 נ"ב

טבלה 2. Mastermixes לתגובות PCR.

DDH ₂ O

	H19 מערבבים (לכל Rxn)	CTRL מערבבים (לכל Rxn)
6.875	6.875
10X הצפת	1.25	1.25
dNTP לערבב (10 mM כל אחת)	0.25	0.25
MgCl 2 (50 מ"מ)	0.25	0.25
Primers (H19_F / R או CTRL_F / R) (10 מיקרומטר כל F / R)	0.625	0.625
פלטינום תקי	0.25	0.25

לוח 3. PCR thermocyling תנאים.

	95 ° C	05:00
40X	95 ° C	00:30
	56 ° C	00:30
	72 ° C	00:15

טבלה 4. תוצאות צפויות PCR עבור MeDIP מוצלח.

	תבנית ה-DNA
פריימר משמש	IN	IP
H19	חיובי	חיובי
CTRL	חיובי	שלילי

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנה מודעות הולכת וגוברת של ה-DNA משחק תפקיד משמעותי מתילציה של המחלה, ולכן פיתוח של מבחני למדוד שינוי זה הם הופכים חשובים יותר ויותר ^{3, 12, 13.} הטכניקה MeDIP הוא כלי נוח להקרנה על הגנום כולו, הן לבין מוקד ספציפי ברמה ^{6, 7.} טכניקה זו מספקת תצוגה מהירה של מתילציה רמות ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biorupter sonicator	Tool	Diagenode	UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Other	Sorenson BioScience	11510
ND 3300 Spectrophotometer	Tool	NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb	Reagent	Calbiochem	162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Reagent	Invitrogen	112-01D
Magnetic Tube Rack	Tool	Invitrogen	CS15000
Mini LabRoller	Tool	Labnet International	H5500
IP Buffer				10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer				10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl