Immunoprecipitazione DNA metilato

Riepilogo

Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Abstract

L'identificazione di modelli di metilazione del DNA è una procedura comune nello studio dell'epigenetica, come metilazione è conosciuto per avere effetti significativi sulla espressione genica, ed è impegnato con il normale sviluppo così come la malattia

Protocollo

DNA ESTRAZIONE E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

DNA da una varietà di diversi campioni (cellule in coltura, fresco congelato così come i tessuti fissati in formalina paraffina) può essere utilizzato per MeDIP. E 'importante utilizzare il DNA altamente purificato, senza proteine ​​associate come gli istoni. E 'anche importante rimuovere l'RNA il più possibile dal campione, in quanto può interferire sia con la quantificazione del DNA e legame degli anticorpi. La quantità di DNA utilizzata per MeDIP può variare da 200 ng a 1 mg a seconda della quantità di DNA disponibile. Per dimostrare questo protocollo, 1 mg di DNA verrà utilizzato. Il seguente protocollo fornirà alta qualità DNA a doppia elica da cellule in coltura. Altri protocolli dovrebbero essere impiegati per l'estrazione del DNA altri tipi di campioni.

1. Aggiungere 400 ml di buffer di digestione di un pellet di cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf.
2. Aggiungere 100 mg di proteinasi K al tubo, e incubare una notte a 50 ° C.
3. Aggiungere 500 microlitri fenolo pH 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando.
4. Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta.
6. Ripetere i passaggi da 3 a 5 una volta.
7. Aggiungere 500 microlitri 01:01 pH fenolo / cloroformio 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando.
8. Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
9. Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta.
10. Aggiungere 40 mg di RNasi A e incubare 1 ora a 37 ° C.
11. Aggiungere 500 microlitri fenolo pH 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando.
12. Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
13. Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta.
14. Ripetere i passaggi da 11 a 13 una volta.
15. Aggiungere 500 microlitri 01:01 pH fenolo / cloroformio 7 e mescolare delicatamente, ma completamente, agitando.
16. Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
17. Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta.
18. Aggiunta del volume 1/10th 3 acetato di sodio M (40 mL) e mescolare bene.
19. Aggiungere 2 volumi (900 microlitri) del 100% di etanolo, mescolare bene, e posto a -20 ° C per 20 minuti.
20. Girano a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C.
21. Eliminare l'etanolo, rotazione del polso, ed eliminare l'etanolo residuo.
22. Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% da lavare. Girano a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C.
23. Rimuovere etanolo al 70%, rotazione del polso, ed eliminare l'etanolo residuo pipettando.
24. Aria secca il pellet con il tappo aperto per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere ogni traccia di etanolo residuo.
25. DNA Risospendere in 50 ml di dH2O sterilizzato notte a 4 ° C.
26. Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Un A _260: A ₂₈₀ rapporto di 1,8 è l'ideale.
27. Determinare la qualità e le dimensioni del DNA su un gel di agarosio con 100 bp scaletta. Meno di 10 ng di DNA genomico può essere eseguito su un 1,7% gel seguita dalla colorazione con un colorante che è molto sensibile a piccole quantità di DNA come oro SYBR.
28. In un tubo siliconato per campione, preparare 1 mg di DNA in un volume totale di 50 microlitri con il resto del volume composto sterilizzato con dH ₂ O.

DNA sonicazione

Sonicazione del DNA e il protocollo MeDIP deve essere effettuata in tubi siliconzied a prevenire le non legame specifico delle proteine ​​alle pareti del tubo. Tempi di sonicazione ottimale per i campioni di DNA sono in base al grado di frammentazione del DNA campione determinato da elettroforesi su gel (Punto 27). Per esempio, il DNA estratto dalle cellule in coltura dovrebbero essere di altissimo peso molecolare, e dovranno successivamente essere più sonicazione di DNA estratto da campioni di archivio che sono spesso parzialmente degradate. Se i campioni sono uniformemente alto peso molecolare, è ragionevole a questo punto per procedere con la sonicazione, come descritto in questo protocollo senza controllare ogni campione singolarmente. Se i campioni sono frammentati, come con i campioni d'archivio, sarà necessario adeguare la procedura di sonicazione probabilmente diminuendo i tempi sonicazione di ottenere 300-100bp frammenti. Se si prevede di trattare i campioni che sono parzialmente degradate, l'ottimizzazione dei parametri di sonicazione può essere eseguita su un campione rappresentativo di quelli di interesse. Sulla base del grado di frammentazione del DNA osservata da elettroforesi su gel (Step 27), lo sperimentatore può predeterminare il momento ottimale per sonicazione del campione. Qui si descrive un metodo per ottenere frammenti di DNA 300-1000 bp mediante ultrasuoni con un dispositivo automatico sonicating (Bioruptor da Diagenode, UCD-200 TM) con alto peso molecolare del DNA.

1. Acqua in Biorupter deve essere a 4 ° C.
2. Ultrasuoni per 7 minuti a impostazioni automatiche (30 sec a 30 sec fino alla potenza massima).
3. Rimuovere 800 ng (40 microlitri) di prodotto sonicato e mettere in provetta da centrifuga siliconato 1,7 ml per la immunoprecipitazione (IP) di reazione.
4. Mettere da parte restanti 200 ng (10 microlitri) per servire come input (IN) del DNA di riferimento (conservare a 4 ° C).

IMMUNOPRECIPITATON di DNA metilato

1. Denaturare il DNA che verrà utilizzato per la reazione IP (800 ng) a 95 ° C per 10 minuti in un bagno d'acqua.
2. Raffreddare immediatamente in ghiaccio. Lasciate raffreddare completamente il DNA (circa 5 minuti in ghiaccio) prima di procedere con il passo successivo.
3. Aggiungere 5 anticorpo monoclonale mcg.
4. Aggiungi tampone IP (usato a temperatura ambiente per tutto questo protocollo) per un volume finale di 500 microlitri.
5. Incubare per 2 ore a 4 ° C in rotazione titolare tubo.
6. Poco prima fase 5 è completa, preparare Dynabeads di lavaggio (Piazza di 6-11). In primo luogo, risospendere le sfere completamente nel flacone con il vortex.
7. Trasferire il 30 microlitri (~ 2 x 10 ⁷⁾ di Dynabeads risospeso per reazione più 1, in un nuovo tubo siliconato (per esempio, se facendo 8 reazioni, rimuovere numero sufficiente di sfere per 9, cioè 270 microlitri).
8. Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente.
9. Pipetta il sopranatante. Quando si rimuove il surnatante, evitare di toccare le perline contro parete interna (dove le perle attrarre verso il magnete) con la punta della pipetta.
10. Togliere la provetta dal magnete, e risospendere le sfere in un volume in eccesso di tampone IP (750 microlitri-1000 microlitri). Posizionare il tubo di nuovo sul sostegno magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente.
11. Ripetere il lavaggio una volta di più, e poi risospendere le sfere lavato in tampone IP nel volume originale rimossa al punto 7.
12. Aggiungere 30 ml di Dynabeads lavata per ogni reazione IP
13. Incubare in un tubo di supporto rotante per 2 ore a 4 ° C.
14. Dopo l'incubazione è completa, posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 2 minuti a temperatura ambiente.
15. Pipetta il sopranatante. Evitare di toccare la parete interna del tubo (dove le perle attrarre verso il magnete) con la punta della pipetta. Aggiungere 500 ml di tampone IP. Mescolare il contenuto della provetta e rimetterlo sul sostegno magnetico per 2 minuti. Ripetere il lavaggio con 500 IP Buffer ul una sola volta.
16. Dopo aver rimosso il sopranatante l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 400 ml di buffer di digestione.
17. Trattare la reazione con 100 mg di proteinasi K e incubare una notte a 50 ° C.

Purificazione del DNA immunoprecipitato

1. Aggiungere 500 microlitri 01:01 pH fenolo / cloroformio 7 e vortice accuratamente.
2. Girano a 13 000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere acquosa (in alto) frazione in una nuova provetta.
4. Ripetere i passaggi da 1 a 3 se l'interfase tra gli strati acquosi e organici aspetto torbido.
5. Aggiungere 1 / 10 ^° volume di 3 M di acetato di sodio (40 microlitri) e vortice.
6. Aggiungere 1 ml di glicogeno (20 mg / mL) e vortice.
7. Aggiungere 2 volumi (1000 ml) del 100% di etanolo, vortice, e posto a -20 ° C per 20 minuti.
8. Girano a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C.
9. Eliminare l'etanolo, rotazione del polso, ed eliminare l'etanolo residuo.
10. Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% da lavare. Vortex brevemente, e far girare a 13 000 g per 20 minuti a 4 ° C.
11. Rimuovere etanolo al 70%, rotazione del polso, ed eliminare l'etanolo residuo pipettando.
12. Aria secca il pellet con il tappo aperto per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere ogni traccia di etanolo residuo.
13. Risospendere DNA pellet in 10 microlitri sterilizzati dH ₂ 0.

Convalida da parte della PCR

1. Si può verificare per assicurarsi che la procedura sta funzionando MeDIP eseguendo il protocollo MeDIP utilizzando normale DNA umano (maschio o femmina), e successivamente analizzando una regione nota per essere arricchito per metilazione.
2. Rimuovere il 30% del prodotto MeDIP al tubo PCR, e un altro 30% del prodotto MeDIP ad un altro tubo di PCR.
3. Mettete 10 ng di IN DNA in un tubo di PCR, e 10 ng di IN DNA in un altro tubo PCR. Si dovrebbe ora avere quattro reazioni separate PCR da configurare.
4. Eseguire la PCR con H19 e CTRL primer come indicato nella Tabella 1.
5. Preparare due mastermixes (uno per ogni set di primer) per le reazioni di PCR con 12,5 microlitri di volume totale come indicato nella Tabella 2.
6. Thermocycle la PCR utilizzando le condizioni indicate nella Tabella 3.
7. Esegui 5 ml di prodotti di PCR su un gel di agarosio al 2% per la visualizzazione.
8. I risultati attesi per MeDIP successo sono riportati nella tabella 4.

Tabelle

Tabella 1: H19 e CTRL primer per la validazione della PCR.

Set di primer	Primer avanti	Primer reverse	Formato del prodotto atteso
H19	H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag	H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa	174 bp
CTRL (controllo)	CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa	CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt	139 bp

Tabella 2. Mastermixes per le reazioni PCR.

	H19 Mix (per RXN)	CTRL Mix (per RXN)
DDH 2 O	6,875	6,875
Buffer 10X	1,25	1,25
dNTP mix (10 mm ciascuno)	0,25	0,25
MgCl 2 (50 mM)	0,25	0,25
Primer (H19_F / R o CTRL_F / R) (10 mM ciascuno F / R)	0,625	0,625
Platinum Taq	0,25	0,25

Tabella 3. PCR thermocyling condizioni.

	95 ° C	05:00
40X	95 ° C	00:30
	56 ° C	00:30
	72 ° C	00:15

Tabella 4. Risultati attesi PCR per MeDIP successo.

	Modello di DNA
Primer utilizzati	IN	IP
H19	Positivo	Positivo
CTRL	Positivo	Negativo

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Discussione

Vi è una crescente consapevolezza della metilazione del DNA gioca significativo ruolo nella malattia, quindi lo sviluppo di test per misurare questa modifica sono sempre più importanti ^{3, 12, 13.} La tecnica MeDIP è uno strumento suscettibile di screening, sia l'intero genoma e locus specifico livello ^{6, 7.} Questa tecnica fornisce una visione rapida dei livelli di metilazione del DNA utilizzando quantità limitate di partenza del DNA e permette un facile confronto tra le diverse fonti. Applic...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biorupter sonicator	Tool	Diagenode	UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Other	Sorenson BioScience	11510
ND 3300 Spectrophotometer	Tool	NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb	Reagent	Calbiochem	162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Reagent	Invitrogen	112-01D
Magnetic Tube Rack	Tool	Invitrogen	CS15000
Mini LabRoller	Tool	Labnet International	H5500
IP Buffer				10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer				10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl