甲基化的DNA免疫沉淀

摘要

这个视频演示的甲基化的DNA免疫（MeDIP）协议。 MeDIP是有选择性地从基因组DNA样本中提取5 - 甲基胞嘧啶甲基化的DNA片段具有特异性抗体（抗- 5 MC）为期两天的过程。

摘要

识别DNA甲基化模式是表观遗传学的研究的一个常见的​​程序，作为甲基化是已知的基因表达有显着影响，并与参与的正常发展，以及疾病

研究方案

DNA的提取和样品制备

从各种不同的样品（培养细胞，新鲜冰冻以及福尔马林固定石蜡包埋组织）的DNA可用于MeDIP。重要的是要使用不相关的蛋白质，如组蛋白高度纯化的DNA。同样重要的是删除尽可能多的RNA样品，因为它可以干扰DNA定量和抗体结合。 MeDIP使用的DNA的数量，范围可以从200毫微克至1微克，取决于可用的DNA量。为了证明这个协议，1微克的DNA将被使用。下面的协议，将提供高品质的双从培养细胞的双链DNA。应采用其他类型的样品中提取DNA的其他协议。

1. 消化缓冲液加入400μL至1.7 mL Eppendorf管中的细胞沉淀。
2. 添加100微克的蛋白酶K管，并培育一夜之间在50 ° C。
3. 加入500μL酚pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
4. 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
5. 删除一个新的管水（顶部）分数。
6. 重复步骤1至5 3一次。
7. 加入500μL1:1的酚/氯仿的pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
8. 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
9. 删除一个新的管水（顶部）分数。
10. 添加40微克的RNA酶A孵育1小时，在37 ° C。
11. 加入500μL酚pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
12. 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
13. 删除一个新的管水（顶部）分数。
14. 重复步骤13 11一次。
15. 加入500μL1:1的酚/氯仿的pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
16. 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
17. 删除一个新的管水（顶部）分数。
18. 加入十分之一体积的3 M醋酸钠（40μL），拌匀。
19. 100％的乙醇添加2卷（900μL），拌匀，并在-20 ° C为20分钟。
20. 20分钟旋转13 000克在4 ° C。
21. 除去乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇。
22. 加入500μL70％冷乙醇洗。 20分钟旋转13 000克在4 ° C。
23. 取出70％的乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇吹打。
24. 空气干燥，在室温为10分钟，以去除残留的乙醇的所有痕迹开放的第沉淀。
25. 悬浮的DNA，在50μL灭菌dH2O一夜之间在4 ° C
26. 使用NanoDrop分光光度计量化的DNA。一个A _260：280的比例为1.8，是理想的。
27. 确定100个基点阶梯琼脂糖凝胶上的DNA的质量和尺寸范围。可低至10纳克的基因组DNA 1.7％琼脂糖凝胶上运行，使用的染料，染色是高度敏感，少量的DNA，如SYBR黄​​金。
28. 在每一个样品的硅化管中，准备与该卷的其余部分在总体积50μL，1微克的DNA _与消毒 生署2 O

DNA的超声

DNA超声和MeDIP协议必须执行siliconzied管，以防止非特异性结合蛋白管壁。凝胶电泳（27步）确定的DNA样本碎片程度的基础上的DNA样本的最佳超声倍。例如，从培养细胞中提取的DNA应该是非常高的分子量，并随后将需要更多的超声比这往往是部分降解的档案样本中提取DNA。如果样品是均匀的超高分子量，在这一点上，合理进行在本议定书中所描述的没有单独检查每个样品的超声。如果样品零散档案样本，就必须适应超声过程可能通过减少超声次获得300 - 100bp片段。如果您希望处理样品，部分降解，超声参数的优化，可以从利益的代表性样本进行。基于观察到的DNA片段从凝胶电泳（27步）的程度，实验者可以预先确定样品的最佳超声时间。在这里，我们描述了一种方法来获得超声与自动化超声设备使用超高分子量DNA（Bioruptor从Diagenode，UCD - 200 TM）300-1000 bp的DNA片段。

1. Biorupter水必须在4 ° C
2. 超声用于自动设置的7分钟（30秒30秒在最大功率）。
3. 删除超声产品和硅化离心管1.7毫升的免疫反应（IP）的800毫微克（40μL）。
4. 抛开其余200纳克（10μL）作为输入（IN）的参考DNA（储存在4 ° C）。

IMMUNOPRECIPITATON的甲基化的DNA

1. 变性的，将用于在95℃水浴10分钟IP反应（800纳克）的DNA。
2. 酷立即在冰上。让我们的DNA完全冷却（约5分钟冰），然后再继续下一步。
3. 新增5微克单克隆抗体。
4. 添加IP缓冲液（在室温下使用整个协议）至终体积为500μL。
5. 旋转管持有人在2小时在4 ° C孵育。
6. 就在第5步完成后，准​​备磁珠洗涤（步骤6-11）。首先，重悬在小瓶珠彻底震荡。
7. 30μL反应加1％的悬浮磁珠（1〜2 × ¹⁰ 7）转移到一个新的硅化管（例如，8反应，如果这样做，删除9，即270μL足够珠） 。
8. 上放置在室温下2分钟的磁架管。
9. 移液器关闭上清。当去除上清，避免接触枪头对内壁珠（珠磁铁吸引）。
10. 取出磁铁管，并在IP缓冲区的过剩量（750μL1000μL）重悬珠。回放置在室温下2分钟的磁架管。
11. 重复洗一次，然后在第7步中删除原始卷重悬在IP缓冲区的水洗珠。
12. 加入30μL洗磁珠每个IP反应
13. 旋转管持有人在2小时孵育4 ° C。
14. 孵化完成后，放在磁架管，在室温下2分钟。
15. 移液器关闭上清。枪头，避免接触管内壁（珠磁铁吸引）。加入500μLIP缓冲区。混合管的内容，并把2分钟的磁架。重复用500 UL IP缓冲区一次。
16. 删除最后一次洗涤上清液后，重悬在400消化缓冲液珠。
17. 治疗蛋白酶K与100微克的反应，并培育一夜之间在50 ° C。

免疫沉淀的DNA的分离纯化

1. 添加500μL1:1的酚/氯仿pH值7和涡彻底。
2. 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
3. 删除一个新的管水（顶部）分数。
4. 重复步骤1到3，如果水相和有机层之间的相间出现浑浊。
5. 加入1 / ¹⁰体积3 M醋酸钠（40μL）和涡。
6. 新增的糖原（20微克/μL）1μL和旋涡。
7. 添加100％的乙醇，涡旋，并在-20 ° C 20分钟2卷（1000μL）。
8. 20分钟旋转13 000克在4 ° C。
9. 除去乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇。
10. 加入500μL70％冷乙醇洗。涡简单地说，在13个000克的自旋为20分钟，4 ° C。
11. 取出70％的乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇吹打。
12. 空气干燥，在室温为10分钟，以去除残留的乙醇的所有痕迹开放的第沉淀。
13. 悬浮在10μL的DNA沉淀消毒生_署 2 0 。

通过PCR验证

1. 您可能会测试，以确保MeDIP程序正在执行MeDIP协议，使用正常的人类DNA（男性或女性），随后化验已知的甲基化丰富的一个区域。
2. 删除30％的MeDIP产品，PCR管和其他MeDIP产品的30％到另一个PCR管。
3. 将PCR管成10 ng的DNA中，和10纳克到另一个PCR管中的DNA。您现在应该已经设立4个独立的PCR反应。
4. 执行PCR扩增H19和CTRL引物如表1所示。
5. 准备两个mastermixes（每个引物之一），如表2所列为12.5μL总体积的PCR反应。
6. Thermocycle的PCR用在表3所列的的条件。
7. 5μLPCR产物在2％琼脂糖凝胶的可视化运行。
8. 对成功MeDIP的预期结果如表4所示。

表

表1：H19和CTRL引物进行PCR验证。

引物	正向引物	反向引物	预期产品尺寸
H19	H19_F 5' - cgagtgtgcgtgagtgtgag	H19_R 5' - ggcgtaatggaatgcttgaa	174 BP
Ctrl（控制）	CTRL_F5' - gagagcattagggcagacaaa	CTRL_R 5' - gttcctcagacagccacattt	139 BP

表2。用于PCR反应Mastermixes。

	H19混合（每RXN）	CTRL键组合（每RXN）
DDH 2 O	6.875	6.875
10X缓冲	1.25	1.25
dNTP混合液（10毫米）	0.25	0.25
MgCl 2的 （50毫米）	0.25	0.25
引物（H19_F / R或CTRL_F / R）（10微米每个F / R）	0.625	0.625
白金Taq酶	0.25	0.25

表3。 PCR thermocyling条件。

	95℃	5:00
40X	95℃	0:30
	56℃	0:30
	72℃	0:15

表4。预期的成功MeDIP PCR结果。

	模板DNA
底漆使用	在	知识产权
H19	积极的	积极的
按Ctrl	积极的	负面

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讨论

有一个日益认识到疾病的DNA甲基化起着重要作用，因此发展的分析来衡量这一修改正在成为越来越重要^{的3，12，13} 。 MeDIP技术是筛选适合的工具，同时在全基因组位点特异性^的第^6级 ， 7。这种技术提供了一个快速查看和使用数量有限的起始DNA的DNA甲基化水平，为便于比较不同来源之间允许。使用该MeDIP产品的下游应用领域包括各种芯片的全基因组CpG岛寡核苷酸阵列，直接P...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biorupter sonicator	Tool	Diagenode	UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Other	Sorenson BioScience	11510
ND 3300 Spectrophotometer	Tool	NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb	Reagent	Calbiochem	162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Reagent	Invitrogen	112-01D
Magnetic Tube Rack	Tool	Invitrogen	CS15000
Mini LabRoller	Tool	Labnet International	H5500
IP Buffer				10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer				10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl