המימון לפרויקט זה סופק על ידי בפרס האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר מלומד, (06-024-01-CSM צ&#39;רלס ג&#39;דימיטרוף); מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן מענק (RO1CA118124 צ&#39;רלס ג&#39;דימיטרוף); ו המכונים הלאומיים לבריאות / לאומי של דלקת מפרקים השלד והשרירים ועל מחלות עור מענק (P30 AR042689 ד&quot;ר תומס ס &#39;קופר, מבית החולים בריגהאם לנשים, בוסטון, מסצ&#39;וסטס).

1. הכנת hBMEC (HBMEC-60 תאים) monolayer על צלחות פטרי עבור לשכת Flow <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 35 x 10mm רקמות תרבות מנות עם 2ml של פיברונקטין 20μg/ml (ב PBS) לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך 3 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרון פיברונקטין מן המנות ולהוסיף 1.5 x10-60 HBMEC 5 תאים [בינוני עם 199 HEPES &amp; גלוטמין, 10% FBS, סרום אנוש 10%, 5 יחידות / מ&quot;ל הפרין, 1ng/ml גידול רקומביננטי אנושי גורם פיברובלסטים, 1% פניצילין- סטרפטומיצין] כדי בצלחת ולאפשר להם לגדול מפגש&gt; 90%. (זה לוקח 2 ימים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת צמיחה, כדי להסדיר מעלה E-selectin הביטוי, להוסיף בינוני טרי עם 50ng/mL IL-1β במשך 4-6 שעות. Monolayers Cell מוכנים כעת עבור מתגלגל assay. כדי לחסום דואר selectin לתפקד, נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב (שיבוט BBIG-E4 (5D11)) ניתן להוסיף את 20μg/ml עבור ~ 1 שעות בשעה 37 ° C. </li></ol> 2. הכנת האדם hematopoietic KG1a ובתאים עבור לשכת Flow <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדם hematopoietic KG1a ובתאים הם גדלו confluency (1x10 6 תאים / מ&quot;ל) ב RPMI-1640 עם גלוטמין ו -10% FBS / 1% פניצילין, סטרפטומיצין והם pipetted ישירות מהבקבוק לשימוש assay תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר תא מחושב באמצעות hemacytometer ואז התאים מחדש מושעה ב 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל HBSS עם HEPES 10mm (H / H הצפת) ו 2mm CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מאוחסנים על הקרח עד לשימוש assay. </li></ol> 3. הכנת, לשכת מיקרוסקופ תזרים מקבילי ו-פלייט משאבת מזרק (איור 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="איור 1" width="600" height="409" /> באיור 1. איור של ניתוח במקביל-פלייט לשכת זרימה. מיקרוסקופ הפוך, משאבת מזרק הרווארד, המחשב / מצלמה מקבילות צלחת קאמרית תזרים ממוקמים להסדר אופטימלי לניתוח תא יעיל לשחזור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת כוח מקור אור מיקרוסקופ כוח הפוכה לשאוב מזרק ובחר את המטרה 10X על המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 50 מ&quot;ל צינור חרוטי בעריסה ולמלא עם H / H ו 2mm CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 מ&quot;ל מבחנות פלסטיק ב מבחן בעל צינור מתחת צינור 50 מ&quot;ל חרוטי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 60mL מזרק בתוך מזרק משאבה (הקפד כי הן הבוכנה והגוף של מזרק הן מאובטח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף 3-דרך להפסיק את הזין עד הסוף של מזרק 60mL ולצרף מזרק 5 מ&quot;ל על הזין לעצור 3-way. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים מקבילי מקום לשכת המנגנון (GlycoTech, Inc) על הבמה מיקרוסקופ עם צינורית הזנה ימינה, צינור הפלט שמאלה צינור ואקום האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורות ואקום ואקום שסתום אוויר פתוח על מנת לאפשר מנגנון צלחת במקביל לדבוק הבמה. (זה בדיקות אם חצאית ואקום על החדר זרימת אוויר הוא חזק.) בטל שסתום אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף פלט קו צינורות (בצד שמאל של המיקרוסקופ) ל 3-way stop-הזין. Apparatus מוכן עכשיו עבור הצבת בצלחת HBMEC-60 monolayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBMEC-60 פלייס monolayer צלחת ומניחים על מרכז מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ואקום בעמדה קאמרית תזרים מנגנון מעל צלחת כזה צלחת monolayer נמצא במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוריד את מנגנון התא זרימה לצלחת HBMEC-60 monolayer ולאפשר קאמרית מנגנון זרימת יניקה למטה. (לא צריך להיות שום קולות של אוויר להימלט ובשלב זה ייתכן שיהיה עליך ללחוץ על תא כדי לדחוס את אטם גומי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ואקום הוקם, קלט צינור מקום (מצד ימין) לתוך צינור המכיל 50 מ&quot;ל חרוטי H / H עם 2mm CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח 3-way stop-הזין כדי לאפשר זרימה לתוך המזרק 60mL ומשאבה מקום &quot;מצב המשאבה.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אוויר קלט / פלט קווים מבלי להרים את התאים על הצלחת, השתמש משאבת מזרק להגדיר 2mL/minute למלא את הצינור הצריכה, ולאחר מכן להגדיר במהירות 0.5 מ&quot;ל / דקה לפני הנוזל מגיע המנגנון. זה הכרחי כדי להקים ממשלה זו בזהירות ולהימנע בועות אוויר אשר יהיה להרים את monolayer מן הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נוזל נתפסת לנוע לתוך המזרק 60ml, לשכת זרימה משאבת מזרק כבר דרוך ובית הנבחרים תזרים מוכן לשימוש. להגדיר את זה יחזור על עצמו עבור כל מחזור התא קלט עבור כל צלחת חדשים לפי הצורך. </li></ol> 4. לכידת אירועים רולינג ליקוציט באמצעות אלמנטים ש&quot;ח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ש&quot;ח אלמנטים על שולחן העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;לשחק&quot; סמל תמונה חיה. חשיפה אוטומטית תאפשר לכם לראות את הצלחת יותר קל עכשיו חשוב להתמקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד מיקרוסקופ ממוקדת כהלכה על monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוקד פעם להגדיר מחדש החשיפה לאור מסגרת / שנייה ולהתאים 1 על המיקרוסקופ. התמונה אמורה להופיע על המחשב כבר לא יהיה גלוי עינית המיקרוסקופ בשל רמת תאורה נמוכה. היסטוגרמה האור אז יכול להיות מודעהכשהם באים להסיר חשיפה רקע או לשפר בהירות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סל 2x2 או בן חיים לקבל תמונה כי הוא אידיאלי עבור לכידת סרט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מאקרו&quot; על שורת התפריטים ובחר &quot;לכתוב לנמל&quot;; לבחור יציאת &quot;COM3&quot;, ו - &quot;פתוח&quot;. (זה פותח את יציאת לתאם עם משאבה את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1mL ההשעיה תא KG1a לתוך המבחנה 5 מ&quot;ל ליד קו צינורות הזנה ואז במקום קו צינורות הזנה לתחתית המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל בשורת התפריטים, לחץ על &quot;לכידה&quot;, &quot;זמן לשגות הרכישה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפריט החדש יופיע. בחר פרוטוקול שנמשך 210 שניות, זה אורך התוכנית מתגלגל על ​​HBMEC-60 תאים. (כל שלב מתוכנת לצלם בכל שנייה למשך פרוטוקול המשאבה. הוא גם הקים לשלוח פקודה דרך נמל COM3 כדי להפעיל את המשאבה.) אם זמן לשגות נקטע, המשאבה לא יפסיקו בכוחות עצמו וצריך לאפס. לחץ על ביטול כדי לחזור לחיות התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת מזרק כדי &quot;מצב תוכנית&quot; על פי הוראות ההפעלה. (מצב התוכנית מאפשרת תכנות ידני של ספיקות ספציפיים (כלומר רמות הלחץ גזירה) להיות הנחילה בתוך החדר ולהכתיב אינטראקציות KG1a תא מעל monolayer HBMEC-60 תאים.) הגדרות עבור תא KG1a מתגלגל על ​​תאים hBMEC היו כדלקמן 4.2 dynes / 2 ס&quot;מ על 45 s, 0.3 dynes / 2 ס&quot;מ על 60 s, ומגבירה בשלבים כל 15 שניות עד למקסימום של 4.2 dynes / 2 ס&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וול מתח גזירה (W רח&#39;) בחדר היה מחושב על פי המשוואה הבאה: W = רחוב 6μQ / 2 ב, שם μ הוא צמיגות מוערך של התקשורת (0.0076 P), ש הוא קצב זרימת volumetric ב מ&quot;ל / s, a הוא גובה ערוץ (עובי אטם) ב ס&quot;מ (0.03 ס&quot;מ), ואילו b הוא רוחב ערוץ ס&quot;מ (0.5 ס&quot;מ). שיעורי זרימה הוסדרו באמצעות מצב תוכנית של משאבת את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ והמחשב מוכנים כעת ללכוד זמן לשגות צילום. לחץ על &quot;להתחיל לרוץ&quot; על המחשב כדי להתחיל ברכישת נתונים. בעת הפעלת התוכנית, הקפד להוסיף מדיה במבחנה המכילה תאים KG1a על מנת לשמור על צינורות קלט / פלט בינוני מלא (וודא שאין בועות אוויר). </li></ol> 5. התלות של Sialylation מסוף גליקופרוטאין Surface עבור Cell KG1a E-selectin בתיווך 5. רולינג (איור 2: קטעי וידאו קליפים של 5.1-5.5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assaying של התא KG1a מתגלגל על הלא מגורה HBMEC-60 תאים. (שליטה שלילי) תאים KG1a הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות אי - IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assaying של התא KG1a מתגלגל על HBMEC-60 תאים טרום שטופלו IL-1β. (E-selectin תלות מלאה) תאים KG1a הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assaying של התא KG1a מתגלגל על HBMEC-60 תאים טרום שטופלו IL-1β ואז נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב. (E-selectin תלות מלאה) תאים KG1a הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL- 1β-מגורה HBMEC-60 pretreated עם נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assaying של sialidase-מתעכל תא KG1a מתגלגל על ​​IL-1β-מגורה HBMEC-60. תאים KG1a pretreated עם 0.1U/ml Vibrio Cholerae neuraminidase עבור 1 שעות בשעה 37 ° C היו מוכנים ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assaying של פרוטאז-מתעכל תא KG1a מתגלגל על ​​IL-1β-מגורה HBMEC-60. תאים KG1a pretreated עם פרוטאז, ברומלין 0.2U/ml עבור 1 שעות בשעה 37 ° C, הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל. </li></ol> 6. ניתוח ש&quot;ח-Elements-Captured תאים KG1a ו Graphing של תא KG1a נתונים רולינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רצף הזמן היא רכשה, לשמור את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסייה &quot;למדוד&quot; על שורת התפריטים ובחר &quot;להגדיר סף&quot;. העבר ברים כך התאים הרצוי נצבעים באדום. בחר &quot;כל התמונות&quot; אז &quot;בסדר&quot;. כל רצף זמן לשגות עכשיו צריך להיות שונה עם גלוי תאים המתגלגל אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להקליק על &quot;מדוד&quot; ובחר &quot;הגבלות&quot;. (הגבלות לאפשר למשתמש להוציא חפצים thresholded שאינם מייצגים תאים מתגלגל. זה בעיקר רקע נוצר על ידי monolayer HBMEC-60.) בחר &quot;שטח&quot; ו דקות קלט וערכי מקסימום באזור עבור תאים מתגלגל. חזור על שלב זה עבור &quot;הארכה&quot; ו &quot;מעגליות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;למדוד&quot; ובחר &quot;ליצור בינאריים באמצעות הגבלות&quot;, ולהגדיר את ערכי הגבלה כדי לייעל ש&quot;ח-Elements תוכנה לזיהוי של תאים מתגלגל על ​​monolayer של HBMEC-60 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל &quot;למדוד&quot;, בחר &quot;נתונים שדה&quot;, ולאחר מכן בחר &quot;איפוס נתונים&quot;. סגור את התפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל &quot;מדוד&quot; ו select &quot;שדה סריקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;מדוד&quot;, פתח: &quot;הנתונים שדה&quot;, בחר &quot;מספר אובייקטים או&quot; ולאחר מכן לבחור &quot;כל השדות&quot; ולייצא נתונים אל Microsoft Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;נתונים ברורים&quot; להכין ש&quot;ח, אלמנטים רכישת תא איסוף הנתונים הבאה. </li></ol> תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="איור 3" width="600" height="382" /> איור 3. Parallel-פלייט לשכת ניתוח תזרים פעילות E-selectin מחייב על תאים KG1a. KG1a תאים שטופלו sialidase או פרוטאז נותחו עבור מתגלגל על ​​יעילות monolayers של HBMEC-60 תאים טרום שטופלו IL-1β. בקרה שלילית מתגלגל הניסויים נערכו גם על ידי ניתוח התא KG1a מתגלגל על ​​אי - IL-1β-מגורה HBMEC -60 תאים או על IL-1β-מגורה HBMEC-60 תאים שטופלו נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב (5D11). גלגול תדרים סלולריים בוצעו בשלושה עותקים ונותחו באמצעות תוכנת שקל-Elements. (* משמעות סטטיסטית p &lt;0.001) בדו&quot;ח וידאו מבוסס הזה, סיפקנו תיאור ויזואלי כיצד לנתח ליקוציט - אינטראקציות תא האנדותל תחת פיזיולוגי בתנאי עקה גזירה. בפרט, ניתחנו את התפקיד של E-selectin - E-selectin ligands בתיווך קשירה ליקוציט וגלגול, התנהגות דבק הכרחי של מחויבות משני פעילויות מחייב יותר יציב באמצעות קולטנים, כגון integrins ואת הקולטנים hyaluronan. שימוש קאמרית מקבילות צלחת תזרים מותאם לשימוש עם מיקרוסקופ הפוכה, משאבת הרווארד מזרק, מצלמת וידאו ומחשב / תא חומרה הרכישה, ערכנו ניסויים שבה E-selectin ליגנד + תאים KG1a שימשו מודל ליקוציט שלנו תאים hBMEC (HBMEC- 60) מגורה עם ציטוקינים הפרו דלקתיים, IL-1β, שימשו E-selectin המודל האנושי + תא האנדותל (1-6). כפי שדווח בעבר, צפינו חזקים תא KG1a מתגלגל על IL-1β-מגורה HBMEC-60 תאים על פני טווח של רמות הלחץ גזירה באופן E-selectin תלויי (איור 3) (הבדל משמעותי סטטיסטית בהשוואה תא KG1a מתגלגל על אי - IL-1β HBMEC-60 מגורה תאים). בקרות שליליות, שכללה תא KG1a מתגלגל על ​​אי - IL-1β-מגורה HBMEC-60 תאים או על IL-1β-מגורה HBEMC-60 תאים pretreated עם מב אנטי אנושי E-selectin, בוצעו במקביל כדי להדגים את התלות גירוי ציטוקינים ו-E-selectin ביטוי לפעילות מתגלגל (איור 3). יתר על כן, ניתוח מתגלגל של תאים KG1a pretreated עם Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) או עם ברומלין, פרוטאז הלא ספציפית ידוע לעכל E-selectin משטח ליגנד גליקופרוטאין, הדגיש את החשיבות של שאריות מסוף חומצה sialic ו גליקופרוטאין משטח ליגנד E-selectin פעילות (2,3).

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

המחברים אין ניגודי אינטרסים או גילויים.

במקביל, צלחת לחדר ניתוח תזרים הוא התמחה מערכת assay חוץ גופית המשמשת ללמוד ליקוציט - אינטראקציות דבק אנדותל בתנאים מתח גזירה דומה לאלה הנחילה על פני השטח של ורדיד שלאחר נימי. כפי שמתואר כאן במצגת ויזואלית שלנו, אנחנו מדגימים את הערך של מערכת זו על חקירת תפקידו של E-selectin - E-selectin ligands בתיווך קשירה ליקוציט, מתגלגלים על פני השטח של כלי הדם האנדותל הופעל. כמו כן, אנו חושפים את היישום של glycosidase פרוטאז, טיפולים נוגדן חסימת הבהרת תפקידה של selectin-E ו ligands שלה במערכת זו. ניתוחים אלה הם לשעתקו מאוד לעזור להקים בסיס ניסיוני לחקר E-selectin - E-selectin פונקציה ליגנד in vivo. בנוסף ללימוד הידבקות התא עם monolayers של ציטוקינים המופעל לתאי אנדותל כלי הדם (עורק הטבור hBMEC או אדם או עורי לתאי אנדותל כלי הדם), מבחני יכול להתבצע באמצעות מטוהרים רקומביננטי אנושי E-selectin או E-selectin-איג מולקולות chimeric כמו מצע עבור הידבקות התא. אינטראקציות דבק אחרים בתיווכם לויקוציטים (L-) ו-selectin טסיות דם (P)-selectin יכול להיות גם assayed באמצעות צלחת מקבילות קאמרית טכנולוגיה לזרום. על ידי שינוי סוג המצע תא monolayer / חלבון או של לויקוציטים קלט / selectin-transfectant מודלים תא, החוקרים יכולים ללמוד את התפקיד של אינטראקציות אלה בתנאים מתח פיזיולוגי גזירה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
				 	
	

		</div>

analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E-selectin הוא חלבון מסוג 1 הממברנה על לתאי אנדותל כלי הדם המסייעת ליזום גיוס במחזור leukocytes לרקמות, דלקת עורית העצם. E-selectin הביטוי הוא מכונן על microvessels עורי ועצמות והוא ועין מתנהלת על ידי תומכי ציטוקינים דלקתיים, כגון IL-1α / ו TNF-α, על microvessels ברקמות דלקתיות. קולטן זה לקטינים מתווכת אינטראקציות מחייב חלש עם נגד קולטן ligands פחמימות על leukocytes במחזור, שתוצאתה התנהגות מתגלגל אופייני. בגלל אינטראקציות אלה להקדים אירועים דבק יציב יותר פעילות diapedesis, אפיון של פעילות מתגלגל ליקוציט וזיהוי של E-selectin ligands ליקוציט כבר המטרות העיקריות בלימודי סחר דלקת ליקוציט ו ו בפיתוח ותרופות אנטי דלקתיות (1-5) . הכוונה של דו&quot;ח זה היא לספק תיאור ויזואלי, מקיף של הטכנולוגיה ביותר בשימוש נרחב לחקר E-selectin E-selectin אינטראקציות ליגנד בתנאים פיזיולוגיים זרימת הדם. המעבדה שלנו בשיתוף עם המרכז למחלות עור הרווארד מחקר משתמשת המדינה-of-the-art מקבילות צלחת קאמרית תזרים מנגנון מלווה להדמיה דיגיטלית ותוכנות הקלטה חדשה, שקל-Elements. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לנתח אירועים הידבקות בזמן אמת להדמיה על המסך, כמו גם פעילות שיא מתגלגל בפורמט וידאו. הידבקות תא פרמטרים, כגון גלגול, תדירות התנגדות גזירה ומחייבת / קשירה יעילות, מחושבים באמצעות תוכנת שקל, יסודות, מיוצא גיליון אלקטרוני של Excel ו - נתון ניתוח סטטיסטי. בהפגנה שהוצגו כאן, אנחנו עובדים הקאמרית מקבילות צלחת תזרים לחקור E-selectin תלויי פעילות מתגלגל ליקוציט על חיים אנושיים לתאי מח עצם האנדותל (hBMEC). האדם hematopoietic KG1a ובתאים, המבטאים רמה גבוהה של ליגנד E-selectin, שימשו מודל ליקוציט שלנו, תוך תא הנציח hBMEC קו, HBMEC-60 תאים, שימש מודל תא האנדותל שלנו (6). כדי לגרום לדמות ביטוי יליד E-selectin בחדר זרימה, HBMEC-60 תאים הופעלו הראשון עם IL-1. מצגת וידאו שלנו הראו כי במקביל הצלחת ניתוח תזרים היא שיטה מתאימה ללימוד E-selectin בתיווך פיזיולוגי פעילויות מתגלגל ליקוציט וכי אפיון פונקציונלי של ליגנד E-selectin לויקוציטים (ים) בחדר זרימה ניתן לקביעה על ידי יישום פרוטאז או glycosidase digestions.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium at JoVE.com

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

דוח זה מספק תיאור ויזואלי של ניתוח מקבילות צלחת קאמרית תזרים לחקר אינטראקציות אנדותל ליקוציט תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים את התפקיד של E-selectin ligands האנדותל (E) ו-selectin ליקוציט כי ליקוציט ההדק מתגלגל על ​​משטחים תא האנדותל.

ניתוח של הרולינג E-selectin בתיווך פיזיולוגי ליקוציט על כלי הדם האנדותל

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

analysis-physiologic-e-selectin-mediated-leukocyte-rolling-on

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K Views.  Brigham and Women's Hospital. דוח זה מספק תיאור ויזואלי של ניתוח מקבילות צלחת קאמרית תזרים לחקר אינטראקציות אנדותל ליקוציט תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים את התפקיד של E-selectin ligands האנדותל (E) ו-selectin ליקוציט כי ליקוציט ההדק מתגלגל על ​​משטחים תא האנדותל.

Video: Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.