טכנולוגית SynVivo פותחה תחת מענק # 2R44HL076034 מNHLBI.

1. קרקע מכשיר microfluidic SynVivo-SMN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל יציאה (כניסה / יציאה) של המכשיר מורכבת משתי יציאות במקבילות - אחד לזורם בmoieties ציפוי פני השטח (מולקולות הדבקות, מטריצות צמיחה, וכו &#39;) ו / או תאים לזריעה ואחרת להפעלת assay (איור 1 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין להטביע את מכשיר microfluidic SynVivo-SMN (איור 1) בצלחת פטרי המכילה מים deionized סטרילי (DI) ומניח את הצלחת לייבוש ואקום. לאפשר ייבוש לרוץ עד שכל האוויר הוא להסיר את הערוצים של המכשיר. זה אמור לקחת כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הסרת ההתקן מהמים, במקום צינור Tygon (OD של 0.06 &quot;ותעודת זהות של 0.02&quot;) דרוך עם מים לכל יציאה של המכשיר עם מלקחיים בסדר נקודה. צינורות צריכים להיות כ 1 סנטימטר באורך. המכשיר כעת ניתן להסיר מן המים. תרשים 1C מציג תמונה של devicE עם צינורות. </li></ol> 2. ציפוי מכשיר microfluidic עם חלבון רצוי (למשל, Avidin) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, מקום טיפה של מים (כ 100 μl) מסביב לבסיס של צינור יציאת כניסה אחת. מוציא בזהירות את צינורות המשמשים לראש המכשיר. טיפת מים תמנע אוויר מלהיכנס למכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק 1 מיליליטר עמוס avidin בריכוז של 20 מיקרוגרם / מיליליטר. חבר את המזרק למחט נירוסטה 24 G וצינורות. הכנס את צינורות לאחת מיציאות המפרצון של המכשיר. הצמד את יציאת הכניסה לא מנוצל עם מהדק לסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק avidin בקצב זרימה של μl / 1 דקות ל10 דקות כדי לאפשר לטפטוף של המכשיר מלא. בסופו של זרימת הזמן, מהדק את צינורות עם מהדק הלסת ולהניח את המכשיר על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol> 3. מזרימים חלקיקי Biotinylated לניסויים בהידבקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להתקןמגיע לטמפרטורת חדר. מניחים את המכשיר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מצוידים בשלב ממונע וביצועים גבוהים מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 2 מיקרומטר חלקיקי biotinylated בריכוז של 5 x 10 6 / מיליליטר חלקיקים בפוספט הצפת מלוח (PBS). טען את החלקיקים לתוך מזרק 1 מיליליטר. הכן את מזרק 1 מיליליטר של PBS שני בלבד. טען כל מזרק במשאבת מזרק ולהתחבר למחט וצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, מקום טיפה של מים (כ 100 μl) מסביב לבסיס של צינור יציאת כניסה. מוציא בזהירות את צינורות משמשים מעיל המכשיר. טיפת מים תמנע אוויר מלהיכנס למכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את צינורות של חלקיקי biotinylated וPBS משלב 3.2 לכל אחת מיציאות המפרצון. איור 2A מציג תמונה של ההגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הזרקת חלקיקי biotinylated בקצב זרימה של 2.5 μl / min. לפקח על יציאת כניסה על המיקרוסקופ. עם הסימן הראשוןשל חלקיקים, מתחיל את שעון העצר ולהמשיך את הזרימה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של 3 דקות, לעצור את הזרם של חלקיקי biotinylated תוך בוהה הזרימה של PBS בקצב זרימה של 2.5 μl / min בו זמנית. לאפשר PBS לזרום במכשיר במשך 3 דקות כדי לשטוף את החלקיקים מאוגדים. </li></ol> 4. רכישת תמונות והפיכת שטח ריבית מדידות (AOI) באמצעות תוכנת הדמיה (NIKON אלמנטים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית &quot;תמונה גדולה סריקה&quot; בתוכנת ההדמיה לרכישת התמונה של המכשיר כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המספר ברצף bifurcations במכשיר וליצור AOI עגול עם הקוטר כפול של הערוצים. במקרה זה, קבע את קוטר AOI ל200 מיקרומטר מאז קוטר ערוץ 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית הספירה האוטומטית בתוכנת ההדמיה כדי לייצא את מספר החלקיקים בכל אחד AOI לגיליון MS Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, השתמש בתכונת הספירה האוטומטית לייצא את מספר החלקיקים בכלמכשיר. </li></ol> 5. חלקיקים שטף ניתוח באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית מודלים (CFD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סימולציות CFD מנוהלות באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי (CFD-ACE +, ESI Inc) לטופולוגיה מכשיר SynVivo-SMN. התוצאות מאוחסנות במסד נתונים לניתוח תצפיות ניסיוניות. לאחסן מידע תוצאות סימולציה על שיעורי קיר גזירה, מהירות, שטף חלקיקים, והידבקות שבמכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות הסימולציה משמשות כדי לקבוע את מספר החלקיקים הנכנסים כל AOI מבוסס על ריכוז חלקיקי כניסה נתון. </li></ol> 6. יצירה שאר הידבקות מפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב% מהידבקות על ידי חלוקת החלקיקים דבקו בהסתעפות על ידי החלקיקים הזורמים בהסתעפות כפי שמוצג במשוואה 6.1. <img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" /> שבו מספר חלקיקי דבק והחלקיקים זורמים מתקבלים מprotocol צעדים 4.3 ו5.2, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את מפת הידבקות הגזירה באמצעות שיעור הגזירה בכל הסתעפות של הרשתות נלקחו מבסיס הנתונים בשלב (5.1) וערכי הידבקות% מתקבלים ממשוואה 6.1. </li></ol>

<ol>
	<li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li><li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions.">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li><li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment.">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li><li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles.">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li><li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles.">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li><li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow.">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li><li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions.">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Noh&#233;, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+leukocyte+distribution+during+sepsis:+an+experimental+study+on+the+interdependence+of+cell+activation,+shear+stress+and+endothelial+injury.">Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury.</a> Crit Care. 14, 201 (2010).</li><li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium.">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li><li>Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+L-selectin+binding+by+polyacrylamide-based+conjugates+under+defined+flow+conditions.">Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions.</a> Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).</li><li>Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+significance+of+adhesion+molecules+on+cultured+endothelial+cells+in+response+to+ionizing+radiation.">Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation.</a> Microcirculation. 8, 355-364 (2001).</li><li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements.">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunology. 2, 9 (2001).</li><li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+control+of+cell+adhesion+by+combination+of+surface+chemistry+and+soft+lithography.">Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography.</a> Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).</li><li>Qian, T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro/nano-fabrication+technologies+for+cell+biology.">Micro/nano-fabrication technologies for cell biology.</a> Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).</li><li>Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+top-down+and+bottom-up+surface+nanofabrication:+techniques,+applications+&amp;+future+prospects.">Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications &amp; future prospects.</a> Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion.">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).</li><li>Rosano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks.">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li><li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent.">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcations:+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks.">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li></ol>

אגרת פרסום לכתבה זו בחסות חברת מחקר CFD.

זרימת צלחת תאים מקבילים, תוך מתן תובנות משמעותיות לתוך תאי תאי אינטראקציות ותא חלקיקים, סובלים מכמה מגבלות כגון הצריכה גבוהה של חומרים כימיים והצורך בריצות ניסיוניות מרובות כדי ליצור מפת הידבקות גזירה. השימוש ברשתות SynVivo סינטטיות כלי הדם (SynVivo-SMNs) מאפשר את הדור של מפת...

מבחני הנוכחיים ללמוד לתאי תאים ואינטראקציות חלקיקי תאים בדרך כלל כרוכים פורמט צלחת גם סטטי שבו חלקיקים או תאים מודגרת על מטריצות חלבונים או תאים חסיד. בסוף זמן הדגירה שצוין, המספרים של חלקיקים או תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ 1. למרות שמבחנים אלה מספקים תובנה משמעותית לתהליכים ביוכימיים מאחורי האינטראקציות הללו, למגבלה העיקרית היא חוסר זרימה פיזיולוגית נוזל (אופיינית של זרימת דם) והשפעתה על הידבקות של חלקיקים. כדי להתגבר על מגבלה זו, במבחנה זרימת תאים פותחו בשנים האחרונות. אלמנט משותף של זרימת תאים אלה הוא מנגנון שקוף perfused במספרי ריינולדס נמוכים כדי להתאים שיעורי גזירה קיר נצפו בכלי דם בvivo 2. קיר הכלי הוא מודל או על ידי ציפוי של ביומולקולות או צמיחה של תאים על משטח אחד של הזרימה גhamber 3. חלקיקים 4-7 או תאים 8-16 מכן זרמו בטווח רצוי של ספיקות לכמת את מספר הדבקות חלקיקים תחת שיעורי גזירה שונים. עם זאת, השימוש בזרימת צלחת תאים במקביל ללימודים ולאמת את התופעות ביוכימיות הוא די יקר וזמן רב. זאת בעיקר בשל העובדה כי ניסויים מרובים צריכים להתנהל ליצירת מפה של הגזירה fluidic לעומת מספר חלקיקים / תאים דבקים. בנוסף, זרימת צלחת תאים דורשים כמויות גדולות של חומרים כימיים בשל גודלם הגדול (גובה&gt; 250 מיקרומטר ומ&quot;מ הרוחב&gt; 1). לבסוף, מכשירים אלה אינם מדויקים מודל תכונות גיאומטריות (למשל, bifurcations) ותנאי זרימה (למשל, מתכנס לעומת לסטות תנועות) שנמצאות בגוף חי. ההתקדמות שחלה באחרונה בmicrofabrication יתוגרפיה מבוססת 17-19 האיצה את השדה של מעבדה על שבבהתקני 20-21. התקנים אלה כבר סייעו בפיתוח גרסה מוקטנת של זרימת צלחת קאמרית המקבילה עם ממדים במשטר מיקרומטר. הירידה בממד גם תשואות יתרונות משמעותיים במונחים של כמויות של חומרים כימיים, תאים או חלקיקים הנדרשים לניסויים. עם זאת, מגבלה העיקרית של המכשירים הזמינים כרגע היא השימוש בערוצים ליניארי למודל microvessels, שאינו מחקים את נימי הדם המורכבים שנצפו in vivo. יש לנו לאחרונה פיתחו מתודולוגיה חדשנית ליצירה מחדש של רשתות כלי הדם על גבי מצעי פלסטיק חד פעמי וכתוצאה מהייצוג סינטטי של in vivo התנאים. מכשירים אלה מכונים רשתות כלי הדם SynVivo-סינתטיות (SMN) מפותחים באמצעות PDMS תהליך הרך ליתוגרפיה מבוססת. מכשירי SynVivo-SMN יכולים לשמש כדי לקבל מפת הידבקות גזירה של הידבקות תא / חלקיקים 22, מחקר ממוקד משלוח סמים 23 ושעותולהעיף אומת נגד בנתונים vivo 24-25. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לדור של מפת הידבקות גזירה מניסוי בודד בכמויות קטנות כמו 1-5 μl ובכך וכתוצאה מכך החיסכון משמעותי של משאבים וזמן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SynVivo-SMN</td>
			<td>CFD Research</td>
			<td>SMN-001</td>
			<td>Exclusive at CFDRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFD-ACE+</td>
			<td>ESI Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>43-4401</td>
			<td>Any avidin source will work for this assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Particles</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24173-1</td>
			<td>Any source of biotinylated particles will work for the assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63018-044</td>
			<td>Size is typical for use with SynVivo-SMN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON Elements</td>
			<td>NIKON Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any other imaging software can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of shear adhesion map using synvivo synthetic microvascular networks

מבחני הידבקות תא / חלקיקים הם קריטיים להבנת האינטראקציות ביוכימיים מעורבות בפתופיזיולוגיה מחלה ויש יישומים חשובים במסע לפיתוח תרופות חדשניות. מבחני באמצעות תנאים סטטיים מצליחים ללכוד את התלות של הידבקות בגזירה, הגבלת המתאם שלהם עם סביבת in vivo. תאי זרימת צלחת מקבילים שלכמת הידבקות תחת זרימת נוזל פיזיולוגית צריכים ניסויים מרובים עבור הדור של מפת הידבקות גזירה. בנוסף, הם לא מייצגים את vivo קנה מידה ומורפולוגיה ובדורשים כמויות גדולות (~ מיליליטר) של חומרים כימיים לניסויים. במחקר זה, אנו מדגימים את הדור של מפת הידבקות גזירה מניסוי בודד באמצעות רשת כלי הדם מכשיר microfluidic, SynVivo-SMN מבוסס. מכשיר זה יוצר מחדש מורכב בכלי דם vivo כולל בקנה מידה גיאומטרית, אלמנטים מורפולוגיים, זרימת תכונות ואינטראקציות הסלולר בפורמט במבחנה, ובכך לספק סביבה ביולוגית מציאותית למחקר בסיסי ויישומי בהתנהגות סלולרית, אספקת סמים, וגילוי תרופות. Assay הודגם על ידי בוחן את האינטראקציה של 2 מיקרומטר החלקיקים מצופה ביוטין עם משטחים מצופים avidin של השבב האלקטרוני. מגוון השלם של גזירה שנצפתה בנימי הדם מתקבל בהידבקות assay מאפשר אחת לעומת מפת גזירה לחלקיקים בתנאים פיסיולוגיים.

איור 1 א מציג סכמטית ותמונת שדה בהירה של מכשיר SynVivo-SMN. איור 1 מציג את מכשיר SynVivo-SMN רכוב על שקופיות זכוכית. תרשים 1C מציג את המכשיר עם צינורות הבאים תחול במים בייבוש ואקום. איור 2 א מראה תמונה של למע?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks at JoVE.com

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

generation-shear-adhesion-map-using-synvivo-synthetic-microvascular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K Views.  CFD Research Corporation. Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables. 

Video: Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with &alpha;5&beta;1-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.
The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal3, causes integrin redistribution1, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions4, and thereby induces directional migration3. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement5. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm2, 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair6. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage &alpha;5&beta;1-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.

This protocol describes the stimulation of cultured fibroblasts with low-intensity pulsed ultrasound, which drives focal adhesion formation and Rac1 activation by mimicking engagement of the transmembrane matrix receptor, syndecan-4. This approach allows investigation of a successful clinical technique at the cellular level, thereby providing opportunities for refinement of the therapy.

אינדוקציה של אותות הדבקה תלויי שימוש בעוצמה נמוכה אולטראסאונד

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is an invaluable tool for gene function analysis in living organisms. The standard transgenesis method is based on microinjecting foreign DNA fragments into a pronucleus of a fertilized oocyte. This technique is widely used in mice but remains relatively inefficient and technically demanding in other animal species. The transgene can also be introduced into one-cell-stage embryos via lentiviral infection, providing an effective alternative to standard pronuclear injections, especially in species or strains with a more challenging embryo structure. In this approach, a suspension that contains lentiviral vectors is injected into the perivitelline space of a fertilized rat embryo, which is technically less demanding and has a higher success rate. Lentiviral vectors were shown to efficiently incorporate the transgene into the genome to determine the generation of stable transgenic lines. Despite some limitations (e.g., Biosafety Level 2 requirements, DNA fragment size limits), lentiviral transgenesis is a rapid and efficient transgenesis method. Additionally, using female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is presented as an alternative to generate pseudopregnant foster mothers.

This article aims to provide the methodology for lentiviral transgenesis in rat embryos using multiple injections of a virus suspension into the zygote perivitelline space. Female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is used to generate pseudopregnant foster mothers.

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...