פרוטוקול זה מסייע לבסס את הקשר בין כוח מולקולרי להתנהגות גלגול תאים מלבד מתן אפשרות למפות ולכומת הידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. טכניקה זו מאפשרת לחקור אירועי הידבקות בודדים במהלך גלגול התא בפועל ומאפשרת לנו למדוד את כוח ההידבקות המולקולרית הרלוונטי הפיזיולוגי ישירות. הכנת פני השטח באמצעות זמן הריכוז והדגירה המתאימים בכל שלב חיונית להשגת פונקציונליזציה משטחית באיכות גבוהה.
איכות הביו-תנאים והתנאים המתאימים הם גם חיוניים. הדגמה חזותית היא קריטית כדי לעזור לחוקרים לשכפל פרוטוקול זה. בפרט, השלבים כגון הרכבה תא זרימה ותמונות לאחר עיבוד ייהנו מאוד מהדגמה חזותית.
התחל על ידי פיזור דק של כמות קטנה של אפוקסי משני צידי הסרט הדו-צדדי עם סכין גילוח. בעזרת לייזר, חותכים את הסרט מצופה אפוקסי כדי ליצור ארבעה ערוצים. צור את שבב הזרימה על ידי כריכת סרט אפוקסי בין שקופית של ארבעה חורים וכיסוי PEG.
באמצעות קצה פיפטה, להפעיל לחץ עדין לאורך הערוצים כדי ליצור חותם טוב, ולאחר מכן לרפא את אפוקסי במשך מינימום של שעה אחת. ישר את השבב כך שפתיחת כל ערוץ תתמקם במרכזי המתאם. לאחר מכן הנח שני מרווחי אקריל שקופים על גבי השבב.
יש להפעיל לחץ מוצק באמצע הבלוק ולבורג בקצו של כל מרווח. בורג את הכניסות לתוך החורים השחלה בצד השני של הסוגר לפקח על מצב האיטום דרך בלוק אקריליק שקוף. להזרים 200 microliters של חוצץ לשטוף לתוך התא כדי לבדוק דליפה.
אם נוצרות בועות בערוץ, דחוף באגרסיביות 200 מיקרוליטרים נוספים של חוצץ כביסה כדי להסיר את הבועות. הוסף 40 מיקרוליטרים של BSA לתא הזרימה כדי למנוע כריכה לא-מינית ודגרה במשך 10 דקות בתא הלחות. לאחר הדגירה, מוסיפים 40 מיקרוליטרים ב- Tween 20 לתא הזרימה ושוב מדגירים במשך 10 דקות כדי להפחית עוד יותר את הכריכה הלא-מדעית.
ואז לשטוף את הערוץ עם 200 microliters של חוצץ לשטוף כדי להסיר את כל סוכני passivation. לפונקציונליזציה של פני השטח התאיים, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של סטרפטאבידין לתא הזרימה ודגרו במשך 20 דקות, ואז שטפו את התא עם 200 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה. עכשיו, להוסיף 40 microliters של חלבון היברידי G-TGT לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות.
לאחר הכביסה עם חוצץ כביסה, להוסיף 40 microliters של חלבון G-TGT העליון גדיל ודגורה במשך 20 דקות כדי להשלים כל גדיל תחתון TGT לא מרוסן על פני השטח ולאחר מכן לשטוף עם חוצץ לשטוף. לבסוף, להוסיף 40 microliters של P-selectin-Fc לתא הזרימה ודגור במשך 60 דקות לפני כביסה עם חוצץ לשטוף. מלא מזרק זכוכית חמישה מיליליטר עם חוצץ מתגלגל והקש על הצדדים של המזרק כדי להתנתק ולדחוף את הבועות החוצה כפי שהם צפים לכיוון הקצה.
לאחר החדרת מחט סטרילית לתוך חתיכת 200 מ"מ של צינורות פוליאתילן, לחבר את המחט למזרק הזכוכית. תקן את המזרק על משאבת המזרק והטה את משאבת המזרק כך שצד הבוכנה מוגבה כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לערוץ. הכנס את קצה הצינור לתוך הכניסה של תא הזרימה.
הכנס קצה אחד של עוד 200 מילימטר של צינורות פוליאתילן לתוך השקע ולהטביע את הקצה השני פסולת. קח אחד עד שני מיליליטר של דגימת השעיית התא וצנטריפוגה כדי כדורי התאים. הסר את המדיום בעדינות resuspend התאים ב 500 microliters של המאגר המתגלגל.
בזהירות לנתק את הצינורות מן הכניסות ואת השקע ואת pipette 40 microliters של התלוי התא לתוך תא הזרימה. התחבר מחדש את הצינורות כמתואר בעבר והבטיח בועות לא הוכנסו לתוך ערוץ הזרימה. התחל ניסוי גלגול תאים על ידי הפעלת משאבת המזרק בקצבי הזרימה הרצויים.
צפה בגלגול תאים באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה עם מטרה פי 10. לאחר השלמת הניסוי, הסר את התאים מהערוץ על ידי הטתת המאגר המתגלגל במהירות של 100 מיליליטר לשעה עד שהמשטח יהיה פנוי. להדמיית המסלולים המקומיים על ידי DNA-PAINT, הוסף 40 מיקרוליטרים של גדיל צלם DNA-PAINT שהוכן במאגר DNA-PAINT לערוץ.
בצע מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות פנימית כוללת באמצעות התנאים המוזכרים בכתב היד של הטקסט. הפוך את התמונות ברזולוציית-על ועבד את התמונות ברזולוציית-על. להדמיית הרצועות הארוכות על-ידי תיוג קבוע, הוסיפו את גדיל הדמייה הקבוע ודגרו למשך 120 שניות במאגר T50M5.
ואז לשטוף את הערוץ על ידי החדירה 200 microliters של חוצץ לשטוף. הקלט תמונה עם לייזר העירור כבוי כדי להשיג רעש מצלמת רקע. תמונה של שטח גדול בתבנית רשת על-ידי מיקרוסקופיית TIRF.
תכנת את המיקרוסקופ כדי לסרוק את השטח של 400 על 50 תמונות ולפצל את הנתונים הגולמיים לקבצי TIP בודדים שכל אחד מהם מכיל מקסימום של 10,000 תמונות באמצעות תוכנית ImageJ. שיטחו את כל התמונות באמצעות פרופיל התאורה והשתמשו בתוסף MIST כדי לתפור את התמונות. התוצאה של חלבון G ssDNA bioconjugation אפיון הראה כמעט אחד הוא יחס אחד של חלבון G ל ssDNA שבו חלבון G Maleimide ssDNA ו imidazole elution חוצץ ספקטרום מן הבסיס האורתוגונלית להתאמה לספקטרום המוצר bioconjugation.
Native PAGE שימש לאישור ההסתייגות הביולוגית המציגה את הרצועות הירוקות הבהירות חופפות לרצועת החלבון המונומרית G המצביעה על הטיות מוצלחות ותשואה טובה. פרופיל התאורה של TIRF המוצג מסיבי מצב יחיד בהיר בדרך כלל יותר באמצע שדה הראייה ומעמעם סביב הקצוות. כדי לפצות על התאורה הלא אחידה ולשטח את התמונות לניתוח כמותי, פרופיל התאורה נקבע על ידי ממוצע של אלפי מסגרות בודדות.
תמונות שטוחות הופקו על ידי חיסור רעש המצלמה הן מפרופילים גולמיים והן מפרופילי תאורה ולאחר מכן נרמול על ידי פרופיל התאורה. תפירה גולמית הראתה דפוסים תקופתיים ברורים המתאימים לתמונות שלא תיקון, בעוד שאותו שדה ראייה שתופר מתמונות שטוחות יצר רקע שטוח. פרופיל זרימה שיפוע שימש כדי לקבוע את הטווח של מתח הגיאה וכתוצאה מכך תאים מתגלגלים ולהניב מסלולי פלואורסצנטיות שתחתיו ניתן לראות טביעת רגל טיפוסית של הידבקות של תא יחיד.
תוצאות תת-אופטימליות ואופטימליות של מסלולי פלורסנט עם ניגודיות מספקת, צפיפות מסלול מופרזת, צפיפות מסלול וניגודיות אופטימליות, והדמיה מוגבלת של DNA-PAINT מוצגים. זמן הדגירה של יותר מ -60 דקות להבטיח פונקציונליזציה פני השטח ובנייה קאמרית נכונה מונעת מעבר של בועות שפוגעות פני השטח פונקציונלי. הליך זה חל על ניתוח כמותי של כוח מולקולרי המעורב בהידבקות מתגלגלת ומאפשר לחוקרים להבין את ההתנהגות המתגלגלת של סוגי התאים השונים.
טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור שאלות חדשות לגבי אירועי הידבקות מהירה המובילים לקידום נוסף של מולקולה בודדת ומחקר מכנוביולוגיה.
