מימון הניתן על ידי הקרן הלאומית למדע (MF).

הקדמה OMT הוא עיבוד של מערכת לקשור מגנטי [1] שנועד לשלב &quot;סימולטור פלומת וירטואלי&quot;. הפרוטוקולים הבא יסביר כיצד שצריך לקשור זבובים (חלק 1) ולספק אסטרטגיות הגדרת מגנטים (חלק 2) ו המוני תזרים ריח מוסדר אספקת המערכת (Part3). המידע המתואר כאן הוא אופטימיזציה עבור מערכת זו בפרט עשוי להשתנות עבור רכיבים עם מפרטים טכניים אחרים. חלק 1: זבובים קשירה השלבים המתוארים כאן קשירה דומים במחקרים קודמים רבים [2], אך מותאם לשימוש OMT [3]. קשירה נכונה היא קריטית כדי להבטיח ניסויים ניסיוני חזקים הדיר. חשיבותה של קשירה זהיר לא יכול להיות מוגזמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף זבובים 4-6 ימים eclosion הודעה ולהרעיב אותם במשך 4-6 שעות. המקום kimwipe טבולה במים הבקבוקון ולהישאר ללא מזון כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קבוצה של זבובים מבקבוק כדי בקבוקון קטן, להכניס אותו לתוך גוש נחושת על הבמה קירור Peltier נקבע על כ -4 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הנכונה מרדים הזבובים בתוך כ 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין הזבובים על פני השטח קרים שלב הקירור. Kimwipe לח מבטיחה קירור מתמיד הפתילה לחות לציפורן. בחר את הנקבות הגדולות עבור קשירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מברשת בסדר, לדחוף זבוב אחד למצב בתוך סרקופג שהותקן מעוצב כדי להתאים את סוג אחד בר נשים זבוב הפירות. <img src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" alt="" /> באיור 1. <a href="https://www.jove.com/files/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בעמדה סיכה minutien (קנסות כלי מדעי) עם מוט מגנטי רכוב על micromanipulator. סיכה היא להיות מיושר כזה בסוף בוטה נוגע החזה הגבי רק מאחורי הראש בין שני האגפים. פין צריכה להיות אנכי לחלוטין כאשר הם מוצגים חזיתית לכיוון העיניים. אפילו כמות קטנה של &#39;רול &quot;לטוס בין לבין פין לא יכול להיות נסבל. הזווית הצדדית בין הפינים לבין ציר זמן של הגוף צריך להיות בזווית האף למעלה של 30 מעלות ביחס לאופק (איור 1). הערה: פעולה אופטימלית לקשור את המגנט, סיכות ייתכן שיהיה צורך גזוז מאמצים קצרים. זה יהיה תלוי אך ורק על המרחק בין מגנטים ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיכה minutien מיושר, השתמש תיל פלדה דקים לחול ירידה קטנה של UV-מופעל דבק (ElectroLite קורפ) בסוף בוטה של ​​הסיכה minutien. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפעל את הסיכה, כך טיפה דבק מגע החזה של הזבוב בדיוק מעל הראש. עם גודל טיפה נאותה, דבק צריך לחשל וזרימה של הסיכה על החזה. היזהר שלא להשתמש בדבק יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את הדבק עם שתי 20 התפרצויות השני של אור UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את לעוף קבוע בצד וחזור. פורסים ריבועים קטנים של Kimwipe עם מלקחיים לתת לכל אחד לטוס קשור לרסן את הטיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כשעה של התאוששות, הזבובים קשור מוכנים ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבקה לא נכון עלול לפגוע ביכולתו של זבוב לבצע בזירה מגנט. לעוף כל יש לבדוק עבור סיבוב חלקה בתחילת כל ניסוי כדי להבטיח את הזבובים מודבקים כראוי. ניתן להשיג זאת על ידי החלפה דפוס פסים עם תקופה מרחבי גדול מספיק כדי לעורר תגובה חזקה optomotor [4]. אם לטוס מודבק בזווית המגרש הלא נכון או מוטה על הסיכה ביחס לציר את הגליל, את יכולה לעוף (i) לא ספין בכלל, (ii) יש טווח מוגבל של תנועה, או (iii) לסובב על עקביות מהירות. במקרים לעיל לטוס אמור להיות מושלך והוחלפו אחד חדש. אם זה פותר את הבעיה זה היה ככל הנראה מקרה של הדבקה לא תקין. (אם החלפת לטוס אינה פותרת את הבעיה, ראה פרק 2.4) </li></ol> חלק 2: יישור מגנטים יישור מגנטים (נדיר-Earth-magnets.com) כראוי יש צורך לטוס להשיג מגוון חלקה של 360 מעלות של תנועה. בצע את השלבים הבאים כמו שצריך ליישר את המגנטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגנטים הטבעת התחתונה מוחזקים אופקית על ידי שרוול פלסטיק ממוקם ישירות על גבי תא ואקום ברור (איור 1; תיאר נוספת חלק 3). מגנט המוט העליון הוא קבוע במאונך כ 3 / 4 &quot;מעל מגנטים נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערך ליישר את המגנטים העליון והתחתון חזותית על ידי הצבת מגנט המוט העליון ישירות מעל נקודת המרכז של מגנטים טבעת נמוכה יותר. כדאי לצרף את המגנט העליון micromanipulator (Siskiyou Inc) להתאמת היקף בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפוקסי הנושא V-תכשיט (חלקים קטנים) על פני השטח התחתון של המגנט העליון כדי למזער חיכוך הסיבוב ולתקנן מיצוב לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לעוף בזירה ולהתאים את אופקי vעמדת ertical של המגנט העליון עד לטוס יכולים חלקה בהתמדה לסובב 360 מעלות בציר לסבסב. לעוף כל יש לבדוק עבור סיבוב חלקה בתחילת כל ניסוי כדי להבטיח את המגנטים מיושרים כראוי וכי סיכות הפרט minutien אינם פגומים (ראה פרק 1.11). אם מגנטים לא מיושרים כראוי את הזבוב יכול (i) לא ספין בכלל (ii) יש טווח מוגבל של תנועה (iii) לסובב במהירויות עקביים. אם הבעיה נפתרה על ידי החלפת לטוס עם אחד חדש, זה היה ככל הנראה בשל בעיה הדבקה (ראה פרק 1). אם הבעיות הללו קיימים לטוס כל, סביר להניח בעיה עם יישור של מגנטים התאמה נוספת יידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזהרה: בעת ששיחק עם נדיר מגנטים האדמה יכול להיות כיף, הם מסוכנים מאוד. תוצאות שימוש לרעה בציוד פגום ו / או קטין נזק גופני. לנקוט זהירות רבה עם מגנטים אלו עדיין לזלזל בקלות מפתה. </li></ol> חלק 3: משלוח ריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת המסירה ריח מבוסס על אחד שתואר לעיל [5] הוא החלק הקשה ביותר כדי לייעל (איור 1). זה דורש הרבה סבלנות, ניסוי וטעייה. בצע שלבים אלה כדי להשיג מעקב ריח יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגדרה הראשונית של מערכת ריח דורש ריצה צר מד צינורות טפלון (חלקים קטנים) של גז מרבב (סייבל Systems International) את מנהג מים / ריח צלוחיות בנוי. יציאה של צלוחיות אלה מתחבר ישירות ליציאת צינורות תת עורי באמצעות צינורות טפלון אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ואקום ברור אקריליק ממוקמת מתחת לזירה כדי לתמוך מגנטים. אנו משתמשים צינור 4 מ&quot;מ זכוכית רכוב מתחת לעוף המחובר לתא ריק כדי להביא את הוואקום פתיחה קרובה לטוס ולהקטין את הקוטר של הפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לעוף קשור לזירה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ריח אטרקטיבי (חומץ תפוחים עובד היטב), וכן לוודא ויזואלית לטוס המסילה ריח. אם הזבוב נראה שאין העדפה של ריח, בצע את שלושת השלבים. זה עשוי לדרוש כמה זבובים, וניסויים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מיקום הנמל ריח עד לטוס מופיע כדי לעקוב אחר הריח. אנו רכוב ליציאות ריח על micromanipulators (Siskiyou Inc) ואת מיקומו 4 מ&quot;מ קדמית הגבי ו 3mm אל ראשו של זבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצב הזרימה ההמונית עד לטוס מופיע כדי לעקוב אחר הריח. ההגדרות שלנו 7ml/min (סייבל מערכות הבינלאומי MFC-4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצב הזרימה של ואקום עד לטוס מופיע כדי לעקוב אחר הריח. אנו קובעים את קצב זרימת ואקום 13l/min באמצעות וסת זרימה (קול בן הזוג). הערה: ואקום בניין קווי האספקה ​​עשויים להשתנות לאורך זמן גורמת לתנודות מבנה נוצה. זה עשוי להיות שימושי כדי לחבר משאבת ואקום חיצוני הרגולטור תזרים התנאים זרם בלתי פוסק ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המיקום של הנמל ספיקות נקבעים, מעת לעת לעבור בין אדי מים לבין מתן אדי הריח באמצעות להחלפה באמצעות מרבב גז חזותית לוודא לטוס רק המסילה כאשר ריח ריח פועל. מדי פעם, ריח שיורית בתוך הנמל ריח יכול לעורר מעקב ריח כאשר הריח כבוי. זה יכול להתבטל מבלי להסיר את יציאת ריח ממוצבת היטב על ידי ממלא את המזרק עם צינורות אתנול איסוף זה על קצה משלוח עם Kimwipe. באמצעות אוויר דחוס, מכה כל אתנול הנותרים החוצה ולהמשיך בניסויים. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר הפעולות הן בעקבות נכונה שני דברים יש לשים לב. ראשית, תחת קבוע גירויים חזותיים מסתובב זבוב קשור להציב OMT צריך לסובב חלקה 360 מעלות בציר לסבסב. &quot;הבקר המשומר&quot; מסתובב (נקרא הקפיצות האלה) אופייניים של התנהגות מפנה ספונטני בהיעדר גירויים חזותיים קבועים. אם זבובים כנראה לא יכול לסובב בצורה חלקה, הדבקה לא תקין (ראה חלק 1) ו - מגנטים misaligned ניתן להאשים (ראה חלק 2). שנית, כאשר ריח מופעלת, צריך לטוס בראש לכיוון הריח. כאשר ריח כבוי, צריך לטוס saccade באופן ספונטני ללא עדיפות לתפקיד בודד בזירה. אם זבובים לא פעיל המסלול פלומת ריח, עמדת הנמל ריח, קצב זרימת אוויר ו / או את קצב הזרימה ואקום עשוי להזדקק התאמה (ראה פרק 3).

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly,+Drosophila+melanogaster.">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila.">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li></ol>

קשירה זבובים לעורר מעקב ריח יציבה בזירה זו היא פשוטה יחסית. זה דורש, תרגול סבלנות ניסוי וטעייה. חלקים רבים של הזירה זה יכול להיות מותאם יותר או להחליף להניב וריאציות הפוטנציאל הניסיוני. לדוגמה, גרסאות חדשות יותר של החדר ריק הם הרבה יותר קטנים ולאפשר יותר מרחב מתחת לזירה. כמו כן, ה?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cooling Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teca</td>
<td>LHP-300CP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brass Cooling Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>~4 x 8 x 2cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sarcophagus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contact us for details</td>
</tr>
<tr>
<td>UV-Activated Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kemxert corp</td>
<td>KOA300</td>
<td>1oz bottle lasts years</td>
</tr>
<tr>
<td>Panel System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td>
<td>[4]</td>
</tr>
<tr>
<td>Minutien Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lower Ring Magnets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0615</td>
<td>5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"</td>
</tr>
<tr>
<td>Upper Rod Magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0750</td>
<td>0.125" x 1"</td>
</tr>
<tr>
<td>V-Jewel Bearing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>VJ-0469-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MFC-4 Flow Regulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas Multiplexer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>STT-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 Gauge Hypodermic Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HTX-20R-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4mm o.d.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Flow Regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole Parmer</td>
<td>EW-32464-52</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a magnetic tether system to investigate visual and olfactory mediated flight control in drosophila

זה כבר ברור במשך שנים רבות כי חרקים להשתמש רמזים חזותיים לייצב הכותרת שלהם בזרם הרוח. בעלי חיים רבים לעקוב ריחות נישא ברוח. ככזה, ייצוב נגד הרוח מעקב ויזואלי של עזרי ישירות מעקב ריח. אבל לעשות אותות הריח ישירות להשפיע על התנהגות מעקב חזותי באופן עצמאי רמזים הרוח? כמו כן, מבול לאחרונה מחקר על נוירופיזיולוגיה וגנטיקה של neurobehavioral olfaction ב תסיסנית יש מוטיבציה מבחני התנהגות יותר ויותר מתוחכמים מבחינה טכנית והן מבחינה כמותית. הנה, אנחנו שונה מערכת לקשור מגנטי המציאו במקור על ידי לאבזר את הזירה עם צרות הזרימה למינרית נוצות ריח לניסויים חזון. זבוב מודבק סיכה פלדה קטנים המרחפים שדה מגנטי המאפשר לו לסבסב בחופשיות. מזון קטנים בקוטר נוצות ריח מופנים כלפי מטה על ראשו של זבוב, לעורר מעקב יציבה על ידי זבוב רעב. כאן נתמקד המכניקה קריטית של קשירה, יישור מגנטים, להמציא את הפלומה ריח, ואת אישור מעקב ריח יציב.

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila at JoVE.com

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

כאן אנו מתארים כיצד לקשור זבוב מנגנון לקשור מגנטי (OMT) חוש הריח. אנו מתארים כיצד ליישר את הארץ נדיר מגנטים יציאות ריח, וכיצד להגדיר זרימה שיעורי מסה למסירה הן הגירוי יניקה ואקום להשיג מעקב ריח אופטימלית.

מערכת מגנטית לקשור לחקור חזותית חוש הריח בקרת טיסה מתווך תסיסנית

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

a-magnetic-tether-system-to-investigate-visual-olfactory-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  University of California, Los Angeles. כאן אנו מתארים כיצד לקשור זבוב מנגנון לקשור מגנטי (OMT) חוש הריח. אנו מתארים כיצד ליישר את הארץ נדיר מגנטים יציאות ריח, וכיצד להגדיר זרימה שיעורי מסה למסירה הן הגירוי יניקה ואקום להשיג מעקב ריח אופטימלית.

Video: A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

ראייה ריח מעקב מתווכת במהלך טיסה ב תסיסנית

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...