ממומן על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע כדי MF

OMT הוא עיבוד של מערכת לקשור מגנטי 1 שנועדה לשלב 2 וירטואלי סימולטור נוצה. הפרוטוקולים הבא יסביר כיצד לייעל את תמונות הווידאו שנרכש (חלק 1) ולהפעיל שני סוגים של visuo-הריח ניסויים בסיסיים (חלק 2 ו -3). חלק 1: רכישת וידאו אופטימיזציה של תמונות, וידאו חיונית לאיכות הנתונים רכשה. בצע את הפעולות הבאות עבור תמונות נקיות יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לעוף טרי קשור בזירה בעזרת זוג מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום firewire לוח המצלמה (Fire-אני 1394store.com) תחת קאמרית ואקום לנקות את אקרילי כזה נוף המצלמה ישירות כלפי מעלה דרך החדר, דרך צינור זכוכית, להיבט הגחון של הזבוב קשור. הקפד כי אין ציפוי מסנן IR על העדשה של מערכת וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להאיר את לטוס, השתמשו מערך מעגלי של נוריות אינפרא אדום (Small-חלקים Inc) ממוקמת ממש מתחת לוחות LED. פוקוס כל LED על גופו של זבוב בנפרד עבור תאורה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את בוהק ממערכת פאנל למזער רמזים חזותיים שנצפו על ידי לטוס, כדאי מעיל כל המשטחים רעיוני בתוך להציג את המצלמה בצבע שחור שטוח. אורות חדר צריך להיות כבוי כדי להפחית את הבוהק והבהירות מודולציות לזיהוי על ידי עין של זבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את תמונת המצלמה. לעוף צריך להיות לבן בוהק על רקע שחור. אם התמונה מטושטשת העדשה ייתכן שיהיה צורך ממוקד. אם הזבוב חשוך, מערך LED עשוי להיות ממוקד או מופעל מספיק לתאורה נכונה. אם הרקע מכיל אובייקטים בהירים, הר דיסק של להקה נייר שחור מעל לעוף כדי למזער ההחזרה רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו רוכשים וידאו עם שגרות אישית נכתב Matlab באמצעות רכישת הכלים תמונה. </li></ol> חלק 2: לעוף למצוא את פלומת ריח ניסוי אחד פשוט OMT היא התבוננות זבוב רעב (רעב) באיתור ואז מעקב פעיל פלומה ריח של מזון אטרקטיבי. מניפולציה של הסביבה החזותית משפיעה על יכולתו של לטוס וחסונה לעקוב ריח מזון תיאבון. שים לב כי הניסויים מתנהלים בדרך כלל במתכונת לחסום באופן אקראי כדי לצמצם הטיות כדי הניסוי. כל חומרה חיצונית (multiplexers גז, בזירה LED, רכישת וידאו) נשלטים על ידי שגרות תוכנה מותאמת אישית שנכתב ב-Matlab (Mathworks). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לעוף טרי קשור בזירה בעזרת זוג מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל ניסוי, באמצעות תצוגה ויזואלית, לסובב את לטוס מהפכות מספר 3, כדי להבטיח תנועה חלקה סביב ציר 360 כולו לסבסב. אם טסים לא ספין חלקה להתעלם ממנו. אם הבעיה נמשכת, הסיבה היא ככל הנראה מגנטים misaligned. הערה: אם ההפצה של הזירה לכיוון כמה מסלולים במהלך המשפט ספין מראה הפסגות משמעותי (כלומר היא לא שטוחה מעל 360 מעלות), יש להניח הטיה בשל האוריינטציה מגנטים misaligned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את לעוף עם התנאים הבאים מדגם ניסיוני בסדר אקראי: i) ניגודיות גבוהה דפוס פסים עם אדי מים שמקורם הנמל ריח; ii) ניגודיות גבוהה דפוס פסים עם ריח אדי אטרקטיבי; iii) פס אנכי אחד לקזז 90 מעלות מתוך הנחיר אדי מים וכן iv) תואר יחיד 90 לקזז פס עם אדי הריח. מניסיוננו, 30 מרווחי second לעבוד גם עבור ניסויים שבהם זבובים מאותגרים לאתר את מקור הריח בכוחות עצמם. אנו רוכשים וידאו Hz 30 למשך כל תנאי הניסוי ולנתח את התמונות מחובר באמצעות שגרות תוכנה מותאמת אישית נכתב Matlab (אחד השימושיים ביותר פונקציות מוכללות Matlab הוא regionprops.m אשר מנתחת את המאפיינים גיאומטרי של אליפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בריכוזים גבוהים ריח, ריח שיורית ניתן ושוחררו מהנמל ריח לאחר ריח כבוי. כדי למזער תופעות הזה אולי כדאי ספין לטוס במשך כמה שניות עם פנורמה מסתובב כדי לאפשר למערכת כדי להוציא ממאורותיהם ריח שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוא גם מועיל מבחינה ויזואלית לסובב את לעוף בין טיפולים ניסיוניים (i) לשמור על זבובים מעורב באופן פעיל בניסוי וכדי (ii) לשמור זבובים שנותרו במקום אחד. הניסוי למשל ייתכן הסדר הבא: א) 22 ספין אבחון ראשוני; ii) חמש ספין ביניים השני; ג) עשרים זוג התנאי השני # 1: ד) חמישה ספין ביניים השני; v) עשרים זוג התנאי השני 2. </li></ol> חלק 3: לטוס הנותרים בתוך עננת הריח ניסוי בסיסי השני OMT היא ויזואלית לגרור זבוב לתוך פלומת ריח, באופן מיידי לשנות את התנאים חזותי, ואז למדוד את יכולתה להישאר הפלומה. שוב, שים לב כי כל הניסויים נעשים לחסום אקראי פורמהלא כדי למזער את ההטיה כדי הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לעוף טרי קשור בזירה בעזרת זוג מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לסובב (ספין) מספר פעמים לטוס מסביב לזירה לפני כל ניסוי כבדיקה אבחון על מנת להבטיח כי בעל החיים יש את היכולת לכוון לכל כיוון (ראה פרק 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל תנאי, להפעיל את ריח הניסוי (מים או חומץ) ו חזותית &quot;לגרור&quot; את הזבוב לתוך הפלומה על ידי נדנוד פס אנכי קטן במיקום של הפלומה. זה מנצל את התנהגות קיבעון חזק פס שנצפתה זבובים [4]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לטוס מכוונת כלפי פלומה, להסיר את פס נדנוד ולהציג את התנאים הבאים מדגם חזותי: i) פסים ניגודיות גבוהה פנורמי עם אדי מים (איור 1 א); ii) רקע אחיד עם אדי מים (איור 1 ב); iii) פסים ניגודיות גבוהה פנורמי עם ריח אדי (איור 1C); iv) רקע אחיד עם ריח אדי (1D איור). רוכשת וידאו כמו ב 2.3. הניסוי למשל ייתכן הסדר זורם: i) 22 ספין אבחון ראשוני; ii) חמש תנודה second פס פלומה; iii) עשרים זוג התנאי השני # 1: ד) חמישה תנודה second פס פלומה; v) עשרים זוג התנאי השני # 2 . </li></ol> נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/old/1110_2009_1_22_1/Fig 1.png" alt="איור 1" width="600" height="195" /> איור 1 חלק 1 מסביר כיצד לייעל את תמונות הווידאו OMT. תמונת הווידיאו צריך תצוגה ברורה של הזבוב מוארים על רקע שחור כהה. מדי תמונות בהיר ניתן לשפר על ידי צמצום הפרעות רקע, הפחתת עוצמת נוריות IR, או לכבות את האורות בחדר. אם לטוס מואר כראוי, כדי להתאים את המיקוד של נוריות IR או ויסות העוצמה של נוריות IR עשוי לפתור את הבעיה. חלקים 2 ו -3 מתארים ניסויים פשוטים לביצוע כדי לאמת את הפעולה התקינה של OMT. בכל המקרים, זבוב צריך להיות ויזואלית &quot;נאלץ&quot; (דרך התגובות optomotor) כדי לסובב מספר סיבובים בזירה כדי להבטיח מגוון חלקה המלא של תנועה. בחלק 2 להטיס מאותגרת למצוא פלומה על ריח משלו. כדי לשמור על לטוס עוסקת הניסוי, כדי להפחית את ההשפעה של שחרור ריח שיורית, וכדי לשמור זבובים שמירה יחיד הכותרת לאורך הניסוי, כדאי חזותית לסובב את לטוס לכמה שניות בין הניסויים. זבוב לא צריך למקם פלומה אדי מים במידה משמעותית, צריך תמיד למקם פלומה ריח בנוכחות עשיר רמזים חזותיים פנורמי. בחלק 3 זבוב הוא גרר חזותית ישירות לתוך פלומת ריח תיגר לשמור על הכותרת שלו בתוך פלומת נגד מגוון רחב של רקעים חזותי נייח. אם זבוב הוא נגרר נוצה אדי מים, היא צריכה להפוך במהירות משם. אם זבוב הוא נגרר פלומת ריח ויש רמזים חזותיים מספיק כדי לתווך מעקב חזקים, לטוס יישאר הפלומה.

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>G&#246;tz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Course-control,+metabolism+and+wing+interference+during+ultralong+tethered+flight+in+Drosophila+melanogaster.">Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).</li></ol>

רכישת התמונה עבור מערכת זו מנצלת firewire זול לוח מצלמה ותוכנה נכתב ב-Matlab. תמונות ברורות הן חיוניות להשגת מדויק עקבות נתונים. האסטרטגיות המתוארות לעיל הן שימושיות עבור ניקוי תמונות במערכת זו. מעקב אחר וידאו ההליכים במערכת זו תוארו 1. יתר על כן, מערכת זו יכולה בקלות ל?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Firewire camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1394store.com</td>
<td>Fire-I board camera BW</td>
<td>4.3mm lens no IR coating</td>
</tr>
<tr>
<td>IR LEDs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Black spray paint</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rustoleum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Flat black</td>
</tr>
<tr>
<td>Black flock paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Panel system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>Matlab 2006a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Image acquisition toolbox</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visually mediated odor tracking during flight in drosophila

חרקים מעופפים להשתמש רמזים חזותיים לייצב הכותרת שלהם בזרם הרוח. בעלי חיים רבים בנוסף למסלול ריחות נישא ברוח. ככזה, ייצוב נגד הרוח מעקב ויזואלי של עזרי ישירות מעקב ריח. אבל לעשות אותות הריח ישירות להשפיע על התנהגות מעקב חזותי באופן עצמאי רמזים הרוח? בנוסף, ההתקדמות גנטיקה מולקולרית הריח ואת נוירופיזיולוגיות מוטיבציה רומן מנתח התנהגות כמותיים כדי להעריך את ההשפעה של ההתנהגות (למשל) גנטית ספציפית inactivating מעגלים הפעלת חוש הריח. שינינו מערכת לקשור מגנטי המציאו במקור על ידי לאבזר את הזירה עם צרות הזרימה למינרית נוצות ריח לניסויים חזון. כאן נתמקד ניסויים שניתן לבצע לאחר זבוב הוא קשור והוא מסוגל לנווט בזירה מגנטי. אנו מראים כיצד לרכוש תמונות וידאו אופטימיזציה עבור מדידת זווית הגוף, איך לשפוט מעקב ריח יציבה, ואנו ממחישים שני ניסויים כדי לבחון את ההשפעה של רמזים חזותיים על מעקב ריח.

Watch this Scientific Journal Video about Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila at JoVE.com

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

כאן אנו מתארים כיצד לייעל את תמונת וידאו שנרכשו עבור לקשור מגנטי מנגנון ההרחה (OMT). כמו כן, אנו מתארים שני הפרוטוקולים מדגם ניסיוני לחקר visuo-הריח היתוך.

ראייה ריח מעקב מתווכת במהלך טיסה ב תסיסנית

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

visually-mediated-odor-tracking-during-flight-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Views.  University of California, Los Angeles. כאן אנו מתארים כיצד לייעל את תמונת וידאו שנרכשו עבור לקשור מגנטי מנגנון ההרחה (OMT). כמו כן, אנו מתארים שני הפרוטוקולים מדגם ניסיוני לחקר visuo-הריח היתוך.

Video: Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

מערכת מגנטית לקשור לחקור חזותית חוש הריח בקרת טיסה מתווך תסיסנית

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight muscles (IFMs) of flies, specifically the dorso-longitudinal muscles (DLM), as the experimental subject to measure the atrophic phenotype brought about by different genetic causes. In this protocol, we describe how to embed fly thorax muscles for semi thin sectioning, how to obtain a good contrast between muscle and the surrounding tissue, and how to process optical microscope images for semiautomatic acquisition of quantifiable data and analysis. We describe three specific applications of the methodological pipeline. First, we show how the method can be applied to quantify muscle degeneration in a myotonic dystrophy fly model; second, measurement of muscle cross-sectional area can help to identify genes that either promote or prevent muscle atrophy and/or muscle degeneration; third, this protocol can be applied to determine whether a candidate compound is able to significantly modify a given atrophic phenotype induced by a disease-causing mutation or by an environmental trigger.

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

We report a method to quantify muscle area, which is an indirect method to determine muscle mass in Drosophila adults. We demonstrate the application of our methodology by analyzing the indirect flight muscles in a Drosophila model of Myotonic Dystrophy disease.

קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...