עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG027818 ו AG030709 מ-NIH / NIA, 2005/2E מן ל לארי Hillblom קרן, IIRG-07-58334 של איגוד האלצהיימר, 07-65798 מקליפורניה המחלקה לבריאות הציבור.

1. פפטיד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את ~ 100-200 מיקרוגרם של הפפטיד lyophilized באמצעות microbalance ולהעביר לתוך שכותרתו, סיליקון מצופה, בעלי כושר ספיגה נמוך צינורות microfuge. כאן, אנו משתמשים רצפים האדם של Aβ40, Aβ42, קלציטונין, ואת פוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, אנו משתמשים פפטידים מראש שטופלו 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) כדי להשיג הומוגניות, במצטבר ללא הכנות. צעד זה הוא הכרחי משום מראש יצרו אגרגטים לגרום להצטברות מהירה של חלבונים amyloidogenic, אשר התוצאה reproducibility העניים בקרב ניסויים 5. שיטות אחרות כגון סינון ה-SEC גם יכול לשמש כדי להשיג המצרפי ללא ההכנות PICUP 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטפל פפטידים עם HFIP, טרום הקור מיכל HFIP על הקרח בתוך ברדס קטר לבוש הגנה נאותה (HFIP הוא נדיפים רעילים). קירור של בקבוק 250 מ&quot;ל מחייב בדרך כלל 10-15 דקות. הוסף HFIP מראש צונן צינורות המכיל lyophilizates פפטיד לקבל ריכוז הפפטיד נומינלית של 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הפתרונות פפטיד sonicator מים באמבט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס בעדינות דגירה צינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הצינורות על הקרח (דקות 1), ולחלק את פתרונות ל 10-50-μl aliquots שכותרתו ב 0.6-מ&quot;ל נמוך צינורות בעלי כושר ספיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HFIP על ידי אידוי תחת זרם עדין של חנקן, או לעזוב את צינורות פתוחים בשכונה קטר בן לילה. עבור אידוי לילה, במקום צינורות פתוחים במעמד ומכסים אותם עם סדין גדול של Kimwipes כדי למנוע אבק וזיהום החלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exsiccate HFIP הנותרים האור בריק ב lyophilizer, או concentrator צנטריפוגלי למשך 30 דקות, או exsiccator מצורף כניסת ואקום עבור 2 ח המוצר הסופי יהיה סרט פפטיד בתחתית הצינורות microfuge. אם exsiccated כראוי, צינורות יכול להיות מאוחסן אטום ב -20 או -80 ° C. במשך תקופות ממושכות (חודשים) </li></ol> 2. Solubilizing HFIP שטופלו פפטידים צילום cross-linking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני solubilizing HFIP שטופלו פפטידים עבור cross-linking תגובות, צריך להכין את cross-linking ו ריאגנטים מרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את persulfate אמוניום (APS, מר 228.2 g / mol) ולהכין פתרון 20 מ&quot;מ פוספט 10 mM נתרן, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 מ&quot;מ טריס (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy, מר 748.63 g / mol) ב 10 mM נתרן פוספט, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת לאמת התפרקות מוחלטת. הגן על הצינור מן האור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח SDS-PAGE הבאים cross-linking, מגיב מרווה נוח היא 5% β-mercaptoethanol ב 2 × SDS-PAGE חיץ המדגם. לחלופין, 1 M dithiothreitol (DTT, מר 154.5 g / mol) במים deionized או חיץ מתאים יכול לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HFIP שטופלו סרטים פפטיד הם מומסים לדלל NaOH הראשון ולאחר מכן פוספט נתרן חיץ נוסף כדי לקבל ריכוז הפפטיד ~ 30 מיקרומטר. הוסף 60 mM NaOH ואחריו deionized המים לתוך הצינור המכיל את הסרט פפטיד כזה NaOH מים מהווים 10 ו - 45% מנפח הסופי, בהתאמה. גרדו את הסרט פפטיד מהקירות בתוך צינור microfuge משתמש קצה, על ידי שילוב pipetting למעלה ולמטה, ועל sonicate במשך 5 דקות בתוך sonicator מים באמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 45% 20 mM נתרן פוספט, pH 7.4, לערבב ידי pipetting ו צנטריפוגות ב g 16,000 עבור 10 דקות. מניחים בצד aliquots של uncross צמודות פפטידים מעורבב עם מגיב מרווה עבור פקדי שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המצלמה תריס, עיכוב 1 s. בזמנים קרינה גבוהות יותר, התגובות רדיקלי נרחב עלול לגרום פירוק חלבונים. טען את תריס המצלמה. זמן הקרנה ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה כאשר בשיטת עם חלבון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה PICUP טיפוסי מבוצע בהיקף 20 תגובה μl. העברת 18 μl של הפתרון הפפטיד לתוך צינורית דקה חומה, ברור, PCR 0.2-מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון פפטיד, להוסיף 1 RuBpy μl ואחריו APS 1 μl ומערבבים ריאגנטים ידי pipetting (הריכוז הסופי של RuBpy ו APS בתערובת התגובה תהיה 0.05 ו - 1 מ&quot;מ, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום צינור תגובה בתוך בקבוקון 1.8 מ&quot;ל זכוכית. מניחים את הבקבוקון בתוך מפוח מצורף מול גוף המצלמה. צרף את מגן העדשה ולחץ על תריס כך המדגם הוא מוקרן עבור 1 s בתוך המפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרנת המדגם, מהר לקחת את הבקבוקון מן המפוח ואת הצינור PCR מתוך הבקבוקון. במהירות להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 או 10 μl DTT מדגם μl צמצום מאגר הדפים. חזור על התגובה aliquot כל פפטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובות התגובה כעת ניתן קפוא ב -20 ° C עבור אחסון לא יותר מ 7 ימים או שמרו על הקרח לפני הניתוח על ידי-SDS וכסף-מכתים. </li></ol> 3. SDS-PAGE ו רסיס-מכתיםשל צולבים מוצרים פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שגרה SDS-PAGE ו כסף מכתים מבוצעות לדמיין צולבים פפטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 5 μl מתערובת התגובה לכל נתיב להשיג ~ 130 pmol של הפפטיד לכל נתיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול כמויות דומות של uncross צמודות פפטידים להשוואה. כמו כן כוללים סולם חלבון סטנדרטי עבור אומדן ויזואלי של משקל מולקולרי של להקות פפטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל באמצעות מנגנון סטנדרטי ג&#39;ל אלקטרופורזה. אנו משתמשים SureLock XCell Mini-Cell המערכת Invitrogen ולבצע כסף מכתים לפי Invitrogen פרסום IM-1002, Novex טרום יצוקה ג&#39;ל אלקטרופורזה מדריך. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג (איור 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="איור 1" /> איור 1: כסף מוכתם ג&#39;לים polyacrylamide מראה uncross צמוד (-) ו צילום צולבים (+) פוי, קלציטונין, Aβ40 ו Aβ42 SDS-PAGE ו כסף מכתים ניתוח PICUP שנוצר Aβ40 oligomers להראות בעוצמות הלהקה דומה של כ מונומר דרך tetramer, ואחריו לירידה חדה שפע oligomers גבוה 7. Uncross צמודות Aβ40 נודד עם מר בקנה אחד עם זה של מונומר 7. Aβ42 מראה חלוקה ברורה גודל oligomer. Aβ42 oligomers מהווים 2-3 קבוצות 8. הקבוצה הראשונה, מונומר דרך trimer, מציג ירידה באינטנסיביות עם סדר oligomer גוברת. בקבוצה השנייה, הפצה גאוס כמו שנצפה בין tetramer ו heptamer, עם מקסימום ב pentamer ו hexamer. הקבוצה השלישית, אשר אינו מוצג כאן, מכיל oligomers של מר ~ 30,000-60,000 דה 8. Oligomers אלה גבוהה בדרך כלל מר הם נצפו באמצעות ה-SEC, מבודדות LMW Aβ42 אך לא פפטיד שהוכן על ידי סינון או טיפול HFIP 6. Uncross צמודות Aβ42 מייצרת בעיקר שתי להקות, להקה מונומר ותזמורת רחב trimer / tetramer, המהווה artefact המושרה על ידי SDS 5,9. קלציטונין התשואות גודל oligomer הפצה חזק סוטה מירידה מעריכי מונוטוני ב מונומר את האזור באמצעות tetramer, מה שמרמז מראש קיומה של הדימרים, trimers, ו tetramers 7. השליטה פוליפפטיד, פוי, מייצר הפצה oligomer מונוטונית החל dimer דרך hexamer כזה כמויות יחסית לכאורה של oligomers ירידה אקספוננציאלית עם הגדלת המסה המולקולרית. בניסויים אחרים, oligomers גבוה גם יכול להיות 7 דמיינו. המספר המדויק ואת עוצמות היחסי של להקות oligomer עשוי להשתנות מעט בין ניסויים תלוי בריכוז החלבון בפועל, את כמות החלבון טעון על הג&#39;ל, והזמן המשמש בשלב פיתוח פרוטוקול כסף מכתים.

<ol>
	<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li><li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions&#8212;a+review+with+illustrative+protocols.">Chemical cross-linking and protein-protein interactions&#8212;a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li><li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+chemistry+and+biology:+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes.">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li><li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+protein+oligomers&#8212;what+you+see+is+not+always+what+you+get.">Neurotoxic protein oligomers&#8212;what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aggregate-free,+low+molecular+weight+amyloid-&#946;+for+assembly+and+toxicity+assays.">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-&#946; for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li><li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+oligomerization:+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Amyloid &#946;-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li><li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+(A&#946;)+assembly:+A&#946;40+and+A&#946;42+oligomerize+through+distinct+pathways.">Amyloid &#946;-protein (A&#946;) assembly: A&#946;40 and A&#946;42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li><li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+state+characterization+of+amyloid+&#946;-derived+diffusible+ligands.">Solution state characterization of amyloid &#946;-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+photochemical+cross-linking&#8212;a+new+tool+for+studies+of+metastable,+amyloidogenic+protein+assemblies).">Rapid photochemical cross-linking&#8212;a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li><li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions.">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li><li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+events+of+&#945;-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking.">The early events of &#945;-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li><li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking.">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li></ol>

PICUP פותחה במקור כדי ללמוד קומפלקסים חלבונים יציב 2. השיטה יושמה מאוחר ללמוד כמותי של metastable החלבון עמילואיד מכלולים, כולל 10 Aβ, הפריון ומחלות הקשורים PRP Sc 11, ו - α-synuclein 12. הגורמים החשובים ביותר כי יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון הניסוי PICUP הם stoichiometry מגיב, זמן הקרנה...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp</td>
<td>Other</td>
<td>Dolan-Jenner Industries</td>
<td>Model 170-D</td>
<td>The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods.</td>
</tr>
<tr>
<td>35-mm SLR camera body</td>
<td>Tool</td>
<td>Pentax</td>
<td>SP500 model</td>
<td>In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source.</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear, thin walled PCR tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>951010006 supplied by Fisher L22-003-24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials (1.8 mL)</td>
<td>Other</td>
<td>Kimble Chromatography</td>
<td>60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GRF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Bachem</td>
<td>H-3695</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HFIP</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>H0424</td>
<td>Use in a fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>A&beta;40 and A&beta;42</td>
<td>Reagent</td>
<td>UCLA Biopolymers Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcitonin</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Peptide</td>
<td>22-1-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>224758-1G</td>
<td>Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-7460</td>
<td>Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. </td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M7154-25 ML</td>
<td>Can be used when SDS-PAGE analysis is performed.</td>
</tr>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine Gels (10-20%)</td>
<td>Other</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC6625B0X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver Express Staining Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6100</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photo-induced cross-linking of unmodified proteins (picup) applied to amyloidogenic peptides

הרכבה של חלבונים amyloidogenic לתוך oligomers רעילים הינה אירוע מכונן בפתוגנזה של מחלות misfolding חלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, ומחלות של הנטינגטון, תורשתיות טרשת לרוחב amyotrophic, וסוכרת מסוג 2. בשל אופי metastable של מכלולים אלה חלבון, קשה להעריך את גודל oligomer שלהם הפצה כמותית תוך שימוש בשיטות קלאסיות, כגון אלקטרופורזה, כרומטוגרפיה, הקרינה, או פיזור אור דינאמי. Oligomers של חלבונים amyloidogenic קיימים תערובות metastable, שבו oligomers לנתק לתוך מונומרים ולשייך לתוך מכלולים גדולים בו זמנית. PICUP מייצב אוכלוסיות oligomer על ידי cross-linking וכאשר בשילוב עם שיטות חלוקה, כגון אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) או גודל הרחקת כרומטוגרפיה (SEC), PICUP מספק תמונות קוולנטיים של הפצות גודל oligomer שהיה קיים לפני צלב -linking. לפיכך, PICUP מאפשרת הדמיה ניתוח כמותי של אוכלוסיות חלבון metastable וניתן להשתמש בו כדי לפקח על הרכבה לפענח את יחסי הגומלין בין השינויים ברצף oligomerization<sup&gt; 1</sup&gt;. באופן מכני, PICUP כרוך צילום חמצון של רו<sup&gt; 2 +</sup&gt; בתוך קומפלקס (bipyridyl) טריס (II) Ru (RuBpy) כדי Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; על ידי הקרנה עם האור הנראה בנוכחות acceptor אלקטרון. רו<sup&gt; 3 +</sup&gt; הוא מחמצן חזק אחד אלקטרונים מסוגלים הפשטה אלקטרון מולקולת חלבון שכנות, יצירת חלבון קיצוני<sup&gt; 1,2</sup&gt;. הרדיקלים אינם יציבים, מאוד-reactive המינים ולכן נעלמים במהירות באמצעות מגוון רחב של תגובות הפנים ו מולקולאריים. רדיקלי יכול לנצל את האנרגיה הגבוהה של אלקטרון מזווג להגיב עם מונומר נוסף חלבון להרכיב dimeric הרדיקלי, אשר לאחר מכן מאבד אטום מימן צורות יציבה, קוולנטית צמודות דימר. Dimer עשויה להגיב אז עוד יותר באמצעות מנגנון דומה עם מונומרים או הדימרים השני כדי ליצור מסדר גבוה oligomers. יתרונות יחסיים PICUP אחרים צילום או כימי cross-linking שיטות<sup&gt; 3,4</sup&gt; כוללים חשיפה קצר (≤ 1 ים) אור שאינו הרסני גלוי, אין צורך<i&gt; מראש פקטו</i&gt; שינוי של רצף מקומיים, באורך אפס קוולנטיים cross-linking. בנוסף, מאפשר PICUP cross-linking של חלבונים בתוך ה-pH רחב טווחי טמפרטורה, כולל פרמטרים פיזיולוגיים. הנה, אנחנו מדגימים יישום PICUP אל cross-linking של שלושה חלבונים amyloidogenic 40 - ו 42-β-שאריות החלבון עמילואיד וריאנטים (Aβ40 ו Aβ42), ו קלציטונין, לבין חלבון שליטה, הורמון גדילה גורם משחרר (פוי).

Watch this Scientific Journal Video about Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides at JoVE.com

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

21.3K Views.  University of California, Los Angeles. תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.

Video: Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

השימוש בMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ומסד נתונים מותאמים אישית לאפיון חיידקים ילידים למערת סביבה ייחודית (Kartchner מערות, AZ, ארה&quot;ב)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...