עבודה זו נתמכה על ידי Research Triangle MRSEC של NSF (DMR-1,121,107).

1. ביטוי ELP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 3 מיליליטר של תקשורת נהדרת מרק סטרילי עם מניית DMSO או מושבה צלחת אגר של E. coli המתאים לביטוי חלבון המכיל את הפלסמיד ELP הקידוד הרצוי תחת שליטה של אמרגן T7-Lac. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O / N) עם רציף רועד בסל&quot;ד 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תרבות O / N ל1 ליטר של מדיה סטרילי נהדר מרק בבקבוק 4 L-. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 24 עם רציף רועד בסל&quot;ד 200. הערה: הביטוי &quot;הדולף&quot; נקודת ההתחלה ראה עם אמרגן T7-Lac הוא מספיק לביטוי ברמה הגבוהה של ELPs רבים, אם התרבות היא טופח במשך 24 שעות. עם זאת, ניתן להשתמש בגישה קונבנציונלית יותר, שבו ביטוי חלבון מושרה עוד יותר על ידי התוספת של 0.2-1 מ&quot;מ איזופרופיל-beta-D-thiogalactoside (IPTG) כאשר הצפיפות האופטית של התרבות מגיעה 0.6. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרבות מהבקבוק 4 L-לבקבוק צנטריפוגות 1-L ו צנטריפוגות ב 4 ° C למשך 15 דקות ב 2,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. שים לב: אם L יותר מ 1 של התרבות הוא גדל הם יכולים להיות מרוכזים על ידי הוספת ליטר נוסף של תרבות לגלולה וחוזר על שלב 1.3. עד 2 ליטר של התרבות יכול להיות מרוכז לגלולת תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בופר פוספט (PBS), מים, או חיץ רצוי אחר להגיע 45 מיליליטר של השעיה תא והעברת צינור חרוטי 50 מיליליטר. </li></ol> 2 טיהור ELP:. ראשוני צעדים והסיבוב הראשון של הופכי מעבר רכיבה על אופניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התא גלולה resuspended עבור סכום כולל של 9 דקות במחזורים של 10 שניות &#39;על&#39; ו &#39;כבויה&#39; 20 שניות בתפוקת חשמל של 85 W, תוך שמירה על המדגם על קרח. בקצרה לאפשר את המדגם כדי לצנן על קרח ולאחר מכן לחזור על מחזור 9 דק &#39;עוד פעם אחת. הערה: אם ELP צפוי לי t T נמוך מאוד </תת&gt; המרווח &#39;כבוי&#39; יכול להיות מוגבר עד 40 שניות, כדי למנוע חימום של התמיסה מעל t T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate ל50 מיליליטר עגול צינור צנטריפוגות תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של 10% (w / v) polyethyleneimine (PEI) עבור כל ליטר של התרבות ולנער כדי לערבב. הערה: PEI הוא פולימר טעון חיובי שמסייע בעיבוי של מזהמים גנטיים טעונים שלילי. אל תבצע שלב זה אם ELP טעון שלילי, כמו PEI יכול גם להתעבות ולהסיר את מוצר ELP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב C ° 4 10 דקות ב 16,000 X גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לנקי 50 מיליליטר עגול צינור צנטריפוגות תחתון וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי &quot;לאפות את&quot; צעד: דגירה המדגם ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפגל מזהמים חלבון ולאחר מכן להעביר ל4 ° C או לקרח עד ELP הוא resolubilized לחלוטין. צנטריפוגה המדגם ב C ° 4 10 דקות ב 16,000 X גרם. מעביר את supernatant לCL50 מיליליטר EAN עגול צינור צנטריפוגות תחתון וזורקים את הכדור. הערה: אין לבצע שלב זה אם פפטיד או חלבון הוא קבע את ELP וצפוי לפגל במצב של חום גבוה. זה עלול לגרום למעבר ELP להפוך לחום בלתי הפיך או יכול להרוס את הפעילות של מחצית התמזגו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום למעבר ELP עם התוספת של NaCl גבישים (שלא יעלה על 3 מ &#39;). לחלופין, ציטרט הנתרן (שלא יעלה על 0.3 M) יכול לשמש לELPs שיש לי T גבוה יותר T S או תשואות נמוכות. הערה: הפתרון צריך להפוך מעונן פעם מלח נמס, המציין את הפרדת פאזות של ELP מפתרון. ELPs מאוד הידרופילי עם ים לא גבוה T עשוי לדרוש מידה מסוימת של חימום, בשילוב עם התוספת של מלח, כדי לגרום להפרדת פאזות של ELP באינדוקציה ראשונית זה של מעבר ELP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בtemperatue החדר (RT) 10 דקות ב XG 16,000 (ספין חם). הערה: גלולה ELP צריכה bדואר ציין, גודלם תלוי בתשואת הביטוי של ELP. גלולה ELP זו עלולה להופיע בהתחלה אטומה, אבל לאחר הקירור היא תופיע שקופה ועשויה להיות בצבע חום. גלולה ELP תהפוך חסרת צבע יותר כתמורה לטיהור ומזהמים יוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולהוסיף 1-5 מיליליטר של חיץ רצוי לגלולה. Resuspend את הכדור על ידי pipetting או הגדרת הצינור כדי לסובב ב 4 ° C. הערה: הנפח הנדרש של חיץ יהיה תלוי בגודל של גלולה ELP, ולכן התשואה של ביטוי ELP, שבו כמות מספקת של חיץ יש להוסיף כדי לאפשר resolubilization של גלולה ELP. ELPs עם תוכן ציסטאין תועלת גבוה מטיהור במים עם 10 מ&quot;מ טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP-HCl) ב-pH 7 לחסל אינטראקציות דיסולפיד עם חלבונים מזהמים. ELPs עם תוכן תשלום גבוה תועלת מטיהור ב-pH המותאם לנטרול תשלום שלהם ולהפחית את eleאינטראקציות ctrostatic עם חלבונים מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון ELP המושעה זה ב1 aliquots מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge 1.5-מיליליטר נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 10 דקות ב XG 16,000 (ספין קר). גלולה קטנה של מזהמים מסיסים יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור נקי וזורקים את הכדור. </li></ol> . 3 טיהור ELP: סיבובים עוקבים של הופכי מעבר רכיבה על אופניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום למעבר ELP עם חום ו / או התוספת של NaCl. ניתן מודגרות דגימות על גוש חום או באמבט מים במשך 15 דקות בטמפרטורה מעל t T. אם, לעומת זאת, ELP הוא קבע את חלבון (המונע שימוש בחום) או אם ELP יש לא גבוה T שלא ניתן להגיע אליו עם חום לבד, פתרון 5 M של NaCl ניתן להוסיף טיפה חכמה כדי לגרום מעבר ELP. הערה: הפתרון צריך להפוך מעונן, המציין את הפרדת פאזות של ELP מפתרון. </li><li&gt; צנטריפוגה 10 דקות ב XG 16,000 (ספין חם). אם חום היה בשימוש בשלב 3.1, לבצע שלב זה צנטריפוגה בטמפרטורה מעל מה שנדרש כדי לגרום למעבר ELP. אם NaCl לבד היה בשימוש בשלב 3.1, לבצע שלב זה צנטריפוגה ב RT. הערה: גלולה ELP צריכה להיות שנצפתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, להוסיף 500-750 μl של חיץ רצוי וresuspend את הכדור על ידי pipetting או הגדרת הצינור כדי לסובב ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 10 דקות ב XG 16,000 (ספין קר). גלולה קטנה של מזהמים מסיסים יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור נקי וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.5 עד אין גלולה מזהם הוא ציין במהלך שלב 3.4. </li></ol> 4. עיבוד פוסט טיהור (אופציונלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, dialyze המדגם נגד חיץ מתאים כדי להסיר עודף מלח מפתרון ELP מטוהר. הערה: ELPs להיות lyophilized צריך להיותdialyzed נגד DDH 2 OO / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, Lyophilize ELP עבור אחסון לטווח ארוך על ידי הקפאת הפתרון ב-80 ° C ל30 דקות לפני lyophilizing O / נ הערה: אין להשתמש בlyophilization לELPs עם חלבונים מצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לשחזר פפטיד או חלבון חופשיים מהיתוך ELP פפטיד או חלבון על ידי הסרת תגית ELP: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את היתוך ELP פפטיד או חלבון עם פרוטאז biotinylated (כפי שהומלץ על ידי ספק פרוטאז) או עם פיוז&#39;ן ELP פרוטאז המתאים לאתר פרוטאז תוכנן גנטי בין פפטיד או החלבון וELP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ישים, הסר את פרוטאז biotinylated באמצעות חרוזים שונה streptavidin (כפי שהומלץ על ידי ספק פרוטאז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום למעבר של ELP ביקע ו / או היתוך ELP פרוטאז על ידי תוספת הטיפה חכמה של פתרון 5 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RT 10 דקות ב 16,000 X גרם. הערה: גלולה ELP צריכה להיות שנצפתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לאסוף את supernatant וזורקים את כדור ELP. Dialyze supernatant נגד חיץ רצוי או להשתמש במסנן צנטריפוגלי לבצע חילופי חיץ על מנת להסיר את ריכוז מלח הגבוה מהפפטיד הטהור או פתרון חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את המחשוף של פפטיד בחינם או חלבון מתג ELP ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide נתרן גופרתי dodecyl (SDS-PAGE) המלא. </li></ol></li></ol> 5 אפיון:. SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות ELP עבור-SDS ​​על ידי ערבוב 10 μl של ELP מדולל במים עם 10 μl של חיץ מדגם המכיל 2-mercaptoethanol. הערה: 40 מיקרוגרם של ELP הוא לעתים קרובות מספיק כדי להעריך את הגודל וטוהר של מוצר ELP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם ב C ° 100 למשך 2 דקות ולאחר מכן לטעון על ג&#39;ל polyacrylamide יחד עם סולם חלבון בגודל מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל על 180 V עד הצבע מתקרב לתחתית הג&#39;ל (כ 45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתםג&#39;ל עם פתרון 0.5 M CuCl 2 במשך 5 דקות, תוך נדנדה. הערה: ELPs בדרך כלל לא דמיינו ידי כתם הכחול מבריק Coomassie, כמו כמה רצפי ELP לא אינטראקציה עם הצבע הזה. כחול מבריק Coomassie אינטראקציה בעיקר עם שאריות ארגינין ואינטראקציה חלשה עם שאריות-היסטידין האחר בסיסי ושאריות טריפטופן-ליזין וארומטי, טירוזין, פנילאלנין ו26. כך ELPs והתכת פפטיד או ELP החלבון יכולים להיות מוכתמת בכחול מבריק Coomassie רק אם הרצף העיקרי שלהם כולל מספר מספיק של שאריות הספציפיות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שMW של להקת ELP תואם לזה של MW התיאורטי צפוי מגן ELP ושאין להקות מזהמים זרות נוכחים. הערה: ELPs חלק להגר עם MW לכאורה גבוה יותר עד 20% מ MW הצפוי 9, 27. </li></ol> 6 אפיון:. Desorption לייזר בסיוע מטריקס /יינון זמן של טיסת ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF-MS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ELP ב50% אצטוניטריל מימיים המכיל 0.1% חומצת trifluoroacetic כדי להשיג ריכוז ELP של כ 25 מיקרומטר. הערה: פתרון זה צריך להיות חופשי של מלח, כך ELP חייב להיות dialyzed נגד H 2 O הבא טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מטריצה ​​של חומצת sinapinic רוויה ב50% אצטוניטריל מימיים המכיל 0.1% חומצת trifluoroacetic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של פתרון ELP עד 9 μl של פתרון המטריצה ​​כדי להשיג ריכוז ELP של כ 2.5 pmol / μl. הערה: תערובת זו יכולה להיות מדוללת עוד יותר עם פתרון מטריצה ​​כדי לייעל את אות MALDI-TOF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדת 1-2 μl תערובת ELP מטריצה ​​על צלחת MALDI מתכת ולתת למקום להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 5-10 ספקטרום עם MALDI-TOF כדי לקבוע את המסה לחייב יחס (m / z) של ELP ולהסיק MW המדוד. </li></ol> 7. Characterization: Turbidimetry ופיזור אור דינאמי מתוכנתת טמפרטורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את t T של ELP ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סדרת דילול (למשל, 5-100 מיקרומטר) של פתרונות ELP במאגר הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות UV-Vis ספקטרופוטומטר בטמפרטורה מבוקרת, למדוד את הצפיפות האופטית (OD) ב350 ננומטר על פני טווח של טמפרטורות (למשל, 20-80 מעלות צלזיוס) בקצב חימום של 1 ° C / min. הערה: אם אין עלייה בקוטר חיצוני נראית t T עשוי לחרוג ממגבלת הטמפרטורה העליונה של המכשיר. T T לכאורה יכול להיות ירידה על ידי התוספת של NaCl. מתחיל ב 1 M NaCl ולהגדיל בקפיצות של 0.5 M עד מעבר ELP הוא זוהה בטווח טמפרטורות הניתן למדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא הפיכות של מעבר ELP ידי מדידת הירידה בקוטר חיצוני על אותו הטווח של טמפרטורה בקצב קירור של 1 ° C / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את t T של ההומופולימר ELP ידי זיהוי הנקודה של פרופיל עכירות הפיתול (OD זמם לעומת טמפרטורה). הערה: טמפרטורה זה יכול להיות מוגדר בקלות מהנגזרת של עקומת OD, שבו הטמפרטורה המתאימה למקסימום של הנגזר מוגדרת כt T. ארכיטקטורות ELP יותר מורכבות יציגו פרופילי עכירות מסובכים יותר וצריכה להיות מנותחות נוסף כמפורט בסעיף 7.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיון נוסף של ELPs המציגים תכונות מורכבות יותר תרמית (לדוגמא, קופולימרים diblock ELP עצמיים להרכיב לתוך מיצלות הכדורית) מושגת על ידי פיזור אור הדינמי (DLS): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ELP במאגר הרצוי ולהעביר את הדגימה דרך מסנן עם גודל נקבובית ננומטר 20-450. הערה: הבחירה של גודל נקבובית מסנן תהיה תלויה בנוכחות, הגודל, והיציבות של כל מכלולי ELP בתמיסה. הגודל הנקבובית מסנן האפשרי הקטן ביותר הוא העדיף לחסל את מזהמים, כגוןאבק, הפוגע באיכות של מדידות DLS. יש להשתמש בגודל נקבובית מסנן גדול יותר כאשר התנגדות משמעותית חווה כאשר עובר דרך פתרון ELP גדלים נקבוביות מסנן קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הרדיוס הידרודינמית (R H) על פני טווח של טמפרטורות שמתאים לאזור של עניין שזוהה בפרופיל העכירות. הערה: יש לי unimers ELP בדרך כלל H R &lt;10 ננומטר, יש לי מכלולי nanoparticle H R ~ 20-100 ננומטר, ויש מצרפים R H&gt; ננומטר 500. כל עלייה בR H צריכה מתאימות לגידול בOD ב 350 ננומטר שנמדד על ידי UV-Vis spectrophotometry כפונקציה של טמפרטורה, שהיא פרופורציונלית לגודל של החלקיקים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Chemistry+of+Biological+Free+Energy+Transduction+As+Demonstrated+by+Elastic+Protein-Based+Polymers.">Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers.</a> J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).</li><li>Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+elastin-like+protein+in+pichia+pastoris.">Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).</li><li>Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+production+of+an+elastin-like+polypeptide+by+Pichia+pastoris.">Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).</li><li>Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+elastin-like+polypeptides+with+different+transition+temperatures+by+Pichia+pastoris.">Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).</li><li>Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+synthetic+protein-based+polymer+(elastomer)+gene+in+Aspergillus+nidulans.">Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).</li><li>Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+elastin-like+polypeptide+fusions+for+expression+and+purification+of+recombinant+proteins+in+plants.">Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).</li><li>Conrad, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELPylated+anti-human+TNF+therapeutic+single-domain+antibodies+for+prevention+of+lethal+septic+shock.">ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock.</a> Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).</li><li>Kaldis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+human+interleukin-10+fusions+in+tobacco+cell+suspension+cultures.">High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures.</a> Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).</li><li>McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recursive+directional+ligation+by+plasmid+reconstruction+allows+rapid+and+seamless+cloning+of+oligomeric+genes.">Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes.</a> Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).</li><li>Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+parallel+method+for+synthesizing+DNA+repeats+enables+the+discovery+of+'smart'+protein+polymers.">A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers.</a> Nat Mater. 10, 141-148 (2011).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+effects+of+chain+length+and+concentration+on+the+thermal+behavior+of+elastin-like+polypeptides.">Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+of+Polypeptide+Inverse+Temperature+Transition+Depends+on+Mean+Residue+Hydrophobicity.">Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity.</a> Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+change+in+Gibbs+free+energy+for+hydrophobic+association+-+Derivation+and+evaluation+by+means+of+inverse+temperature+transitions.">The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions.</a> Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hofmeister+anions+on+the+phase+transition+temperature+of+elastin-like+polypeptides.">Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides.</a> The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).</li><li>Kim, B., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+actuation+of+inverse+phase+transition+of+a+stimulus-responsive+fusion+polypeptide+by+ligand+binding.">Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding.</a> J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).</li><li>Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+peptide+motifs+from+calmodulin+confer+divalent+ion+selectivity+to+elastin-like+polypeptides.">Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).</li><li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides:+biomedical+applications+of+tunable+biopolymers.">Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers.</a> Biopolymers. 94, 60-77 (2010).</li><li>McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+solid+tumors+by+elastin-like+polypeptides.">Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).</li><li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins.">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. , (2010).</li><li>Shamji, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+fusion+protein+between+thermally+responsive+elastin-like+polypeptide+and+interleukin-1+receptor+antagonist:+sustained+release+of+a+local+antiinflammatory+therapeutic.">Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic.</a> Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).</li><li>Hassouneh, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+multivalent+display+of+proteins+by+temperature+triggered+self-assembly+of+elastin-like+polypeptide+block+copolymers.">Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers.</a> Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).</li><li>Lan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+nonchromatographic+method+for+the+purification+of+recombinant+proteins+using+elastin-like+polypeptide-tagged+proteases.">An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases.</a> Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).</li><li>Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-in-one+chromatography-free+purification,+tag+removal,+and+site-specific+modification+of+recombinant+fusion+proteins+using+sortase+A+and+elastin-like+polypeptides.">Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides.</a> Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

ELPs מציע אמצעי זול ונטולת כרומטוגרפיה של טיהור על ידי ניצול של גירוי תגובה שלב ההתנהגות שלהם. גישה זו מנצלת את LCST ההתנהגות של ELPs והתכת פפטיד או חלבון ELP לחסל שני מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים לאחר הביטוי של ELPs מקודד גנטי בE. coli. קלות זו של טיהור יכולה לשמש לייצור ELPs עבור מגוון רחב של יישומים, או יכולה להיות מנוצלת לטיהור של פפטידים או חלבונים רקומביננטיים שבELP יכול לשמש תג טיהור שניתן להסיר עם עיבוד פוסט טיהור. טיהור ELP כרוכה שלבים ראשוניים לlyse E. coli ולהסיר שאריות של תאי גנומי ובלתי מסיסים מlysate התרבות הגולמי (איור 1), ואחריו הסרת מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים שיורית על ידי ITC (איור 2). צנטריפוגה לאחר מפעילה את מעבר ELP ידי addition של חום או מלח מפריד ELP ממזהמים מסיסים בsupernatant, בצעד המכונה חם ספין. לאחר resolubilizing ELP, הפתרון הוא centrifuged שוב בטמפרטורה מתחת t T כדי להסיר את גלולה המזהם מסיסה, בצעד המכונה ספין קר. לסירוגין ספינים חמים וקרים משפר את טוהר פתרון ELP עם כל מחזור, במחיר קטן להניב. תשואות טיהור להשתנות תלוי לא ELP T, האורך, ופפטידים או חלבונים התמזגו. בדרך כלל, פרוטוקול זה תשואות של ELP מטוהר 100 מ&quot;ג לליטר E. תרבות coli, לעומת זאת תשואות יכולות להגיע עד 500 מ&quot;ג / ל &#39; טוהר הסופי של מוצר ELP אושר על ידי-SDS (איור 3). מגה וואט של ELP המטוהרים צריכים להתאים עם MW התיאורטי המקודד על ידי גן ELP מקרוב. עם זאת, כמה ELPs להעביר ב- SDS עם MW לכאורה גבוה יותר עד 20% מ MW הצפוי 9, 27. ניתוח מדויק יותר של ELPיכול להיות מושגת על ידי MW MALDI-TOF-MS, אשר יכול גם לספק מידע נוסף על טוהר של מוצר ELP יחד עם טכניקות אנליטיות המאונכות כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). לאחר טיהור, לא ELP T נמדד על ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה. טכניקה זו מנטרת את OD של פתרון ELP בעוד הטמפרטורה היא גדלה. T T הוא ריכוז תלוי ולכן רצוי לאפיין סדרת ריכוז רלוונטית ליישום המיועד של ELP. לELP homopolymers פרופיל העכירות מציג גידול חד חד שמתאים למעבר ELP מאגרגטים למיקרון בקנה מידת unimer (איור 4 א). T T מוגדר כטמפרטורה המתאימה לנקודת הפיתול בפרופיל העכירות, בדיוק כפי שנקבעה המקסימום של הנגזרת הראשונה של OD ביחס לטמפרטורה. ההפיכות שלשלב מעבר ELP אושר על ידי ירידה בOD לבסיס ככל שהטמפרטורה יורדת מתחת לt T (איור 4). פרופיל העכירות עם גדלה או קטן של רמפות טמפרטורה יהיה שונה בגודל וקינטיקה עקב שיקוע של coacervates ELP וhysteresis המשתנה של resolubilization ELP. התכה פפטיד או ELP החלבון דומה להפגין התנהגות LCST בדרך זו, בי פפטיד או החלבון התמזגו ELP משפיע t T. לחלבון ELP התכה המעבר הוא הפיך מתחת לטמפרטורת ההתכה של החלבון. בעוד turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה היא שיטה מצוינת לאפיון התרמי הראשוני של מוצרי ELP, טכניקות חלופיות, כגון פער ​​הסריקה calorimetry (DSC), יכול לשמש גם כדי למדוד את לא ELP T. ELPs עם התנהגויות תרמית תערוכת ארכיטקטורות מורכבות יותר מורכבות יותר שיכול גם להיות מאופיינת בטמפרטורת prograturbidimetry mmed. קופולימרים diblock ELP, למשל, מציגים פרופיל עכירות אופייני המתאים להרכבה העצמית מופעל על הטמפרטורה שלהם למיצלות הכדורית בטמפרטורת micellization הקריטית שלהם. לקופולימרים diblock ELP כגון OD מגדיל 0.1-0.5 יחידות מעל בסיס המציינות את המעבר מunimers למיצלות, לאחר שעלייה חדה בOD (עד 2.0 יחידות מעל הבסיס) בטמפרטורה גבוהה יותר מצביעה על היווצרות של מיקרון בקנה מידה בדרך כלל ראשון אגרגטים (איור 5 א). מידע נוסף על מבני ELP עצמיים התאסף-מופעל על טמפרטורה שהושג עם DLS, טכניקה המודדת את H R של מכלולי ELP בתמיסה. שינויים בR H מסכימים עם שינויים בOD נמדדו עם turbidimetry (איור 5) באופן הדוק. unimers ELP בדרך כלל מפגין H R &lt;10 ננומטר בעוד מכלולי nanoparticle תערוכת H R ~ 20-100 ננומטר ואגרגטים תערוכה H R </suב &gt;&gt; 500 ננומטר. מידע נוסף על חלקיקי ELP עצמי התאספו, כגון מספר צבירה ומורפולוגיה, ניתן להשיג על ידי פיזור אור סטטיים או במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קריוגני 17, 23, 29. בשל tunability של תכונות תרמיות ELP, מגוון של T T מתקבל על ידי עיצובי ELP שונים. חשוב לזכור כי לא T הגלום תשפיע על אופטימיזציה של פרוטוקול הטיהור עבור כל ELP, שבו ים לא T נמוך מאוד או גבוה ידרוש רוב השינוי לפרוטוקול הסטנדרטי הזה. ELPs עם מעבר לטמפרטורות גבוהות במיוחד עלולה להיות בלתי מתאים לטיהור עם גישה זו. אם העיצוב של ELPs רומן והתכת פפטיד או ELP החלבון עלול לפגוע בתגובת התרמית של ELP, תג היסטידין פשוט יכול להיכלל לטיהור חלופית על ידי זיקת כרומטוגרפיה מתכת משותקת. בנוסף,מאפיינים של רצף ELP עשויים לדרוש שינוי של פרוטוקול זה אם שאריות האורח טעונה. מניפולציה של ה-pH החיץ יכולה לשמש כאמצעי לשנות את תשלום הכולל של ELP במאמץ לחסל את האינטראקציות אלקטרוסטטיות עם מזהמים 17. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים לנסיבות המיוחדות של התכה ELP עם פפטידים וחלבונים כאשר אמצעים מתאימים ננקטו כדי להבטיח את תהליך הטיהור לא להפריע לפעילות של מחצית התמזגו. הערות לאורך כל הפרוטוקול על שינויים כאמור לשרת לכוון את הטיהור של ELPs שעלול להציג אתגרים אלה ביחס לt T, פריצה, או חששות היתוך. טיהור ELPs באמצעות LCST התנהגותם מציגה גישה פשוטה ונטולת כרומטוגרפיה לטהר את רוב ELPs והתכת פפטיד או ELP החלבון מתבטא בE. coli. הפרוטוקול סיכם כאן מתיר o טיהורו ELPs ביום אחד תוך שימוש בציוד המשותף למרבית מעבדות הביולוגיה. הקלות של טיהור ELPs והשילובים שלהם, אנו מקווים, לעודד גיוון ההולך וגדל של עיצובי ELP עבור יישומים חדשים במדע חומרים, ביוטכנולוגיה, ורפואה.

פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) הם biopolymers המורכבת מVPGXG pentapeptide החוזר שבו X, שאריות האורחים, היא כל חומצת אמינו מלבד פרולין. טמפרטורת פתרון קריטית נמוך תערוכת ELPs (LCST) מעבר התנהגות שלב, כך שפתרון ELP הומוגנית יפריד לשני שלבים על חימום לLCST, הנקרא הטמפרטורה ההפוכה המעבר (t T) בספרות ELP 1 בדרך כלל. שני השלבים מורכבים של שלב מאוד לדלל ELP כדורית ושלב משקע עשיר ELP. המשקע העשיר ELP נוצר על לוח זמנים קצרים על צבירה של רשתות ELP לחלקיקים בגודל של מיקרון כי לאחר מכן להתגבש. התנהגות זו מתרחשת על פני טווח של כמה מעלות צלזיוס, והוא בדרך כלל הפיך, כפתרון הומוגני הוא התאושש לאחר ששב לטמפרטורה מתחת t T. ELPs מסונתזים בדרך כלל בEscherichia coli (E. coli) לכאן ולכאןמ &#39;גן מלאכותי שגבעול לפלסמיד ביטוי. פלסמיד זה הפך לאחר מכן לתוך E. שורת תאי coli שהוא אופטימלי לביטוי חלבון. יש לנו להשתמש באופן בלעדי במערכת וקטור T7-Lac חיית המחמד לביטוי של מגוון גדול של ELPs בE. coli, למרות מערכות ביטוי אחרות בשמרים 2-4, פטריות 5, וצמחים 6-8 יש גם מנוצלים על ידי חוקרים אחרים. מספר גישות קיימות כדי גנטי לבנות גנים ELP חוזר על עצמו, כולל קשירה רקורסיבית כיוונית (RDL) 9, קשירה כיוונית רקורסיבית על ידי שחזור פלסמיד (PRE-RDL) 10, וחפיפת הגברה העיגול מתגלגלת סיומת (OERCA) 11. היכולת להנדס ELPs ברמה הגנטית מעניקה את ההזדמנות להשתמש בטכניקות ה-DNA רקומביננטי ליצור ELPs עם מגוון רחב של ארכיטקטורות (למשל, מונובלוקים, diblocks, triblocks, וכו &#39;), אשר יכול להיות מצורף נוספת עם פונקציונליפפטידים וחלבונים. שליטה ברמה הגנטית גם מבטיחה כי כל ELP בא לידי ביטוי באורך ובהרכב מוכתב על ידי תבנית פלסמיד הגנטית שלו מדויקים, המספק מוצרי biopolymer monodisperse בצורה מושלמת. תכונות התרמיות של כל ELP תלויים בפרמטרים מהותיים לbiopolymer כגון משקלה המולקולרי (MW) ורצף, כמו גם גורמים חיצוניים ובכלל זה הריכוז שלה בפתרון ואת הנוכחות של cosolutes האחר, כגון מלחים. אורכו של ELP 12 והרכב שאריות אורחיה 1, 13, 14 שני פרמטרים מאונך בעיצוב ELP שניתן להשתמש בם כדי לשלוט על t T, שבו שאריות אורח הידרופובי ואורכי שרשרת ארוכים יותר יביאו לים לא T נמוך יותר, ואילו הידרופילי שאריות אורח ואורך שרשרת קצרה יותר לגרום s t T גבוהה יותר. ריכוז ELP הוא ביחס הפוך לt T, שבו הפתרונות של גרלא צריך T נמוך של 12 ריכוז ELP האוכל. הסוג והריכוז של מלחים משפיעים גם לא ELP T, שבו ההשפעה של מלחים מלווה את סדרת הופמייסטר 15. אניוני Kosmotropic (Cl - וגבוה יותר על סדרת הופמייסטר) להפחית את t ELP T וריכוז מלח הגדלת משפר את האפקט הזה. יכולים להיות מכוון פרמטרים פנימיים וחיצוניים אלה כדי להשיג התנהגות תרמית בטווח טמפרטורות יעד שנדרש ליישום ספציפי של ELP. הגירוי מגיב להתנהגות של ELPs שימושית למגוון רחב של יישומים, כולל biosensing 16, 17, הנדסת רקמות 18, ואספקת סמים 19, 20. בנוסף, כאשר ELPs הם התמזגו לפפטידים או חלבונים ברמה הגנטית, ELP יכול לשמש כתג טיהור פשוט לספק שיטה אצווה זולה לטיהור של פפ רקומביננטיגאות ושפל או חלבונים שאינם דורש כרומטוגרפיה 21. שינוי של תהליך הטיהור מבטיח כי הפעילות של פפטיד או החלבון התמזגו ELP נשמר. התכה פפטיד או ELP החלבון יכולה להיות מטוהרת ליישומים בהם תג ELP שימושי 22, 23 או לחלופין, כאשר נדרש פפטיד או החלבון החופשי, אתר הכרת פרוטאז יכול להיות מוכנס בין פפטיד או החלבון וELP. ההסרה של תג ELP אז יכולה להיות מושגת על ידי עיכול עם פרוטאז בחינם או היתוך ELP פרוטאז, שבו האחרונים מספק הקלות נוספות של עיבוד כמו סיבוב של טיהור ELP סופי יכול להפריד את התג ופרוטאז היתוך ELP ELP מפפטיד או היעד חלבון בשלב אחד 24, 25. הפרוטוקול הבא מתאר את הליך הטיהור לELPs והתכת פפטיד או ELP החלבון באמצעות תכונות התרמיות שלהם ודן בטכניקות בסיסיות לאפיוןתגובת התרמית של מוצרי ELP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers חוזר על עצמו כי תערוכת שלב טמפרטורת פתרון מעבר התנהגות קריטית נמוך יותר, קיים unimers מסיס כמתחת לטמפרטורת מעבר אופיינית וצבירה לתוך coacervates מיקרון בקנה המידה מעל לטמפרטורת המעבר שלהם. העיצוב של פוליפפטידים כמו אלסטין-ברמה הגנטית מאפשר שליטה מדויקת של הרצף שלהם ואורך, אשר מכתיב את תכונות התרמיות שלהם. פוליפפטידים דמויי אלסטין משמשים במגוון של יישומים, כולל biosensing, הנדסת רקמות, ואספקת סמים, שבו טמפרטורת המעבר ואדריכלות biopolymer של ELP יכולים להיות מכוונת ליישום הספציפי של עניין. יתר על כן, בשלב מעבר טמפרטורת פתרון הקריטי נמוך יותר ההתנהגות של פוליפפטידים כמו אלסטין-מאפשרת הטיהור שלהם על ידי תגובת התרמית שלהם, כך שcoacervation סלקטיבית שלהם וresolubilization מאפשר את הסרתם של שני מזהמים מסיסים ולא מסיסיםים הבא לידי הביטוי בEscherichia coli. גישה זו יכולה לשמש לטיהור פוליפפטידים כמו אלסטין-לבד או ככלי לטיהור להתכת פפטיד או חלבון שבו יכולים להיות מטוהרים פפטידים רקומביננטי או חלבונים גנטי צירפו תגי פוליפפטיד כמו אלסטין-בלי כרומטוגרפיה. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם ודן בשיטות אפיון בסיסיות על מנת להעריך את התנהגות התרמית של מוצרי פוליפפטיד כמו אלסטין טהורים.

כאן אנו מתארים תוצאות נציג לטיהור והאפיון של homopolymer ELP וקופולימר diblock ELP. בעקבות 24 שעות ביטוי בE. coli, תאים שנאספו על ידי צנטריפוגה וlysed ידי sonication. בדרך כלל, שינוי עדין בצבע מתרחש לאחר sonication, המאשר תמוגה מספיק תאים (איור 1 א). לאחר התוספת של PEI, רכיבים הגנומי ופסולת הסלולר נאספים על ידי צנטריפוגה, הפרדת גלולה גדולה של מזהמים מסיסים מELP המסיסים בsupernatant (איור 1). ELP מטוהר עוד יותר על ידי רכיבה על אופניים הפוכות מעבר (ITC), המנצל את LCST ההתנהגות להפריד ELP ממזהמים הן מסיסים ובלתי מסיסים (איור 2) 28. שלב המעבר של ELP מופעל על ידי התוספת של חום ו / או מלח. תוצאות צנטריפוגה בהיווצרותה של גלולה בחלק התחתון של הצינור שמורכב מELPnd כמה מזהמים בלתי מסיסים (תרשים 1C). זה צעד שמכונה מזהמים מסיסים ספין ומתעלם חמים בsupernatant תוך גלולה ELP נשמרת וresuspended במאגר קר. ELP resolubilized הוא centrifuged שוב ב 4 ° C. זה צעד שמכונה ספין ומתעלם קר גלולה של מזהמים בלתי מסיסים ואילו את supernatant המכיל ELP מסיס נשמרת. חוזר על המחזור לסירוגין ספינים חמים וקרים מגביר את הטוהר של ELP, אבל במחיר של מעט ירידת תשואה, כELP שיורי הוא איבד במהלך כל סיבוב בצינורות צנטריפוגה ועל הטיפים פיפטה ITC. טיהור מוצלחת של ELPs והתכת ELP פפטיד או חלבון אושר על ידי-SDS. aliquots הקטנים נלקחו לאורך כל תהליך הטיהור להדגים את הטיהור המתקדמת של ELP מE. lysate coli. ELP הוא מתבטא ביתר בה גולמי lysate coli ומזהמים להקטין שנינותהסיבובים הרצופים שעות של ITC (איור 3). ELP מטוהר מופיע כלהקה אחת ליד MW התיאורטי החזוי. לא ELP T מאופיין turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה. פרופיל העכירות של homopolymer ELP מציג גידול חד חד בOD ב 350 ננומטר (כ 2.0 יחידות מעל הבסיס לריכוז ELP של 25 מיקרומטר) (איור 4 א). סריקות עכירות קירור לאשר את האופי הפיך של מעבר ELP כOD חוזר לנקודת התחלה כאשר הטמפרטורה יורדת מתחת לt T (איור 4). קופולימרים diblock ELP תערוכת פרופיל עכירות מורכבים יותר, בהשוואה לhomopolymer ELPs. OD מגביר בדרך כלל ראשון 0.1-0.5 יחידות מעל הבסיס, לאחר שהעליות חדות OD ל2.0 יחידות מעל הבסיס (איור 5 א). מדידות DLS לספק מידע על השינוי בR H ביחס לטמפרטורה, שיתוף<html> rroborating המידע שנצבר מפרופיל העכירות (איור 5). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. טיהור ELP מוקדמת. לאחר 24 שעות ביטוי, E. coli תאים נאספים על ידי צנטריפוגה וresuspended ב-PBS.) תאים הם lysed ידי sonication, שמלווה בשינוי עדין בצבע כזה שlysate מכהה לאחר sonication. ב &#39;) לאחר תוספת של PEI לרכז מזהמים ה-DNA, lysate הוא centrifuged וגלולה גדולה של מסיסה פסולת מופרדת מELP מסיס בsupernatant. C) מעבר ELP מושרה עם התוספת של חום ו / או מלח וצורות צנטריפוגה גלולה ELP שקופה.ank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. רכיבה על אופניים מעבר הפוך. ELP מטוהר על ידי אמצעים שלה התנהגות LCST ממזהמים הן מסיסים ובלתי מסיסים. החל עם lysate ELP עשיר (1) מעבר ELP מושרה עם התוספת של חום ו / או מלח וELP מופרד על ידי צנטריפוגה (ספין חם) (2). גלולה ELP נשמרת (3 א) ואילו את supernatant המכיל מזהמים מסיסים נמחקת (3 ב). ELP הוא resuspended במאגר קר (4) וcentrifuged שוב ב 4 ° C (ספין קר) (5). גלולה המכילה מזהמים מסיסים נמחקת (6 א) ואילו את supernatant המכיל ELP מסיס נשמר (6 ב). מחזורים לסירוגין ספינים חמים וקרים חוזרים על עצמם עד שיגיעו לטוהר הרצוי, כפי שנקבע עםSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3. SDS-PAGE ניתוח של מוצרי טיהור ELP. טיהור מוצלחת של ELP אושר על ידי-SDS. ELP ביטוי היתר ניכר בה גולמי lysate coli לאחר sonication (2). לאחר התוספת של PEI וצנטריפוגה ELP המסיסים נשמרת במידה רבה בsupernatant (3), למרות שחלקם ELP הוא אבד את הכדור שנזרק של מזהמים מסיסים (4). Supernatant הבא הספין החם הראשון מכיל רמות משמעותיות של מזהמים מסיסים (5). Supernatant הבא הספין הקר הראשון מציין הפרדה טובה של ELP ממזהמים בלתי מסיסים (6). מחזורים נוספים של (7) וג החםישן ספינים (8) להסיר מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים שיורית, בהתאמה, עד (9) וספין קר (10) supernatants החם הסופי התערוכה לא להקות מזהמים חיצוניות, המאשרים את טוהר מספק של מוצר ELP. homopolymer זה ELP, עם רצף של SKGPG-(VGVPG) 80-Y, יש משקל מולקולרי צפוי של 33.37 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4. אפיון ELP homopolymer ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה. לא ELP T נקבע על ידי ניטור OD ב 350 ננומטר תוך הגדלת הטמפרטורה בשיעור של 1 ° C / min. תערוכת homopolymers ELP) עלייה חדה באחד OD שdefאינס לא T בניתן ריכוז. B) ההפיכות של מעבר ELP מאומת על ידי ניטור OD ב 350 ננומטר של פתרון 25 μ M תוך הפחתת הטמפרטורה, שבו הפיכות אושר על ידי חזרתו של OD לתחילת מחקר. יש homopolymer ELP זה הרצף SKGPG-(VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5. אפיון קופולימר diblock ELP ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה ופיזור אור דינמי. ELPs שעובר הרכבה עצמית בקנה מידה ננו, כגון קופולימרים ELP diblock עצמיים להרכיב לתוך מיצלות הכדורית, פרופילי עכירות מורכבים יותר תערוכה. <strong&gt;) עלייה מתונה בOD מציינת את המעבר מunimers למיצלות, לפני עלייה מהירה בקוטר חיצוני המצביעה על צבירה של ELP מלאה לאגרגטים מיקרון בקנה מידת מדידות DLS. ב &#39;) לאשר את ההתנהגות המשתמעות מפרופיל העכירות עבור פתרון ב25 מיקרומטר על ידי מתן מידע על השינוי בR H ביחס לטמפרטורה. כאן יש unimer ELP H ~ ננומטר 8 R ויש micelle H R ~ 25 ננומטר. יש קופולימר diblock זה ELP הרצף GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30 PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli at JoVE.com

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers גירוי מגיב עם יישומים החל טיהור חלבון רקומביננטי לאספקת סמים. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור ואפיון של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם מחיידקי Escherichia באמצעות שלב טמפרטורת פתרון מעבר ההתנהגות הקריטית נמוך יותר שלהם כאלטרנטיבה פשוטה לכרומטוגרפיה.

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K Views.  Duke University.  פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers גירוי מגיב עם יישומים החל טיהור חלבון רקומביננטי לאספקת סמים. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור ואפיון של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם מחיידקי Escherichia באמצעות שלב טמפרטורת פתרון מעבר ההת...

Video: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub&gt; 6</sub&gt; חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em&gt; חיידק</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...