Name: long-term live imaging of drosophila eye disc
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

אנו מודים צ&#39;ון-יאן הסו יו-צ&#39;י יאנג להכנת אוכל לטוס ושמירה על מניות זבוב, וכדי סו-פינג לי ואת Core הדמיה IMB עזרתם עם מיקרוסקופיה confocal. מחקר זה מומן על ידי מענקים YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, רוב 103-2311-B-001 -035 -MY3) מהמועצה הלאומית למדע ומשרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה של סין.

התקנה 1. Pre-ניסיוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ביצת זבוב מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק גרעיני (GFP) תחת mδ0.5-Gal4 ותרבות ב 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל 0.7 גרם של התכה נמוכה agarose ב 10 מ&quot;ל של 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד agarose נמס לחלוטין. שמרו על ג&#39;ל 0.7% נמוך ההיתוך בתוך חממה 37 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הציוד, כולל מלקחיים, מספריים, 42 מ&quot;מ x 0.17 מ&quot;מ coverslips, צלחת במקום זכוכית 9-היטב, וחדר תרבות מגנטי, עם 70% אתנול עבור יותר מ 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום התרבות 3: בינוני דרוזופילה של שניידר בתוספת 2% עוברית שור סרום (FBS), 0.5% פניצילין, סטרפטומיצין, ו 1.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל אינסולין. כדי למנוע זיהום, להכין את המדיום במנדף תרבית תאים. אחסן את מדיום התרבות המוכן ב 4 ° C בשימוש בתוך חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פלטפורמת דיסקציה הנסיין&quot;ים ידיים עם אתנול 70% לפני תחילת לנתיחה. </li></ol> Dissection דיסק 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש כל הציוד מ 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זחל-instar השלישי מבקבוקון זבוב. כדי למנוע זיהום מבקבוקון זבוב, לשטוף את הזחל ב 1x PBS 3x כדי להסיר את הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הזחל ניקה ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות (ב RT) בצלחת במקום זכוכית 9 היטב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הזחל עם זוג המלקחיים בסביבות שליש הדרך מהקצה האחורי מלקחיים נוספים הקרס בפה. משוך את שני מלקחיים בכיוונים מנוגדים כדי לשחרר את הרקמות הפנימיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות רוק, שומן גוף, וגם לציפורן ממתחם עין-המוח מחובר הקרס בפה. אם העצב בחוט הגחון מחובר עדיין, לחתוך אותו עם מספריים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג אחד מלקחיים כדי לתפוס את קרס פי זוג אחד מלקחיים כדי להסיר פיסת הרקמה כי שיתוףnnects מוחות דיסקי עין בחלק הגבה. הערה: אם הרקמה הזו לא יוסרה, שני הדיסקים-מחושים לעין יהיו קרובים לזה במוח. דיסקי העין יהיו אז לא לשכב על coverslip כי הרקמה הזו, המוח, ואת דיסק העין-מחושים יהוו משולשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את המתחם כולו למיקום הגחון כלפי מעלה. סור הנימה שמחברת את הקרס או דיסק למוח. הערה: אם הנימה לא יוסרה, דיסק מחושים-העין יתפלג לשתיים חתיכה כאשר הקרס בפה מוסר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרס בפה. יש להיזהר שלא לפגוע דיסק העין במהלך התהליך. הערה: דיסק העין הוא עכשיו חינם בטווח הבינוני היחיד המחובר למוח על ידי הגבעול האופטי. </li></ol></li></ol> שמה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש ולהרכיב את הרכיבים של התא עם coverslip 42 מ&quot;מ x 0.17 מ&quot;מ. צרף שכבה כפולה של טבעות אטימות למרכז להחליק את המכסה כדי להחזיק thagarose דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא עם coverslip. שים את coverslip 42 מ&quot;מ x 0.17 מ&quot;מ על acceptor הבמה. מניחים את O-Ring סיליקון על להחליק את המכסה. מניחים את הבסיס. נעל את ארונית האיטום ולמקם את המכסה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את מורכבות העין למוח גזור למרכז-טבעת O באמצעות micropipette 20 μL עם טיפ 10-200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של המדיום ולהוסיף 12 μL של agarose 0.7% נמוך ההיתוך (ב 37 ° C) המדגם. הערה: המיקום של דיסק העין ניתן לשנות עם מלקחיים לפני ההתמצקות של agarose. את agarose יהיה לגבש בתוך 5 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות בטמפרטורת החדר אל מרכז-טבעת O; O-Ring כל יכול לטעון עד 4 דגימות. ודא כי agarose מודבק-טבעת O כדי למנוע את סחיפת המדגם. הערה: אין אוורור או מחזור של המדיום הוא הכרחי. </li></ol></li></ol>4. מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ confocal הפוך במשך 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה. זה יכול למנוע Z- ציר נסחף במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה חיה לטווח ארוך, לבדוק אם הרקמה היא שלמה על ידי הפרעה הפרעות מיקרוסקופיה בניגוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את phototoxicity, להשתמש בכוח לייזר מתחת 2 mW. השתמש המטרה 40X עבור הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 62 מיקרומטר Z- מחסנית תמונות ב 12 דקות במרווח אופטי של 1 מיקרומטר. לרכוש 40 מחזורים של סריקות על סך של 10 שעות. ודא כי כל מחזור מכיל 12 דקות של הדמיה ו 3 דקות של מנוחה. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+disc+development.">Imaginal disc development.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).</li><li>Auerbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+legs,+wings+and+halteres+in+wild+type+and+some+mutant+strains+of+Drosophila+melanogaster.">The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster.</a> Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).</li><li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila.">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li><li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye.">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li><li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions.">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li><li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK/Pnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe/AF6.">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li><li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster.">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+differentiation+in+Drosophila.">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway.">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae.">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li><li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc.">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li><li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ניסוי הדמית חיה ארוך טווח על דיסקים דמותי דרוזופילה. בילינו הרבה זמן לתרגל את דיסקציה זהירה כדי למנוע נזק דיסק וכדי לאפשר את הקובץ המצורף של הדיסק קרוב coverslips. ניסינו פולי- L- ליזין (PLL) ו-התכה נמוכה agarose להחזיק את הרקמה; בסופו של דבר, את agarose-התכה נמוכה הראו יכולת טובה יותר להחזיק את הרקמה. אמנם רק את דיסק עין משמש במאמר זה כדי להדגים את ההתרחשות הנורמלית של בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial במהלך 10 תקופת הדמית h חייה, שיטה זו יכולה לחול גם על אחד לפחות דיסק אחר, דיסק האגף, כפי שהנה באה לידי הביטוי מחקר 3 קודם. יתר על כן, הכנת בינוני תרבות התקנת הדמית חיה פשוטה ואינה דורשת אוורור או במחזור בינוני. הדמית חיה רציפה יכולה לספק רצף זמני ברור של ערב ביולוגיNTS. בדו&quot;ח הקודם שלנו של בידול גליה והגירה בתוך דיסק העין, ספקנו הוכחה ישירה כי גליה גלישה להבדיל מן גליה קיימת לאחר הגירה אל הקדמי של דיסק העין 3. תרבות vivo לשעבר לטווח ארוך מאפשרת תיוג הליזר מופעל הספציפי של תאים, כגון מרת התמונה של חלבון פלואורסצנטי לקאךה, כדי לעקוב אחרי התנהגותם 3. זה גם יכול להכיל את הבדיקה של כימיקלים שנוספים ישירות מדיום התרבות; ובכך, ניתן להשתמש בה כפלטפורמת הקרנת סמים. מאחר שחלק תהליך דינמי להתרחש בתוך דקות או שניות, ברזולוציה גבוהה זמנית נדרשה. כדי לשפר את הרזולוציה הזמנית, מיקרוסקופיה גיליון אור 15, 16 או ספינינג דיסק מיקרוסקופיה 17 עשוי להיות אפשרות טובה. תנאי התרבות הנוכחי אינו מושלם. היא אינה תומכת צמיחה דיסק. תא proliferation נתמך רק עד 12 h 3. אחרי 12 h בתרבות vivo לשעבר, שיעור בידול קולטי האור מתחיל לרדת 3. זה יכול להיות בגלל חוסר הזנה או הורמונים מסוימים. מאז ההבדל העיקרי במדיום התרבות זו הוא הריכוז הגבוה של אינסולין, האינסולין היונק עלול להיות חלקי מחק את הפונקציה של פפטידים דמוי אינסולין אנדוגני. התוספת של תמצית זבוב, trehalose הסוכר בדם החרקים, וריכוז שונה של הורמון ההנשרה 20-hydroxyecdysone, לא הייתה מועילה 3. עם זאת, תקופת תרבות 12-18 h מספיקה כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים רבים. שיטות culturing אלטרנטיביות עבור culturing דיסקים דמותי זחל כבר לעומת 3, ומצבו culturing ודימות שלנו מספק את חלון הזמן הארוך ביותר והבהיר ביותר עבור הדמיה חיה. למרות דיסקים בתוך זחלים וגלמים חיה ניתן הדמיה ישירות18, 19, 20, 21, 22, חלון הרזולוציה וזמן לתצפיות מוגבלים. זחל מאוחר דיסקים גלמי יכולים להיות מתורבתים במשך זמן רב 23, 24, אך הדיסקים עוברים morphogenesis המשמעותי. כדי לנצל את הדיסקים השטוחים, 2D זחל, שיטת culturing ודימות שלנו היא הפתרון הטוב ביותר עד כה.

הדיסקים דמותי הזחל תסיסנית כבר מערכת ניסיונית המועדף לחקר מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים. דיסקים אלו invaginate מן האפיתל העוברי ולהיות צק דמוי מבנים שנבנו על ידי שתי שכבות אפיתל, האפיתל Peripodial (PE) ו דיסק פרופר (DP) 1, 2. תאי הדיסק דמותי להתרבות בהדרגה להבדיל בשלבי זחל גלמים ובסופו של דבר לפתח לתוך המבנים בגוף הבוגר. בשל המבנה דו השכבתי השטוח ופשוט של הדיסקים דמותי, הם קלים להתבונן כאשר גזורים מן הזחלים. עם זאת, למרות כמה מאמצים על ידי קבוצות רבות, את השיטות קיימות בתרבות לטווח הארוכה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון. פתחנו לאחרונה שיטת תרבות שיכולה לתמוך בהתפתחות התקינה של דיסקים דמותי מרובים עבור עד 18 שעות ולאחר המאפשר הדמית חיה 3 </sעד&gt;. שיטת התרבות יכולה לתמוך התמיינות תאי הגירה, אבל זה יכול לתמוך שגשוג תאים רק 7-12 h ולא יכול לתמוך בצמיחת דיסק. ההבדל העיקרי במדיום התרבות הוא הריכוז הגבוה של אינסולין 3. השיטה היא פשוטה, ולא אורור מיוחד או במחזור בינוני נדרש. אחד הדיסקים דמותי הנחקרים ביותר הוא דיסק מחושים-העין. עין תסיסנית בנויה של כ 800 האומטידיה. כל אומטידיום מורכב משמונה תאי קולטי אור (R1-R8). בשנת דיסק עין הזחל, תאי קולטי האור בהבחנה בעקבות המעבר של התלם המוךפו&quot;גנטי שהולך (MF), אשר חולף על פני דיסק העין מן אחורי אל קדמי 4, 5. קולטני האור בתוך האומטידיום להבדיל ברצף, החל R8, ואחריו R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, ו R7 6. האומטידיה הגבה ו veחצאים ntral של דיסק העין לעבור סיבוב 90 מעלות בכיוונים מנוגדים, ותוצאת כירליות היפך 7, 8. תהליך הסיבוב מתרחש בשני שלבים: ראשון, סיבוב 45 ° מתחיל ומסתיים בשעה בשורת האומטידיה השישית מאחורי MF; הסיבוב השני 45 ° הושלם בסביבות שורה 16 9, 10. מחקר זה השתמש ברוטציה ommatidial, בסימן R3 / 4 ספציפי mδ0.5-Ga4 11, כדי להדגים את התמיינות תאים נורמליים ואת הדינמיקה שניתן לצפות באמצעות שיטה זו לתרבות ולחיות הדימוי הדיסק העין.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

הדמית חיה מספקת את היכולת לעקוב אחר תהליכי הסלולר התפתחותי דינמיים ברציפות בזמן אמת. דיסקים דמותי תסיסנית זחל שמשו ללמוד תהליכים ביולוגיים רבים, כגון התפשטות תאים, בידול, צמיחה, הגירה, אפופטוזיס, תחרות, איתות בין תאים, ועל היווצרות גבול compartmental. עם זאת, שיטות התרבות לשעבר vivo לטווח ארוך הדמית חיה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון, למרות מאמצים רבים. לאחרונה, פיתחנו שיטה לטווח ארוך התרבות לשעבר vivo ו הדמיה חיה של דיסקים דמותי עד 18 h. בנוסף לשימוש בריכוז אינסולין גבוה בטווח הבינוני התרבות, agarose התכה נמוכה שמש גם כדי להטביע את הדיסק כדי למנוע ממנו נסחף בתקופת ההדמיה. הדוח משתמש דיסקים-מחושי העין כדוגמא. קולטי האור R3 / 4 ספציפי ביטוי mδ0.5-Ga4 בעקבות מנת להוכיח כי קולטי אור בידולtiation וסיבוב ommatidial ניתן לראות בתקופת הדמיה 10 h חי. זהו פרוטוקול מפורט המתאר שיטה פשוטה זו.

<html> בדוגמה זו, photoreceptors R3 / R4 היו שכותרתו עם mδ0.5-Ga4 לפקח על הפרדת photoreceptor. Mδ0.5-Ga4 כוננים ביטוי חזק R4 ו ביטוי חלש R3 11 , מה שהופך אותו סמן מצוין עבור R3 ו R4, כמו גם לתהליך של סיבוב ommatidial. ב סרט 1 , R3 ו R4 היו מסומנים עם GFP. בתחילת הפגישה 10 שעות לחיות הדמיה, היו 8 שורות של אשכולות ommatidial ( איור 2 א וסרט 1 ) ו 14 שורות של אשכולות ommatidial בסוף ( איור 2 ב ). שיעור ההבחנה האומטידיאלית היה 1.67 h לשורה, אשר קרוב לשיעור של 1.5-2 h / שורה ב vivo דיסקים 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ,s = &quot;Xref&quot;&gt; 12, 13, 14. בהתבסס על מיקומם היחסי של R3 ו R4, סיבוב ommatidial התרחשה דיסק vivo לשעבר תרבותי במהלך הדמיה חיה (איור 2 א &quot;א &#39;&#39;, ב&quot;, ו-ב &#39;&#39;). אשכול R3 / R4 יחיד סומן עם כדור לבן בפריים הראשון של הסרט 2. בהתחלה, ציר R3 / R4 שנראה בניצב לקו המשווה (איור 2C ו Movie 2). הוא מופיע אז כדי לסובב 15 מעלות, 30 מעלות, ו 45 מעלות ב 3 (איור 2C &#39;), 6 (איור 2C &#39;&#39;), ו 9 (איור 2C &#39;&#39;&#39;) ח, בהתאמה. נתונים אלה מראים כי בשיטה זו ניתן לקיים בידול קולטי אור במהלך הדמית 10 h החי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> figuמחדש 1: סכמטי תרשים של עצרת קאמרית. תרשים סכמטי של הרכבה קאמרית: (1) שים את coverslip שכבה כפולה O-המצורפת-טבעת על acceptor הבמה. (2) מניחים את סיליקון O-Ring על להחליק את המכסה. (3) מניח את הבסיס. (4) נעל את ארונית האיטום. (5) טען את המדגם במרכז טבעת O ולמקם את הכיסוי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> איור 2: הדמיה חיה של בידול R3 / R4 ו סיבוב. R3 / R4 שכותרתו עם mδ0.5-Gal4 להביע GFP-טופס גרעיני במהלך 10 שעות של הדמיה חיה. כל הדמויות נתפסו מסרט 1. (א) התמונה נלקחה בהתחלה. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) תמונה מוגדלת מאזור בארגזים בצד שמאל (א&quot;) וימין (א&quot;). תמונה (B) נלקח בסוף תקופת 10 h. (B&#39;-B&quot;) תמונה מוגדלת מאזור בארגזים בצד שמאל (ב&quot;) וימין (B&quot;). (CC &quot;&quot; &quot;) זוג R3 / R4 יחיד (מסומן על ידי חץ א&quot;) ואחריו דרך הזמן להראות את הסיבוב של צמד R4 / R3. ברי סולם = 15 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 5 מיקרומטר A, B, ו- C, בהתאמה. כל הדמויות הן מקסימום עוצמת z-תחזיות. היקף הזמן מוצג שעות: דקות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> סרט 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> סרט 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Views.  National Yang-Ming University.  פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biology

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה חיה מורחבת של מורפוגנזה של רגל גולם דרוזופילה ללא פופריום

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: חשיפת מבנים אפיתל דינמיים במהלך התפתחות דרוזופילה

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד