אנו מודים צ&#39;ון-יאן הסו יו-צ&#39;י יאנג להכנת אוכל לטוס ושמירה על מניות זבוב, וכדי סו-פינג לי ואת Core הדמיה IMB עזרתם עם מיקרוסקופיה confocal. מחקר זה מומן על ידי מענקים YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, רוב 103-2311-B-001 -035 -MY3) מהמועצה הלאומית למדע ומשרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה של סין.

התקנה 1. Pre-ניסיוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ביצת זבוב מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק גרעיני (GFP) תחת mδ0.5-Gal4 ותרבות ב 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל 0.7 גרם של התכה נמוכה agarose ב 10 מ&quot;ל של 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד agarose נמס לחלוטין. שמרו על ג&#39;ל 0.7% נמוך ההיתוך בתוך חממה 37 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הציוד, כולל מלקחיים, מספריים, 42 מ&quot;מ x 0.17 מ&quot;מ coverslips, צלחת במקום זכוכית 9-היטב, וחדר תרבות מגנטי, עם 70% אתנול עבור יותר מ 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום התרבות 3: בינוני דרוזופילה של שניידר בתוספת 2% עוברית שור סרום (FBS), 0.5% פניצילין, סטרפטומיצין, ו 1.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל אינסולין. כדי למנוע זיהום, להכין את המדיום במנדף תרבית תאים. אחסן את מדיום התרבות המוכן ב 4 ° C בשימוש בתוך חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פלטפורמת דיסקציה הנסיין&quot;ים ידיים עם אתנול 70% לפני תחילת לנתיחה. </li></ol> Dissection דיסק 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש כל הציוד מ 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זחל-instar השלישי מבקבוקון זבוב. כדי למנוע זיהום מבקבוקון זבוב, לשטוף את הזחל ב 1x PBS 3x כדי להסיר את הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הזחל ניקה ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות (ב RT) בצלחת במקום זכוכית 9 היטב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הזחל עם זוג המלקחיים בסביבות שליש הדרך מהקצה האחורי מלקחיים נוספים הקרס בפה. משוך את שני מלקחיים בכיוונים מנוגדים כדי לשחרר את הרקמות הפנימיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות רוק, שומן גוף, וגם לציפורן ממתחם עין-המוח מחובר הקרס בפה. אם העצב בחוט הגחון מחובר עדיין, לחתוך אותו עם מספריים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג אחד מלקחיים כדי לתפוס את קרס פי זוג אחד מלקחיים כדי להסיר פיסת הרקמה כי שיתוףnnects מוחות דיסקי עין בחלק הגבה. הערה: אם הרקמה הזו לא יוסרה, שני הדיסקים-מחושים לעין יהיו קרובים לזה במוח. דיסקי העין יהיו אז לא לשכב על coverslip כי הרקמה הזו, המוח, ואת דיסק העין-מחושים יהוו משולשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את המתחם כולו למיקום הגחון כלפי מעלה. סור הנימה שמחברת את הקרס או דיסק למוח. הערה: אם הנימה לא יוסרה, דיסק מחושים-העין יתפלג לשתיים חתיכה כאשר הקרס בפה מוסר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרס בפה. יש להיזהר שלא לפגוע דיסק העין במהלך התהליך. הערה: דיסק העין הוא עכשיו חינם בטווח הבינוני היחיד המחובר למוח על ידי הגבעול האופטי. </li></ol></li></ol> שמה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש ולהרכיב את הרכיבים של התא עם coverslip 42 מ&quot;מ x 0.17 מ&quot;מ. צרף שכבה כפולה של טבעות אטימות למרכז להחליק את המכסה כדי להחזיק thagarose דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא עם coverslip. שים את coverslip 42 מ&quot;מ x 0.17 מ&quot;מ על acceptor הבמה. מניחים את O-Ring סיליקון על להחליק את המכסה. מניחים את הבסיס. נעל את ארונית האיטום ולמקם את המכסה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את מורכבות העין למוח גזור למרכז-טבעת O באמצעות micropipette 20 μL עם טיפ 10-200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של המדיום ולהוסיף 12 μL של agarose 0.7% נמוך ההיתוך (ב 37 ° C) המדגם. הערה: המיקום של דיסק העין ניתן לשנות עם מלקחיים לפני ההתמצקות של agarose. את agarose יהיה לגבש בתוך 5 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות בטמפרטורת החדר אל מרכז-טבעת O; O-Ring כל יכול לטעון עד 4 דגימות. ודא כי agarose מודבק-טבעת O כדי למנוע את סחיפת המדגם. הערה: אין אוורור או מחזור של המדיום הוא הכרחי. </li></ol></li></ol>4. מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ confocal הפוך במשך 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה. זה יכול למנוע Z- ציר נסחף במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה חיה לטווח ארוך, לבדוק אם הרקמה היא שלמה על ידי הפרעה הפרעות מיקרוסקופיה בניגוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את phototoxicity, להשתמש בכוח לייזר מתחת 2 mW. השתמש המטרה 40X עבור הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 62 מיקרומטר Z- מחסנית תמונות ב 12 דקות במרווח אופטי של 1 מיקרומטר. לרכוש 40 מחזורים של סריקות על סך של 10 שעות. ודא כי כל מחזור מכיל 12 דקות של הדמיה ו 3 דקות של מנוחה. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+disc+development.">Imaginal disc development.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).</li><li>Auerbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+legs,+wings+and+halteres+in+wild+type+and+some+mutant+strains+of+Drosophila+melanogaster.">The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster.</a> Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).</li><li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila.">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li><li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye.">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li><li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions.">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li><li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK/Pnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe/AF6.">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li><li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster.">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+differentiation+in+Drosophila.">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway.">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae.">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li><li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc.">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li><li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ניסוי הדמית חיה ארוך טווח על דיסקים דמותי דרוזופילה. בילינו הרבה זמן לתרגל את דיסקציה זהירה כדי למנוע נזק דיסק וכדי לאפשר את הקובץ המצורף של הדיסק קרוב coverslips. ניסינו פולי- L- ליזין (PLL) ו-התכה נמוכה agarose להחזיק את הרקמה; בסופו של דבר, את agarose-התכה נמוכה הראו יכולת טובה יותר להחזיק את הרקמה. אמנם רק את דיסק עין משמש במאמר זה כדי להדגים את ההתרחשות הנורמלית של בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial במהלך 10 תקופת הדמית h חייה, שיטה זו יכולה לחול גם על אחד לפחות דיסק אחר, דיסק האגף, כפי שהנה באה לידי הביטוי מחקר 3 קודם. יתר על כן, הכנת בינוני תרבות התקנת הדמית חיה פשוטה ואינה דורשת אוורור או במחזור בינוני. הדמית חיה רציפה יכולה לספק רצף זמני ברור של ערב ביולוגיNTS. בדו&quot;ח הקודם שלנו של בידול גליה והגירה בתוך דיסק העין, ספקנו הוכחה ישירה כי גליה גלישה להבדיל מן גליה קיימת לאחר הגירה אל הקדמי של דיסק העין 3. תרבות vivo לשעבר לטווח ארוך מאפשרת תיוג הליזר מופעל הספציפי של תאים, כגון מרת התמונה של חלבון פלואורסצנטי לקאךה, כדי לעקוב אחרי התנהגותם 3. זה גם יכול להכיל את הבדיקה של כימיקלים שנוספים ישירות מדיום התרבות; ובכך, ניתן להשתמש בה כפלטפורמת הקרנת סמים. מאחר שחלק תהליך דינמי להתרחש בתוך דקות או שניות, ברזולוציה גבוהה זמנית נדרשה. כדי לשפר את הרזולוציה הזמנית, מיקרוסקופיה גיליון אור 15, 16 או ספינינג דיסק מיקרוסקופיה 17 עשוי להיות אפשרות טובה. תנאי התרבות הנוכחי אינו מושלם. היא אינה תומכת צמיחה דיסק. תא proliferation נתמך רק עד 12 h 3. אחרי 12 h בתרבות vivo לשעבר, שיעור בידול קולטי האור מתחיל לרדת 3. זה יכול להיות בגלל חוסר הזנה או הורמונים מסוימים. מאז ההבדל העיקרי במדיום התרבות זו הוא הריכוז הגבוה של אינסולין, האינסולין היונק עלול להיות חלקי מחק את הפונקציה של פפטידים דמוי אינסולין אנדוגני. התוספת של תמצית זבוב, trehalose הסוכר בדם החרקים, וריכוז שונה של הורמון ההנשרה 20-hydroxyecdysone, לא הייתה מועילה 3. עם זאת, תקופת תרבות 12-18 h מספיקה כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים רבים. שיטות culturing אלטרנטיביות עבור culturing דיסקים דמותי זחל כבר לעומת 3, ומצבו culturing ודימות שלנו מספק את חלון הזמן הארוך ביותר והבהיר ביותר עבור הדמיה חיה. למרות דיסקים בתוך זחלים וגלמים חיה ניתן הדמיה ישירות18, 19, 20, 21, 22, חלון הרזולוציה וזמן לתצפיות מוגבלים. זחל מאוחר דיסקים גלמי יכולים להיות מתורבתים במשך זמן רב 23, 24, אך הדיסקים עוברים morphogenesis המשמעותי. כדי לנצל את הדיסקים השטוחים, 2D זחל, שיטת culturing ודימות שלנו היא הפתרון הטוב ביותר עד כה.

הדיסקים דמותי הזחל תסיסנית כבר מערכת ניסיונית המועדף לחקר מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים. דיסקים אלו invaginate מן האפיתל העוברי ולהיות צק דמוי מבנים שנבנו על ידי שתי שכבות אפיתל, האפיתל Peripodial (PE) ו דיסק פרופר (DP) 1, 2. תאי הדיסק דמותי להתרבות בהדרגה להבדיל בשלבי זחל גלמים ובסופו של דבר לפתח לתוך המבנים בגוף הבוגר. בשל המבנה דו השכבתי השטוח ופשוט של הדיסקים דמותי, הם קלים להתבונן כאשר גזורים מן הזחלים. עם זאת, למרות כמה מאמצים על ידי קבוצות רבות, את השיטות קיימות בתרבות לטווח הארוכה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון. פתחנו לאחרונה שיטת תרבות שיכולה לתמוך בהתפתחות התקינה של דיסקים דמותי מרובים עבור עד 18 שעות ולאחר המאפשר הדמית חיה 3 </sעד&gt;. שיטת התרבות יכולה לתמוך התמיינות תאי הגירה, אבל זה יכול לתמוך שגשוג תאים רק 7-12 h ולא יכול לתמוך בצמיחת דיסק. ההבדל העיקרי במדיום התרבות הוא הריכוז הגבוה של אינסולין 3. השיטה היא פשוטה, ולא אורור מיוחד או במחזור בינוני נדרש. אחד הדיסקים דמותי הנחקרים ביותר הוא דיסק מחושים-העין. עין תסיסנית בנויה של כ 800 האומטידיה. כל אומטידיום מורכב משמונה תאי קולטי אור (R1-R8). בשנת דיסק עין הזחל, תאי קולטי האור בהבחנה בעקבות המעבר של התלם המוךפו&quot;גנטי שהולך (MF), אשר חולף על פני דיסק העין מן אחורי אל קדמי 4, 5. קולטני האור בתוך האומטידיום להבדיל ברצף, החל R8, ואחריו R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, ו R7 6. האומטידיה הגבה ו veחצאים ntral של דיסק העין לעבור סיבוב 90 מעלות בכיוונים מנוגדים, ותוצאת כירליות היפך 7, 8. תהליך הסיבוב מתרחש בשני שלבים: ראשון, סיבוב 45 ° מתחיל ומסתיים בשעה בשורת האומטידיה השישית מאחורי MF; הסיבוב השני 45 ° הושלם בסביבות שורה 16 9, 10. מחקר זה השתמש ברוטציה ommatidial, בסימן R3 / 4 ספציפי mδ0.5-Ga4 11, כדי להדגים את התמיינות תאים נורמליים ואת הדינמיקה שניתן לצפות באמצעות שיטה זו לתרבות ולחיות הדימוי הדיסק העין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:71px;">AMRESCO&#160;</td>
			<td style="width:215px;">0815-25G</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0780-2PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">42x0.17 mm cover slips&#160;</td>
			<td>PST</td>
			<td>G401-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Schneider&#8217;s Drosophila medium&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:215px;">I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture chamber&#160;</td>
			<td>PECON</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>POC-R2 Cell Cultivation System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x objective</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly strain:nls.GFP</td>
			<td style="width:71px;">Bloominggton</td>
			<td align="right" style="width:215px;">4775</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

הדמית חיה מספקת את היכולת לעקוב אחר תהליכי הסלולר התפתחותי דינמיים ברציפות בזמן אמת. דיסקים דמותי תסיסנית זחל שמשו ללמוד תהליכים ביולוגיים רבים, כגון התפשטות תאים, בידול, צמיחה, הגירה, אפופטוזיס, תחרות, איתות בין תאים, ועל היווצרות גבול compartmental. עם זאת, שיטות התרבות לשעבר vivo לטווח ארוך הדמית חיה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון, למרות מאמצים רבים. לאחרונה, פיתחנו שיטה לטווח ארוך התרבות לשעבר vivo ו הדמיה חיה של דיסקים דמותי עד 18 h. בנוסף לשימוש בריכוז אינסולין גבוה בטווח הבינוני התרבות, agarose התכה נמוכה שמש גם כדי להטביע את הדיסק כדי למנוע ממנו נסחף בתקופת ההדמיה. הדוח משתמש דיסקים-מחושי העין כדוגמא. קולטי האור R3 / 4 ספציפי ביטוי mδ0.5-Ga4 בעקבות מנת להוכיח כי קולטי אור בידולtiation וסיבוב ommatidial ניתן לראות בתקופת הדמיה 10 h חי. זהו פרוטוקול מפורט המתאר שיטה פשוטה זו.

<html> בדוגמה זו, photoreceptors R3 / R4 היו שכותרתו עם mδ0.5-Ga4 לפקח על הפרדת photoreceptor. Mδ0.5-Ga4 כוננים ביטוי חזק R4 ו ביטוי חלש R3 11 , מה שהופך אותו סמן מצוין עבור R3 ו R4, כמו גם לתהליך של סיבוב ommatidial. ב סרט 1 , R3 ו R4 היו מסומנים עם GFP. בתחילת הפגישה 10 שעות לחיות הדמיה, היו 8 שורות של אשכולות ommatidial ( איור 2 א וסרט 1 ) ו 14 שורות של אשכולות ommatidial בסוף ( איור 2 ב ). שיעור ההבחנה האומטידיאלית היה 1.67 h לשורה, אשר קרוב לשיעור של 1.5-2 h / שורה ב vivo דיסקים 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ,s = &quot;Xref&quot;&gt; 12, 13, 14. בהתבסס על מיקומם היחסי של R3 ו R4, סיבוב ommatidial התרחשה דיסק vivo לשעבר תרבותי במהלך הדמיה חיה (איור 2 א &quot;א &#39;&#39;, ב&quot;, ו-ב &#39;&#39;). אשכול R3 / R4 יחיד סומן עם כדור לבן בפריים הראשון של הסרט 2. בהתחלה, ציר R3 / R4 שנראה בניצב לקו המשווה (איור 2C ו Movie 2). הוא מופיע אז כדי לסובב 15 מעלות, 30 מעלות, ו 45 מעלות ב 3 (איור 2C &#39;), 6 (איור 2C &#39;&#39;), ו 9 (איור 2C &#39;&#39;&#39;) ח, בהתאמה. נתונים אלה מראים כי בשיטה זו ניתן לקיים בידול קולטי אור במהלך הדמית 10 h החי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> figuמחדש 1: סכמטי תרשים של עצרת קאמרית. תרשים סכמטי של הרכבה קאמרית: (1) שים את coverslip שכבה כפולה O-המצורפת-טבעת על acceptor הבמה. (2) מניחים את סיליקון O-Ring על להחליק את המכסה. (3) מניח את הבסיס. (4) נעל את ארונית האיטום. (5) טען את המדגם במרכז טבעת O ולמקם את הכיסוי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> איור 2: הדמיה חיה של בידול R3 / R4 ו סיבוב. R3 / R4 שכותרתו עם mδ0.5-Gal4 להביע GFP-טופס גרעיני במהלך 10 שעות של הדמיה חיה. כל הדמויות נתפסו מסרט 1. (א) התמונה נלקחה בהתחלה. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) תמונה מוגדלת מאזור בארגזים בצד שמאל (א&quot;) וימין (א&quot;). תמונה (B) נלקח בסוף תקופת 10 h. (B&#39;-B&quot;) תמונה מוגדלת מאזור בארגזים בצד שמאל (ב&quot;) וימין (B&quot;). (CC &quot;&quot; &quot;) זוג R3 / R4 יחיד (מסומן על ידי חץ א&quot;) ואחריו דרך הזמן להראות את הסיבוב של צמד R4 / R3. ברי סולם = 15 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 5 מיקרומטר A, B, ו- C, בהתאמה. כל הדמויות הן מקסימום עוצמת z-תחזיות. היקף הזמן מוצג שעות: דקות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> סרט 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> סרט 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Views.  National Yang-Ming University.  פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך