The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

איור 3 מראה סיכום של ההליך ניסיוני. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את ההשלכות של ביטוי שונה של גן של עניין, הקימו את הצלב בכפולות הבא ולשמור על 25 מעלות צלזיוס: UAS-transgene (זכרים) X GMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; הערה + / SM5-TM6b (נקבות בתולה): לקבלת צלב רקמת השליטה UAS-lacZ זכרים לGMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: נקבות GFP. β-galactosidase לא מייצר פגמים בהתנהגות תא ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-RNAi צלב זכרים לGMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; נקבות בתולה + / SM5-TM6b. הערה: פגמים אקראיים בהתנהגות תא ברשתיות להביע DCR-2 מחוץ לרחם נצפו (מידע לא מוצג). ערנות מומלצת אם שימוש בגישה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sנבחרים טרום גלמים לבנים של גנוטיפים מתאימים ומקום בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. אם הגלמים להביע DCR-2, בחר גלמים או זכר או נקבה: הביטוי של כטב&quot;מ-DCR-2, להוסיף על כרומוזום X, הוא חזק יותר בגברים. יש דחף מיני של גלמים ב0 APF שעות לפני פיגמנטציה של המקרה גלמי - בלוטות המין של גברים נראים כמו גלובוסים שקופים גדולים בצדדים לרוחב של הגולם (כשליש מאחורי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות microcentrifuge המכילים גלמים, בקצה-קופסא פלסטיק נקייה של 25 מעלות צלזיוס. כדי למנוע התייבשות של מקום גלמים 10 סנטימטר 2 פיסת הרקמה, שהושרה במים מזוקקים, לקצה התיבה. הערה: אם את לחות בקצה התיבה הופכת גבוהה מדי במקרה גלמי עשוי להיות רטוב וקשה לנתח בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של הזמן מתאים. כדי ללכוד התנהגויות תא הקשורים לדפוסי עין, להכין גלמים עבור הדמיה בכ -17 שעות APF, APF 20 שעות או 24 שעות APפ ראה נציגי תוצאות לדיון נוסף בכאשר התנהגויות תא מסוימות הם נצפו הטובים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר דבק דו-צדדי טרי על צלחת לנתיחה sylgard השחור. מקם צד גולם, גב למעלה, עם ראש הגולם דבק בקלטת (איור 1 א) דו-צדדי .Try לא לדבוק בית החזה ובטן אזורים של הגולם לקלטת דו צדדית. עם מלקחיים בזהירות להרים ולהסיר את operculum לחשוף את ראש גלמים. לקרוע בצד של המקרה גלמי לחשוף את האזור סביב עין אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את הגולם מהנייר דבק. אם הגולם נשאר חסיד, להחיל נפח קטן של מים מזוקקים לצומת בין המקרה וקלטת גלמים להחליש הידבקות. </li></ol> 2. הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות 15 מ&quot;מ 2 מסגרת קטנה מנייר סופג ואגרוף חור בmiddlethat הוא 5.5 מ&quot;מ קוטר (איור 1). לטבול במים מזוקקים ומקום במרכז שקופיות מיקרוסקופ. באמצעות מזרק 30 סמ&quot;ק, לסחוט טבעת אחידה של וזלין להקיף את מסגרת נייר הסופג. ודא שטבעת וזלין היא גבוהה במעט מהרוחב של הגולם ושקוטרה של הטבעת הוא שולי פחות מהרוחב של להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חרוז קטן של וזלין ישירות לשקופית, בחור מנוקב לנייר הסופג (איור 1 ג) .Carefully לארגן הגולם, בצד שלה, נתמך על ידי חרוז וזלין (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על גבי טבעת וזלין כדי שאנשי קשר זה אפיתל מעל neuroepithelium העין (1D איור). בעדינות לדחוס ההכנה לאטום את coverslip נגד וזלין וליצור קשר משטח שטוח קטן בין אזור עין גלמים וcoverslip. </li></ol> 3. דימות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הכנת גלמים באמצעותמיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל לכידת 7 דקות קטעי סדרתי דרך תחום הפסגה של neuroepithelium העין, באזור של צמתים adherens. הערה: א) סעיפים סידוריים מתאימים הם בדרך כלל 4-5 לZ- המחסנית מורכבת מ0.2 מיקרומטר z-שלבים. ב) אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות וקפלים עדינים, יכול לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של אזורים הגדולים של רקמה. בעוד הדמיה, ניתן למצוא חלק משטח של עניין להיות בפוקוס, ואזור סמוך ליהיה מחוץ לפוקוס. כולל טיפה קטנה של מים מזוקקים בין העין וcoverslip גלמים יכולים לחסל כמה קפלי רקמה חריפים אך לא אופייני טופולוגיה המעטה אחידה של המוקדמים של המורפוגנזה עין גלמי השלבים. במקרים אלה oversample הרקמה על ידי הרחבת Z- המחסנית עד בפוקוס פרוסות נרכשות עבור כל השדה. ג) לכידת קטעי סדרתי כל דקות 7 צריכה לאפשר חי הדמיה במשך 3 עד 4 שעות ללא redu משמעותיction בעוצמת הקרינה GFP שעלולה לפגוע באיכות תמונה. -מרווחי זמן קצרים יותר עשויים להפחית את הזמן הכולל של הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדמיה במשך 3 עד 4 שעות. אין להשתמש בפוקוס אוטומטי ופונקצית זמן שנגיש בהרבה מיקרוסקופי ניאון מאז צמיחה ושאיבה של hemolymph גלמים מעבירה את העמדה של הרשתית וערנית נדרשת כל דקות 14-21 התמקדות מחדש. הערה הדמיה שמעבר 4 שעות עשויים להאט או לעכב המורפוגנזה של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת deconvolution מתאימה כדי להפחית את הרקע ולשפר את הניגודיות של תמונות סעיף סדרתי. עבור כל קובץ Z- מחסנית, בצע את הפעולות הבאות בתוכנת LAS AF (ראה טבלה של חומרים): נווט ללוח כלים, בחר 3D Deconvolution ולחץ על החל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תמונת היטל מרבי (MP) עבור כל קובץ ערימת deconvoluted: נווט ללוח כלים, בחר הקרנת 3D ולחץ על החל. הערה: אלגוריתם ההקרנה המרבי עלול להיכשל כדי ליצור אחידly תמונה בפוקוס לרקמות שכבר oversampled. טכניקה לחידוד אזורים מחוץ למוקד מתוארת בשלב 5.2. </li></ol> 4. פוסט-ההדמיה גלמי הצלה והפנוטיפ אימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטפל באם החפצים הוכנסו או הגולם נפגע במהלך הדמיה, להסיר בזהירות את הגולם מאסדת ההדמיה: באמצעות מלקחיים להסיר את coverslip ולהעביר את הגולם לבקבוקון נקי של מזון. לאחסן בטמפרטורת חדר או 25 מעלות צלזיוס עד הזבוב הבוגר עולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון היטב את הפנוטיפ של העין מבוגרת ולהשוות לעיניים של זבובים בוגרים מתעוררים מן הצלב לטוס המקורי. </li></ol> עיבוד 5. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישור תמונה אוטומטי: הערה: רקמת תסיסנית חי תעבור ולגדול לאורך כל תהליך ההדמיה. כתוצאה מכך, המרכזים של תמונות שנאספו בנקודות זמן רצופות אולי לא מתאים לאותה הנקודה ברקמת דרוזופילה. בנוסףדיסק רשתית כל סבב כ -30 מעלות בין ~ 21 ו -23 APF שעות. כדי להדגיש התנהגויות תא בודדות ולהפחית הסחות דעת שנגרמה על ידי גידול האורגניזם, ליישר כל MP image.While זה יכול להתבצע באופן ידני, תוכנת עריכת תמונות משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים) יש אלגוריתמים מובנים שיכול לזרז את התהליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, סקריפטים פתוחים וקבצים טען בחרו לסטאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא קבצי תמונת MP ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר. הערה: אם אפשרות זו נבחרת, התוכנה יכולה להשתמש באלגוריתם יישור שמעווה את נתוני תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל קבצי MP שנטענו לתוך חלונית השכבות, לוודא שכל התמונות הן בסדר כרונולוגי, כך שנקודת הזמן המוקדמת ביותר היא בחלק העליון של שכבת המחסנית. אם השכבות אינן בנכונה כדי, גרור ושחררו אותם עד שהם הזמינובצורה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שכבות Auto-Align מכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי. בחר מיקום מחדש ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האלגוריתם האוטומטי היישור נכשל כדי לכוון את המסגרות למוקד רלוונטי, לבצע התאמות קטין באמצעות כלי הזזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חידוד Composite: הערה: אזורי Out-of-פוקוס של תמונת MP ראשונית ניתן חידדו על ידי &#39;חיתוך&#39; ערימת deconvoluted המקבילה בתוכנת LAS AF. חיתוך קובץ ערימה מאפשר להגביל את המרווח של Z- מחסנית כי הוא נתון אלגוריתם ההקרנה המקסימאלי באופן ידני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את פונקצית היבול בלוח כלים (תחת לשונית התהליך). באופן ידני להגביל את הפרוסות הראשוניות וסופיים כך שהם מקיפים את חגורת ההידבקות רק בתוך האזור תחילה מחוץ לפוקוס. לחץ על החל כדי ליצור קובץ ערימה חדש שעבר אופטימיזציה לאזור זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור הקרנה המרבית חדשה לערימה מותאמת באופן מקומי ויצוא כקובץ TIFF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתוכנת דואר עריכת תמונות (ראה טבלה של חומרים), סקריפטים פתוחים (הממוקמים בכרטיסיית הקובץ של התפריט הראשי) וטען בחר קבצים לתוך סטאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הקובץ הראשוני תמונת MP וקובץ MP מותאם באופן מקומי לנקודת זמן מסוימת ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בשני השכבות בשכבות חלונית ולאחר מכן בחר &#39;שכבות Auto-Blend (הממוקם בכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי) כדי להסוות באופן אוטומטי האזורים המתאימים של שני התמונות, מניב להתמקד ב- אחיד שדה רשתית. להציל את התמונה מורכבת זו כקובץ TIFF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.2.1 באמצעות 5.2.5 לכל תמונות MP הכי המוצלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמות נוספות: לסובב, לחתוך, ולהתאים את הרמות של שכבות הסרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כל השכבות שנבחרה, להשתמש בכלי המרה (Edit&gt; Free Transform) כדי לסובב את התמונות כך שהציר הגבי-הגחון של הרשתית מיושרלציר y של מסגרת הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, להשתמש בכלי החיתוך כדי לצמצם את שדה הראייה לגודל וצורה רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהתאמת רמה (של מסגרות בודדות) כדי לעזור לשפר את הניגוד שבין קרום התא ותא בגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למטרות סגנוני ולהדגיש התנהגויות תא מסוימות, להציג את הצבע כוזב כדי להדגיש נקודות עניין בכל מסגרת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנימציה: להמיר את התמונות לסרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלונית האנימציה מכרטיסיית Windows של התפריט הראשי. בחר הפוך מסגרות משכבות מהתפריט הממוקם בפינה הימנית העליונה של חלונית האנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שהשכבות מתווספות לחלונית האנימציה בסדר רציף החל מתחתית הערימה. כדי להפוך את הסדר של המסגרות, בחר תחילה את כל המסגרות ולאחר מכן בחר הפוכה מסגרות מתפריט חלונית אנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עיכוב מסגרת זמן לכל מסגרת באמצעות התפריט הנפתח מתחת לאגודל המסגרתמסמר. הערה: עיכוב המסגרת לסרטים 1 עד 4 שהוצגו במאמר זה הוא 0.8 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, היצוא פתוח ובחרו לדקלם וידאו. בחר QuickTime יצוא תחת אפשרויות קובץ ובחר בפורמט וידאו רצוי. תחת לדקלם אפשרויות להגדיר מסגרת שיעור מותאמת אישית, הזן במסגרת שיעור של 15, ולחץ על לדקלם. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

תיאור התפתחות wild-type (לעיל) מהווה את הבסיס להשוואות של אירועי דפוסים בRNAi או גנוטיפים ביטוי יתר. השוואות של פיתוח רקמת חיה הן לא יסולא בפז בעת קביעה בדיוק אילו התנהגויות תא מוסדרות על ידי חלבון של עניין. יתר על כן, ולא תאר כאן, הדמיה תא חי מאפשרת לאדם להפוך את התיאורים איכ?...

מתחם עין תסיסנית מאופיינת בהסדר הסטריאוטיפי של ~ 750 האומטידיה מופרדת על ידי חלת דבש-סריג של תאי פיגמנט אבזר 4,5. תאי פיגמנט אלה הם בדוגמת ידי שילוב מתואם של אירועים: תנועות תא מקומיות, צמיחת תאים, שינויים בצורת תא, ואפופטוזיס. הדמיה חיה של אפיתל זה מאפשר לאדם לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים אלה בהקשר תלת ממדים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומוטרד. בניגוד לפרוטוקולים קודמים 6,7, הטכניקה המתוארת כאן משלבת שיטה יעילה לייצוב תנועת רקמות זרות שלא יכול להיות מנותק מתהליך ההדמיה. שיטה זו משפרת את המחקרים של התנהגות תא באפיתל פיתוח תסיסנית העין גלמים - רקמה שגדלה, מסתובבת, ומשמרות במהלך ההדמיה. בנוסף de טכניקת תנועה-ההתייצבותscribed כאן יהיה שימושי לחקר תאים בהקשרים אחרים שבם תנועה זרות מתרחשת. כדי להמחיש את גבולות תא בתחום רשתית דרוזופילה, קווים לטוס מהונדסים נוצרו המבטאים UBI-DE-Cadherin: GFP, כמו גם UAS-α-קטנין: GFP בשליטה של נהג עין ספציפית GMR-GAL4 1-3. השימוש בשני סמני קרום מתויג GFP מאפשר ההדמיה של גבולות תא באור בעוצמה נמוך יותר. זה ממזער את הנזק וphotobleaching רקמה בחשיפה חוזרת ונשנית לאורכי גל באנרגיה גבוהה, במסגרת שיעור מוגברת המאפשר ומשך סרט. כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-DCR-2 שולב גם לקו זבוב שני 8. בעדכון שלישי מפרוטוקולים קודמים, מתקן הדמיה פשוט שמורכב בקלות ברוב המעבדות מתואר. מנגנון זה מבטל את הדרישה ליש לי r הדמיה מיוחדIG שנוצר על ידי &#39;חנות המכונה &quot;של אוניברסיטה או שירות דומה. אסדת הדמיה זו דומה לזה המשמש לרקמות גלמים אחרות תמונת 9,10. מוצג כאן הוא פרוטוקול הדמיה פשוט לחיות תאים שיכולים לשמש כדי להעריך באופן ישיר את אירועי המוךפו&quot;גנטי שתורמים לדפוסי עין מ~ 17-42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF hr). באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר לאדם לקבוע את ההשלכות של שינוי ביטוי גנים בזמן התפתחות גלמים.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&amp;nbsp;</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Black Sylgard dissection dish</td><td></td><td></td><td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Black)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm glass coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Or purchase at local pharmacy.</td></tr><tr><td>30 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

תהליכים מובנים של פיתוח גלמי תסיסנית יכולים להזיז ולעוות את האפיתל עין בדרכים שהופכות את התאים בודד התנהגות קשה לעקוב אחר במהלך הדמיה תא חי. תהליכים אלה כוללים: סיבוב ברשתית, צמיחת תאים ותנועת האורגניזם. בנוסף, אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות ועדינות קפלים לעתים קרובות הוצגו כגולם מוכן להדמיה, לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של יותר מכמה האומטידיה במישור מוקד אחד. העבודה המתוארת כאן תרופות נושאים אלה, המאפשר ניתוח קל של תהליכים תאיים במהלך התפתחות העין גלמי דרוזופילה. גלמים כראוי מבוימים מסודרים במתקן הדמיה שניתן להרכיב בקלות ברוב המעבדות יוביקוויטין-DE-Cadherin:. GFP וGMR-GAL4 -driven UAS-α-קטנין: GFP משמשים כדי לחזות גבולות תא באפיתל העין 1 -3. לאחר deconvolution הואפנה לתמונות ניאון שנתפסו במטוסי מוקד מרובים, תמונות הקרנה מקסימליים נוצרות עבור כל נקודת זמן ומשופרת באמצעות תוכנת עריכת תמונות. אלגוריתמי יישור משמשים לייצוב תנועה מיותרת במהירות, מה שהופך קלה יותר בודדת התנהגות תא כדי לעקוב אחר.

Live-הדמיה של העין גלמים היא אסטרטגיה מוצלחת להתבונן התנהגויות תא שתורמים לדפוסים של neuroepithelium. תפקידם של חלבונים מסוימים ניתן להעריך בקלות על ידי להביע transgenes שמשנה את רמות חלבון במהלך פיתוח העין. כדי לעשות GMR-GAL4 זה משמש לנהוג ביטוי transgene מאחורי תלם המוךפו&quot;גנטי. ז?...

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye at JoVE.com

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.4K Views.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Video: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neuroscience

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה חיה מורחבת של מורפוגנזה של רגל גולם דרוזופילה ללא פופריום

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: חשיפת מבנים אפיתל דינמיים במהלך התפתחות דרוזופילה

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live-הדמיה של

Summary

Explore More Videos

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית

הדמיה חיה של

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום