The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

איור 3 מראה סיכום של ההליך ניסיוני. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את ההשלכות של ביטוי שונה של גן של עניין, הקימו את הצלב בכפולות הבא ולשמור על 25 מעלות צלזיוס: UAS-transgene (זכרים) X GMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; הערה + / SM5-TM6b (נקבות בתולה): לקבלת צלב רקמת השליטה UAS-lacZ זכרים לGMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: נקבות GFP. β-galactosidase לא מייצר פגמים בהתנהגות תא ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-RNAi צלב זכרים לGMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; נקבות בתולה + / SM5-TM6b. הערה: פגמים אקראיים בהתנהגות תא ברשתיות להביע DCR-2 מחוץ לרחם נצפו (מידע לא מוצג). ערנות מומלצת אם שימוש בגישה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sנבחרים טרום גלמים לבנים של גנוטיפים מתאימים ומקום בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. אם הגלמים להביע DCR-2, בחר גלמים או זכר או נקבה: הביטוי של כטב&quot;מ-DCR-2, להוסיף על כרומוזום X, הוא חזק יותר בגברים. יש דחף מיני של גלמים ב0 APF שעות לפני פיגמנטציה של המקרה גלמי - בלוטות המין של גברים נראים כמו גלובוסים שקופים גדולים בצדדים לרוחב של הגולם (כשליש מאחורי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות microcentrifuge המכילים גלמים, בקצה-קופסא פלסטיק נקייה של 25 מעלות צלזיוס. כדי למנוע התייבשות של מקום גלמים 10 סנטימטר 2 פיסת הרקמה, שהושרה במים מזוקקים, לקצה התיבה. הערה: אם את לחות בקצה התיבה הופכת גבוהה מדי במקרה גלמי עשוי להיות רטוב וקשה לנתח בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של הזמן מתאים. כדי ללכוד התנהגויות תא הקשורים לדפוסי עין, להכין גלמים עבור הדמיה בכ -17 שעות APF, APF 20 שעות או 24 שעות APפ ראה נציגי תוצאות לדיון נוסף בכאשר התנהגויות תא מסוימות הם נצפו הטובים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר דבק דו-צדדי טרי על צלחת לנתיחה sylgard השחור. מקם צד גולם, גב למעלה, עם ראש הגולם דבק בקלטת (איור 1 א) דו-צדדי .Try לא לדבוק בית החזה ובטן אזורים של הגולם לקלטת דו צדדית. עם מלקחיים בזהירות להרים ולהסיר את operculum לחשוף את ראש גלמים. לקרוע בצד של המקרה גלמי לחשוף את האזור סביב עין אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את הגולם מהנייר דבק. אם הגולם נשאר חסיד, להחיל נפח קטן של מים מזוקקים לצומת בין המקרה וקלטת גלמים להחליש הידבקות. </li></ol> 2. הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות 15 מ&quot;מ 2 מסגרת קטנה מנייר סופג ואגרוף חור בmiddlethat הוא 5.5 מ&quot;מ קוטר (איור 1). לטבול במים מזוקקים ומקום במרכז שקופיות מיקרוסקופ. באמצעות מזרק 30 סמ&quot;ק, לסחוט טבעת אחידה של וזלין להקיף את מסגרת נייר הסופג. ודא שטבעת וזלין היא גבוהה במעט מהרוחב של הגולם ושקוטרה של הטבעת הוא שולי פחות מהרוחב של להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חרוז קטן של וזלין ישירות לשקופית, בחור מנוקב לנייר הסופג (איור 1 ג) .Carefully לארגן הגולם, בצד שלה, נתמך על ידי חרוז וזלין (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על גבי טבעת וזלין כדי שאנשי קשר זה אפיתל מעל neuroepithelium העין (1D איור). בעדינות לדחוס ההכנה לאטום את coverslip נגד וזלין וליצור קשר משטח שטוח קטן בין אזור עין גלמים וcoverslip. </li></ol> 3. דימות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הכנת גלמים באמצעותמיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל לכידת 7 דקות קטעי סדרתי דרך תחום הפסגה של neuroepithelium העין, באזור של צמתים adherens. הערה: א) סעיפים סידוריים מתאימים הם בדרך כלל 4-5 לZ- המחסנית מורכבת מ0.2 מיקרומטר z-שלבים. ב) אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות וקפלים עדינים, יכול לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של אזורים הגדולים של רקמה. בעוד הדמיה, ניתן למצוא חלק משטח של עניין להיות בפוקוס, ואזור סמוך ליהיה מחוץ לפוקוס. כולל טיפה קטנה של מים מזוקקים בין העין וcoverslip גלמים יכולים לחסל כמה קפלי רקמה חריפים אך לא אופייני טופולוגיה המעטה אחידה של המוקדמים של המורפוגנזה עין גלמי השלבים. במקרים אלה oversample הרקמה על ידי הרחבת Z- המחסנית עד בפוקוס פרוסות נרכשות עבור כל השדה. ג) לכידת קטעי סדרתי כל דקות 7 צריכה לאפשר חי הדמיה במשך 3 עד 4 שעות ללא redu משמעותיction בעוצמת הקרינה GFP שעלולה לפגוע באיכות תמונה. -מרווחי זמן קצרים יותר עשויים להפחית את הזמן הכולל של הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדמיה במשך 3 עד 4 שעות. אין להשתמש בפוקוס אוטומטי ופונקצית זמן שנגיש בהרבה מיקרוסקופי ניאון מאז צמיחה ושאיבה של hemolymph גלמים מעבירה את העמדה של הרשתית וערנית נדרשת כל דקות 14-21 התמקדות מחדש. הערה הדמיה שמעבר 4 שעות עשויים להאט או לעכב המורפוגנזה של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת deconvolution מתאימה כדי להפחית את הרקע ולשפר את הניגודיות של תמונות סעיף סדרתי. עבור כל קובץ Z- מחסנית, בצע את הפעולות הבאות בתוכנת LAS AF (ראה טבלה של חומרים): נווט ללוח כלים, בחר 3D Deconvolution ולחץ על החל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תמונת היטל מרבי (MP) עבור כל קובץ ערימת deconvoluted: נווט ללוח כלים, בחר הקרנת 3D ולחץ על החל. הערה: אלגוריתם ההקרנה המרבי עלול להיכשל כדי ליצור אחידly תמונה בפוקוס לרקמות שכבר oversampled. טכניקה לחידוד אזורים מחוץ למוקד מתוארת בשלב 5.2. </li></ol> 4. פוסט-ההדמיה גלמי הצלה והפנוטיפ אימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטפל באם החפצים הוכנסו או הגולם נפגע במהלך הדמיה, להסיר בזהירות את הגולם מאסדת ההדמיה: באמצעות מלקחיים להסיר את coverslip ולהעביר את הגולם לבקבוקון נקי של מזון. לאחסן בטמפרטורת חדר או 25 מעלות צלזיוס עד הזבוב הבוגר עולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון היטב את הפנוטיפ של העין מבוגרת ולהשוות לעיניים של זבובים בוגרים מתעוררים מן הצלב לטוס המקורי. </li></ol> עיבוד 5. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישור תמונה אוטומטי: הערה: רקמת תסיסנית חי תעבור ולגדול לאורך כל תהליך ההדמיה. כתוצאה מכך, המרכזים של תמונות שנאספו בנקודות זמן רצופות אולי לא מתאים לאותה הנקודה ברקמת דרוזופילה. בנוסףדיסק רשתית כל סבב כ -30 מעלות בין ~ 21 ו -23 APF שעות. כדי להדגיש התנהגויות תא בודדות ולהפחית הסחות דעת שנגרמה על ידי גידול האורגניזם, ליישר כל MP image.While זה יכול להתבצע באופן ידני, תוכנת עריכת תמונות משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים) יש אלגוריתמים מובנים שיכול לזרז את התהליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, סקריפטים פתוחים וקבצים טען בחרו לסטאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא קבצי תמונת MP ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר. הערה: אם אפשרות זו נבחרת, התוכנה יכולה להשתמש באלגוריתם יישור שמעווה את נתוני תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל קבצי MP שנטענו לתוך חלונית השכבות, לוודא שכל התמונות הן בסדר כרונולוגי, כך שנקודת הזמן המוקדמת ביותר היא בחלק העליון של שכבת המחסנית. אם השכבות אינן בנכונה כדי, גרור ושחררו אותם עד שהם הזמינובצורה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שכבות Auto-Align מכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי. בחר מיקום מחדש ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האלגוריתם האוטומטי היישור נכשל כדי לכוון את המסגרות למוקד רלוונטי, לבצע התאמות קטין באמצעות כלי הזזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חידוד Composite: הערה: אזורי Out-of-פוקוס של תמונת MP ראשונית ניתן חידדו על ידי &#39;חיתוך&#39; ערימת deconvoluted המקבילה בתוכנת LAS AF. חיתוך קובץ ערימה מאפשר להגביל את המרווח של Z- מחסנית כי הוא נתון אלגוריתם ההקרנה המקסימאלי באופן ידני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את פונקצית היבול בלוח כלים (תחת לשונית התהליך). באופן ידני להגביל את הפרוסות הראשוניות וסופיים כך שהם מקיפים את חגורת ההידבקות רק בתוך האזור תחילה מחוץ לפוקוס. לחץ על החל כדי ליצור קובץ ערימה חדש שעבר אופטימיזציה לאזור זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור הקרנה המרבית חדשה לערימה מותאמת באופן מקומי ויצוא כקובץ TIFF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתוכנת דואר עריכת תמונות (ראה טבלה של חומרים), סקריפטים פתוחים (הממוקמים בכרטיסיית הקובץ של התפריט הראשי) וטען בחר קבצים לתוך סטאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הקובץ הראשוני תמונת MP וקובץ MP מותאם באופן מקומי לנקודת זמן מסוימת ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בשני השכבות בשכבות חלונית ולאחר מכן בחר &#39;שכבות Auto-Blend (הממוקם בכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי) כדי להסוות באופן אוטומטי האזורים המתאימים של שני התמונות, מניב להתמקד ב- אחיד שדה רשתית. להציל את התמונה מורכבת זו כקובץ TIFF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.2.1 באמצעות 5.2.5 לכל תמונות MP הכי המוצלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמות נוספות: לסובב, לחתוך, ולהתאים את הרמות של שכבות הסרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כל השכבות שנבחרה, להשתמש בכלי המרה (Edit&gt; Free Transform) כדי לסובב את התמונות כך שהציר הגבי-הגחון של הרשתית מיושרלציר y של מסגרת הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, להשתמש בכלי החיתוך כדי לצמצם את שדה הראייה לגודל וצורה רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהתאמת רמה (של מסגרות בודדות) כדי לעזור לשפר את הניגוד שבין קרום התא ותא בגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למטרות סגנוני ולהדגיש התנהגויות תא מסוימות, להציג את הצבע כוזב כדי להדגיש נקודות עניין בכל מסגרת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנימציה: להמיר את התמונות לסרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלונית האנימציה מכרטיסיית Windows של התפריט הראשי. בחר הפוך מסגרות משכבות מהתפריט הממוקם בפינה הימנית העליונה של חלונית האנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שהשכבות מתווספות לחלונית האנימציה בסדר רציף החל מתחתית הערימה. כדי להפוך את הסדר של המסגרות, בחר תחילה את כל המסגרות ולאחר מכן בחר הפוכה מסגרות מתפריט חלונית אנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עיכוב מסגרת זמן לכל מסגרת באמצעות התפריט הנפתח מתחת לאגודל המסגרתמסמר. הערה: עיכוב המסגרת לסרטים 1 עד 4 שהוצגו במאמר זה הוא 0.8 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, היצוא פתוח ובחרו לדקלם וידאו. בחר QuickTime יצוא תחת אפשרויות קובץ ובחר בפורמט וידאו רצוי. תחת לדקלם אפשרויות להגדיר מסגרת שיעור מותאמת אישית, הזן במסגרת שיעור של 15, ולחץ על לדקלם. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

תיאור התפתחות wild-type (לעיל) מהווה את הבסיס להשוואות של אירועי דפוסים בRNAi או גנוטיפים ביטוי יתר. השוואות של פיתוח רקמת חיה הן לא יסולא בפז בעת קביעה בדיוק אילו התנהגויות תא מוסדרות על ידי חלבון של עניין. יתר על כן, ולא תאר כאן, הדמיה תא חי מאפשרת לאדם להפוך את התיאורים איכ?...

מתחם עין תסיסנית מאופיינת בהסדר הסטריאוטיפי של ~ 750 האומטידיה מופרדת על ידי חלת דבש-סריג של תאי פיגמנט אבזר 4,5. תאי פיגמנט אלה הם בדוגמת ידי שילוב מתואם של אירועים: תנועות תא מקומיות, צמיחת תאים, שינויים בצורת תא, ואפופטוזיס. הדמיה חיה של אפיתל זה מאפשר לאדם לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים אלה בהקשר תלת ממדים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומוטרד. בניגוד לפרוטוקולים קודמים 6,7, הטכניקה המתוארת כאן משלבת שיטה יעילה לייצוב תנועת רקמות זרות שלא יכול להיות מנותק מתהליך ההדמיה. שיטה זו משפרת את המחקרים של התנהגות תא באפיתל פיתוח תסיסנית העין גלמים - רקמה שגדלה, מסתובבת, ומשמרות במהלך ההדמיה. בנוסף de טכניקת תנועה-ההתייצבותscribed כאן יהיה שימושי לחקר תאים בהקשרים אחרים שבם תנועה זרות מתרחשת. כדי להמחיש את גבולות תא בתחום רשתית דרוזופילה, קווים לטוס מהונדסים נוצרו המבטאים UBI-DE-Cadherin: GFP, כמו גם UAS-α-קטנין: GFP בשליטה של נהג עין ספציפית GMR-GAL4 1-3. השימוש בשני סמני קרום מתויג GFP מאפשר ההדמיה של גבולות תא באור בעוצמה נמוך יותר. זה ממזער את הנזק וphotobleaching רקמה בחשיפה חוזרת ונשנית לאורכי גל באנרגיה גבוהה, במסגרת שיעור מוגברת המאפשר ומשך סרט. כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-DCR-2 שולב גם לקו זבוב שני 8. בעדכון שלישי מפרוטוקולים קודמים, מתקן הדמיה פשוט שמורכב בקלות ברוב המעבדות מתואר. מנגנון זה מבטל את הדרישה ליש לי r הדמיה מיוחדIG שנוצר על ידי &#39;חנות המכונה &quot;של אוניברסיטה או שירות דומה. אסדת הדמיה זו דומה לזה המשמש לרקמות גלמים אחרות תמונת 9,10. מוצג כאן הוא פרוטוקול הדמיה פשוט לחיות תאים שיכולים לשמש כדי להעריך באופן ישיר את אירועי המוךפו&quot;גנטי שתורמים לדפוסי עין מ~ 17-42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF hr). באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר לאדם לקבוע את ההשלכות של שינוי ביטוי גנים בזמן התפתחות גלמים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

תהליכים מובנים של פיתוח גלמי תסיסנית יכולים להזיז ולעוות את האפיתל עין בדרכים שהופכות את התאים בודד התנהגות קשה לעקוב אחר במהלך הדמיה תא חי. תהליכים אלה כוללים: סיבוב ברשתית, צמיחת תאים ותנועת האורגניזם. בנוסף, אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות ועדינות קפלים לעתים קרובות הוצגו כגולם מוכן להדמיה, לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של יותר מכמה האומטידיה במישור מוקד אחד. העבודה המתוארת כאן תרופות נושאים אלה, המאפשר ניתוח קל של תהליכים תאיים במהלך התפתחות העין גלמי דרוזופילה. גלמים כראוי מבוימים מסודרים במתקן הדמיה שניתן להרכיב בקלות ברוב המעבדות יוביקוויטין-DE-Cadherin:. GFP וGMR-GAL4 -driven UAS-α-קטנין: GFP משמשים כדי לחזות גבולות תא באפיתל העין 1 -3. לאחר deconvolution הואפנה לתמונות ניאון שנתפסו במטוסי מוקד מרובים, תמונות הקרנה מקסימליים נוצרות עבור כל נקודת זמן ומשופרת באמצעות תוכנת עריכת תמונות. אלגוריתמי יישור משמשים לייצוב תנועה מיותרת במהירות, מה שהופך קלה יותר בודדת התנהגות תא כדי לעקוב אחר.

Live-הדמיה של העין גלמים היא אסטרטגיה מוצלחת להתבונן התנהגויות תא שתורמים לדפוסים של neuroepithelium. תפקידם של חלבונים מסוימים ניתן להעריך בקלות על ידי להביע transgenes שמשנה את רמות חלבון במהלך פיתוח העין. כדי לעשות GMR-GAL4 זה משמש לנהוג ביטוי transgene מאחורי תלם המוךפו&quot;גנטי. ז?...

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye at JoVE.com

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K Views.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Video: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...