פטריק Cafferty נתמך על ידי מענק דוקטורט מן האגודה לטרשת נפוצה בקנדה.

חלק 1: טרום הניסוי הגדרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע מראש, חבר זבובים ליצור זחל המבטאים GFP בשליטת היזם גליה ספציפי. לצורך ניסוי אנו דמיינו GFP מתוייגים עם רצף לוקליזציה גרעיני לידי ביטוי ותאי גלייה באמצעות קוטביות הפוכה (repo) מקדם (3, 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תלושי לכסות לפחות יום אחד מראש על ידי השריית 18 מ&quot;מ עגול תלושי לכסות במשך 10 דקות ב -1% פולי-L-ליזין פתרון אוויר יבש למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני הניסוי, לנקות תא Chamlide תרבות מגנטי על ידי השריית הרכיבים לילה אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להכין מדיום על ידי הוספת תרבות בסרום שור עוברית, פניצילין, סטרפטומיצין פתרון, אינסולין 10 מ&quot;ל של מדיום חרקים שניידר באמצעות הטכניקה aseptic. ריכוזי עובדים הם: 1X העובר שור בסרום; 100U/ml פניצילין, סטרפטומיצין 0.1mg/ml; ו 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין בינוני חרק של שניידר (שונה מ - (5)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר קאמרית תרבות לייבוש באוויר במנדף תרבית תאים. לשטוף אתנול שיורית מהאולם תרבות ע&quot;י שטיפה בינוני תרבות מוכנים. </li></ol> חלק 2: Dissection של המתחם תסיסנית העין למוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הזחל שלישי instar נדודים מהצד של הבקבוקון זבוב מקום טיפת בינוני תרבות מקורר על צלחת פטרי על קרח למשך מספר דקות. Chilling הזחל מומלץ להאט התכווצויות הגוף peristaltic על מנת להקל על דיסקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל צונן בטיפת בינוני תרבות על צלחת מצופה Sylgard תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש זוג מלקחיים דומון בסדר בתקיפות לתפוס את הזחל כשליש הדרך מהקצה האחורי. המתן עד הזחל מוציא ווים פיו מסוף הקדמי. אחוז הפה קרסים עם זוג השני של מלקחיים על הרחבה מלאה. כדי לנתח את הזחל, לאט למשוך את שני זוגות מלקחיים בכיוונים מנוגדים. מתחם עין המוח, יחד עם בלוטות הרוק, גופים שומן, רקמת דמותי, ימשוך מהגוף הזחל. אל תמשוך הפה ווים מהר מדי אחרת הם יקרעו את מורכבות העין למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בלוטות הרוק, גופים שומן, דיסקים דמותי באמצעות אולטרה דק במספריים גוזז. שתי האונות של המוח העין דיסקים יצורף חוט העצב הגחון ווים הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 18 מ&quot;מ לכסות להחליק על גבי זכוכית נושאת. השאירו קצה אחד של להחליק את מכסה תלוי מעבר לקצה של השקופית כדי מאוחר יותר להרים את מכסה להחליק. הוסף טיפה של תרבות בינוני על גבי תלוש 18 מ&quot;מ מכסה. מעבירים את מורכבות העין אל המוח בינוני התרבות ידי אחיזה ווים הפה עם מלקחיים. אין להבין את מורכבות העין למוח ישירות עם מלקחיים או רקמת ייפגעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה בסדר, לקצץ את הפה ווים מתסביך העין למוח וזורקים. הסרת הווים הפה חשוב הדמיה לחיות כמו ווים הפה ימשיך החוזה במדיום תרבות גרימת רקמת לעבור במהלך במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש הגירה גליה בתוך הדיסק עין דמותי, בזהירות לחתוך את גבעול אופטיים, הרקמה הדקה שמחברת את המוח ואת הדיסק העין להרחיק או להשליך את המוח (ראה איור 1 א). כדי להמחיש גליה בתוך גבעול אופטיים, להשאיר את המוח, גבעול אופטיים, ואת הדיסק עין דמותי שלם (ראה איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את coverslip באמצעות מלקחיים לצייר עיגול מתחת סביב הרקמה של עניין עם סמן קבע. מעגל זה יהיה סיוע באיתור רקמה במיקרוסקופ בחלק 4. </li></ol> חלק 3: הרכבה הדיסק עין דמותי בתא תרבות מגנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס את הקצה של coverslip תלוי. מעבירים את coverslip לצלחת התחתון של החדר המגנטי Chamlide מבלי להפריע את הרקמה בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את סיליקון O-Ring על הגוף העיקרי של החדר Chamlide. התקן את הגוף העיקרי על גבי צלחת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף בינוני תרבות לחדר. אל תוסיף את המדיום תרבות מהר מדי או רקמות של עניין יפריעו. לא לגמרי למלא את התא כדי לאפשר חילוף הגזים בחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום לכסות בעדינות בלתי נראה על גבי תא Chamlide. </li></ol> חלק 4: ויזואליזציה של תאים נודדים גליה דיסק העין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חדר תרבות על הבמה של מיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. אתר את המדגם באמצעות עיגול על coverslip כהתייחסות על בהגדלה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על מדגם באמצעות עדשה 40X. אפשר הרקמה להתיישב על coverslip. צלמו תמונות של הדיסק עין או גבעול אופטיים בכל 10-15min במשך 3-4 שעות. רקמות עשויה להתעוות ולהעביר את המיקוד. מיקוד ידני את הרקמה לפני לכידת תמונה שיקלו ההוא הבעיה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו לאסוף סדרה של תמונות של ה-GFP-tagged ותאי גלייה כי היגרו גבעול אופטיים לתוך הדיסק עין דמותי (איור 1 BD). בעוד הדמיה לחיות לתקופה 60 דקות היה די כדי לצפות לשינויים בעמדות של גרעינים גליה בתוך דיסק עין הבר סוג דמותי, גרעינים גלייה מוטציה של הגן הכרחי נדידת תאים גליה נכשלה לחלוטין כדי לצאת גבעול אופטיים (חיצים איור 1 FH). יש לנו תרבות העין למוח מתחמי לתקופות עוד 240 דקות לפני התבוננות התדרדרות רקמת תרבותי. בעקבות נקודת זמן 240 דקות אנו מתחילים להתבונן בתאי ה-GFP חיובי בינוני התרבות הסובבת תרבותי העין למוח מתחמי (חץ איור 2 ג). ב-GFP בנוסף יהיה לצבור נקודות מפוזר בכל הרקמות מציע פירוט של רקמות שלמות. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> איור 1: הדמיה חיה של גרעינים GFP-tagged גליה בסוג בר בפיתוח מערכות ראייה מוטציה. A, E) תמונות שצולמו באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה של סוג בר תרבותי מוטציה העין דמותי דיסקים (ED). בסוג בטבע, ותאי גלייה נולדים ולהעביר מן גבעול אופטי (OS) לתוך דיסק העין. המוח הוסר כדי להקל על השטחת הדמיה של הדיסק עין דמותי. BD) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הדיסק עין בר תרבותי סוג דמותי ב (א) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מגלה GFP-tagged גליה גרעינים נודדים בתוך הדיסק העין. FH) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של המתחם העין למוח מוטנטי (ה) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מדגים השתהות של גרעינים-GFP tagged גליה בתוך גבעול הראייה (חץ). המוח (BR) הושארה המצורפת גבעול הראייה לאפשר הדמיה של גליה בתוך גבעול. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> איור 2: הדמיה חיה של ה-GFP-tagged ממברנות גלייה דיסק עין הבר סוג דמותי. יש לנו תרבות בהצלחה את העין למוח מתחמי עבור 240 דקות תקופות. בתרבית רקמה יותר מ 240 דקות מתחיל להישבר. בינוני התרבות הסובבת את הדיסק עין דמותי (ED), גבעול אופטי (OS) האונה במוח (BR) ב 0 (א) ו - 150 דקות (ב), לעומת 300 דקות זמן נקודה (C), ללא תשלום ה-GFP חיובי תאים, שמסומן על ידי החץ.

<ol>
	<li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells.">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li><li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+migration+in+the+eye+disc.">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster.">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בפרוטוקול זה אנו מתארים תצפית של נדידת תאים גליה לתוך הדיסק עין דמותי חיים באמצעות מיקרוסקופ. בדוגמה שלנו סוג בר (איור 1 לספירה), השתמשנו סמן GFP גרעיני לצפות תנועת התא גליה דיסק העין במשך שעה אחת. בשנת מוטציה של הגן מועמד נדרש נדידת תאים גליה כיום תחת מחקר במעבדה של...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Poly-L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider's Insect Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0146</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4458</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin solution from bovine pancreas</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chamlide Magnetic chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Live cell Instrument</td>
<td>CM-R-10</td>
<td>35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultra fine clipper scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine scientific tools</td>
<td>15200-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine scientific tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of glial cell migration in the drosophila eye imaginal disc

ותאי גלייה של חוליות והן חסרי חוליות האורגניזמים חייבים לנדוד לאזורים היעד הסופי כדי ensheath ותמיכה נוירונים הקשורים. למרות ההתקדמות האחרונות נעשה כדי לתאר את ההגירה של תאים חיים גליה באגף גלמי פיתוח (1), מחקרים של<em&gt; תסיסנית</em&gt; נדידת תאים גליה יש מעורבים בדרך כלל בדיקה של רקמת קבוע. ניתוח מיקרוסקופי של תאים חיים ניעתי מציעה את היכולת לבחון את התנהגות הסלולר לאורך כל תהליך הנדידה, לרבות קביעת שיעור ושינויים בכיוון של צמיחה. יחד עם שימוש בכלים גנטיים, הדמיה חיה יכול לשמש כדי לקבוע תפקידים מדויקת יותר עבור גנים ספציפיים בתהליך של פיתוח. עבודות קודמות על ידי Silies<em&gt; Et al.</em&gt; (2) תיאר את ההגירה של גליה שמקורם גבעול הראייה, מבנה שמחבר את עין בפיתוח המוח, לתוך דיסק העין דמותי ברקמות קבוע. כאן אנו מתאר פרוטוקול לבחינת הגירה של תאים חיים אל גליה<em&gt; תסיסנית</em&gt; עין דמותי דיסק. אנו מנצלים את קו תסיסנית המבטא GFP ב גליה פיתוח לעקוב אחר התקדמות תא גלייה בסוג פראי בחיות מוטציה.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc at JoVE.com

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  University of British Columbia - UBC. כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

Video: Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...