טכניקות המוצגים כאן פותחו במימון על ידי מענקים ממשרד האנרגיה (מדעי Bioenergy) ואת הקרן הלאומית למדע.

חלק 1: גידול ואחסון חומר צמחי מתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניסיוננו, hypocotyls צעירים שתילי מלפפון מולבן לשמש מקור נוח של החומר דופן התא עבור ניסויים אלו. זרעי מלפפון נזרעים על נייר רטוב בתיבה אור הוכחה, שהוא לשמור בארון חשוך בחדר טמפרטורה קבועה נקבע על 26 ° C. הטמפרטורה המדויקת אינה קריטית, כמו כל דבר בין 22 ° לבין 30 ° C אמור להיות בסדר, אבל הטמפרטורה תקבע כמה מהר השתילים מגיעים בשלב המתאים של התפתחות. חם הטמפרטורה, מהר יותר שתילים יפתחו. אנו משתמשים בדרך כלל השתילים כשהם גדלו על 5 ס&quot;מ אורך, אשר הגיעו 3-4 ימים לאחר הזריעה. חשוב כי שתיל להיות מבוגר בחושך, כמו גם כמויות קטנות של אור להשפיע הן על קצב התפתחות הנבט לבין הקיר תכונות התא אנו מודדים עם טכניקה זו. ביום 3 אתה יכול להציץ בתיבה, תוך שימוש באור עמום מסוננים ירוק, כדי לבדוק את התפתחות שתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים נחתכים במהירות ארוזים בקופסאות פלסטיק קטנות, 100-150 שתילים בקרטון, ומאוחסנים ב -80 ° C. בטמפרטורה זו הם נשארים שימושי שבועות. </li></ol> חלק 2: הכנת קיר דגימות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצות קטנות (80-10) של שתילים חתך קפוא מועברים מהמקפיא למיכל מבודד המכיל לחסום במקפיא -80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפורן כיסוי hypocotyl היא הכתה עם carborundum. הדבר נעשה על ידי ציור hypocotyl שוב ושוב בין האגודל לאצבע המורה, אשר מצופה slurry עבה של אבקת carborundum רטוב. זה לוקח קצת ניסיון כדי לדעת את הסכום הנכון של הלחץ להשתמש: לחץ יותר מדי שכבת אפידרמיס מתחיל להיות גרוסים וקרוע, גם הלחץ קצת את הקוטיקולה לא יהיה permeabilized. אחת גם צריך לעבוד מהר, כי כמו מפשיר hypocotyl קפוא, הוא הופך להיות רפוי, וקשה לנהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hypocotyl הכתה הוא טבול במי קרח כדי להסיר את רוב carborundum דבקות ואז מאוחסן על מי קרח בעוד hypocotyls הנותרים מוכנים בצורה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hypocotyls הם לחתוך לאורך הרצוי, בדרך כלל 1.2 ס&quot;מ, עם סכין גילוח הסינגל החדש קצוות, ואז התאימה בשקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו אנחנו צריכים לשטח את הקירות כדי להסיר מוהל התא כדי להקל clamping. שקופיות הזכוכית השני הוא מונח על גבי קבוצה של 8-10 דגימות, ויוצרים כריך. משקל (400-500 גרם) ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית דקות 5. עבור משקל אנו משתמשים באופן שגרתי וכוס המכילה כמות מתאימה של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונלי: בהתאם הניסוי, hypocotyls עשוי להיות מובטל עם טיפול חום קצר בשלב זה. לשם כך אנו נקשרים שקופיות הזכוכית יחד עם זוג גומיות, לשים את הרכבה במיכל עם 100 מ&quot;ל מים דה מיוננים בטמפרטורת החדר ולשים אותו במיקרוגל בעוצמה מלאה. עם מיקרוגל שלנו המים מתחיל לרתוח כ 50 שניות ואנחנו לעצור את מיקרוגל 15 s אחרי הרתיחה מתחיל. המים החמים זרמו במהירות את והחליפו עם מים קרים כדי לעצור denaturation. ייתכן שיהיה צורך להשתנות אלה תזמונים, כמו מיקרוגל שלך עשוי להיות שונה משלנו. עם חימום יתר הדגימות נעשים חלשים להישבר בקלות. עם חימום מספיק expansin אנדוגני אינו מומת לבין דגימות קיר לשמור כמה ההיענות pH חומצי. </li></ol> חלק 3: הגדרת Extensometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות הקיר הם הידק עכשיו extensometer כוח קבוע. זהו מכשיר שהותקן שמורכבת קובט פרספקס להחזקת סוף הבסיס של המדגם קיר מלחציים ניד המצורפת בסוף apical של המדגם. מהדק ניד הוא רכוב על קצה מוט שעובר דרך הסלילים פתוח של חיישן מיקום, LVDT או &quot;לינארי דיפרנציאלי משתנה Transformer&quot;, כי אלקטרונית מזהה את המיקום של גליל מתכת קטן, או &quot;הליבה&quot;, כלומר מחוברת למוט. הקצה העליון של המוט קשורה מנוף עם משקל נגד מתכווננת. מנוף זה מפעיל סכום מתכווננת של כוח כלפי מעלה על מדגם הקיר. הכוח מותאם ידי הוספה או הסרה משקולות מתכת מכויל בקצה הרחוק של הידית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרה מדגם הקיר - בסופו של דבר הבסיס של המדגם hypocotyl הוא הרים עם מלקחיים בסדר ~ 2-3 מ&quot;מ של סוף apical ממוקם בין הלסתות פתוח של מהדק ניד. מהדק זו מהדק קפיץ מתכת לסתות תנין אשר הם מצופים פלסטיק כדי למנוע מגע ישיר בין משטח המתכת הפתרון חיץ או מדגם הקיר. ב מתכת הניסיון שלנו יונים ליץ מ מהדק יכול ומעכבות את היכולת של קיר להאריך, ולכן אנחנו ממשיכים המתכת מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת הרכבה מהדק ניד ביד אחת, בסופו של דבר הבסיס של הדגימה הקיר הוא תמרן כעת בין שתי חתיכות צירים של קובט הפרספקס קובטהחלקים הם הביאו יחד קמוץ, ובכך לנעול את קצה התחתון של המדגם קיר קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסיפה מהדק ניד עכשיו שוחרר בעדינות, המאפשר את מלוא עוצמתה של הנגד שיועברו הדגימה הקיר. אנו משתמשים באופן שגרתי משקל נגד סך של 20 גרם של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון. קיר או חומרים אחרים עשויים לחייב ניסויים במשקלים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובט מתמלא חיץ (200 UL) ואת המיקום של קובט עברה למעלה או למטה עם בורג התאמה, כך מהדק ניד מובא לקצה התחתון של טווח המדידה LVDT. LVDT שלנו מחוברת יחידת רכישת נתונים של המיקרו, ולכן אנו עוקבים אחר בעמדה LVDT דרך המחשב. יש לנו שמונה מכלולים LVDT מחוברים במקביל עם מחשב אחד, דבר המאפשר לנו לרוץ 8 דגימות הקיר בו זמנית. המחשב רושם את המיקום של כל אחד אסיפות LVDT פעם 30 s. </li></ol> חלק 4: תגובה הארכה כדי מדידת pH חומצי או expansin - תוצאות נציג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [הניסוי הראשון] עבור המדידה של הרחבה חומצה הנגרמת, אנחנו מתחילים עם דגימות קיר יליד (כלומר, לא מובטל בחום) ו חיץ נייטרלי מתווסף קובט. דגימות קיר להאריך במשך כמה דקות, בתגובה למתח נוסף, אך דועך הרחבה בשיעור נמוך אחרי כמה דקות. המחשב שלנו מאפשר לנו לפקח גם את השינוי באורך של המדגם (כלומר, את השינוי בעמדה של מהדק ניד, לאחר תחילת הניסוי) או שאנחנו יכולים לפקח על נגזרת של מיקום זמן, או במילים אחרות את שיעור הארכה . שיעור הארכה מייצב לערך נמוך עם הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 דקות ~, למאגר נייטרלי מוסר. אנחנו משתמשים בצינור מתכת דקה, עשוי מחט מד גדול המזרק, מחובר משאבת ואקום כדי להסיר את החיץ במהירות, עם הפרעה מינימלית של הקיר או הרכבה מכנית. חיץ חומציים הוא הוסיף אז, לפעמים עם 1-2 מהיר כדי להבטיח חילופי החליפין להשלים למאגר חומצי. אז לשבת בחיבוק ידיים ולראות את התגובה של הקיר. בדרך כלל אנחנו יכולים לזהות את קצב מהיר יותר של הרחבה תוך כמה דקות. אחרי 60 דקות בדרך כלל יש לנו מספיק מידע כדי להעריך את התגובה הרחבה, אך במקרים מסוימים המדידות עשוי להאריך את תקופות ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [ניסוי השנייה] עבור המדידה של הרחבה expansin-Induced דופן התא, אנחנו מתחילים עם חום מומת דגימות קיר חוצץ חומצי מתווסף קובט. כמו בניסוי הראשון, שיעור הארכה דופן התא בהדרגה מייצב לערך נמוך בגלל היעדר expansin תפקודית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 דקות ~, חלבון expansin מתווסף קובט על ידי &#39;spiking &quot;עם למאגר ב קובט עם UL 10-20 של פתרון expansin. Expansin במהירות חודר מדגם דופן התא ותוך כמה דקות אנו רואים כי שיעור הארכה גדל. תגובה זו יכולה להיות הרחבה במעקב במשך שעה או יותר. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> איור 1: מתאר נהלים להכנת קירות התא כדי להעריך חומצה הנגרמת או expansin-Induced הארכת הקיר.

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls.">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li><li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well.">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li><li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima.">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins.">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li><li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants.">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li></ol>

להדגמה זו השתמשנו קירות התא מן hypocotyls מלפפון כי הם הוכיחו להיות מקור אמין של דגימות הקיר כי הם קל לטפל כי להגיב ברגישות טוב. יש לנו גם הצלחה טובים עם קירות שתילים אחרים, כמו גם כמה חומרים מהסופרמרקט, כמו עלי תרד צעירים גבעולי סלרי. בעיקרון, צעיר, רך, רקמות הצמח גדל במהירו?...

measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic ph and by alpha-expansin

גידול הצמח קירות התא אופיינית התערוכה מאפיין בשם &quot;צמיחה חומצה&quot;, שבו אנו מתכוונים הם הרחבה יותר ב-pH נמוך (&lt;5) 1. האוקסין הורמון מגרה צמח במהירות התארכות התא נובעת צעירים ורקמות דומה לפחות חלקית על ידי מנגנון חומצה צמיחה 2, 3. אוקסין מפעיל משאבת H + בקרום פלזמה, גרימת החמצה של הפתרון דופן התא. החמצה הכותל מפעיל expansins, אשר אנדוגני קיר התרופפות התא חלבונים 4, בגרימת דופן התא להיכנע המתחים קיר שנוצר על ידי לחץ turgor התא. כתוצאה מכך, התא מתחיל להגדיל במהירות. תופעה זו &quot;צמיחה חומצה&quot; נמדדת בקלות מבודדים (הדומם) דגימות דופן התא. היכולת של קירות התא לעבור חומצה הנגרמת הארכה אינה רק תוצאה של הסדר המבני של קיר סוכרים תא (פקטינים למשל), אבל תלוי בפעילות של expansins 5. Expansins אין שום הפעילות האנזימטית ידוע שהדרך היחידה assay לפעילות expansin היא למדוד גיוסם של הרחבה דופן התא. דו&quot;ח זה מפרט את מקורות וידאו וטכניקות הכנה לקבלת חומרים קיר מתאים מבחני expansin וממשיך להראות חומצה הנגרמת הארכה expansin-Induced הרחבה של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון גדל. כדי להשיג מתאים הקיר דגימות תאים, שתילי מלפפונים גדלים בחושך, hypocotyls נחתכים קפואים ב -80 ° C. Hypocotyls קפואים הם משופשפות, שטוח, והידק אז המתח המתמיד קובט מיוחד עבור מדידות extensometer. כדי למדוד חומצה הנגרמת הרחבה, הקירות שנאגרו בתחילה ב-pH נייטרלי, וכתוצאה מכך פעילות נמוכה של expansins כי הם מרכיבי דופן התא הילידים. עם חילופי חיץ pH חומצי, expansins מופעלים ואת קירות התא להרחיב במהירות. אנחנו גם מדגימים פעילות expansin ב assay הכינון מחדש. עבור חלק זה, אנו משתמשים טיפול בחום קצר לפגל expansins יליד בדגימות דופן התא. אלה קירות התא מומת לא להאריך גם חיץ חומציים, אך תוספת של expansins את קירות התא במהירות משחזר את יכולתם להאריך.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin at JoVE.com

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

אנו מדגימים את השימוש extensometer כוח קבוע, למדוד לטווח ארוך הארכה (זחילה) של תא הדגימות צמח קיר המושרה על ידי מאגרים חומציים חלבון expansin.

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

13.9K Views.  Penn State University. אנו מדגימים את השימוש extensometer כוח קבוע, למדוד לטווח ארוך הארכה (זחילה) של תא הדגימות צמח קיר המושרה על ידי מאגרים חומציים חלבון expansin.

Video: Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Title Cell Encapsulation by Droplets

תא כותרת Encapsulation על ידי טיפות

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

אגר-Block מיקרוקוסמוס של פירוק רקמות הצמח מבוקרת על ידי פטריות אירובית

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...