IEM הייתי רוצה להכיר המועצה למחקר הדנית (FTP ו FNU) למימון. ERL מכיר בתמיכה של ARC DP מענק. א.ב. מכיר בתמיכה של מרכז ARC ההצטיינות במענק קירות תא צמח.

1. אוסף רקמות והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף משקל 100 מ&quot;ג טריים של רקמות צמח (מינימום של 10 מ&quot;ג משקל יבש) לפחות בשלושה עותקים לכל רקמות של עניין. השלבים הבאים מתארים את ההכנה של חומר דופן תא מרקמות צמח. במקרה של רקמות אחסון, עמילן בלתי רצוי יוסר enzymatically לפני שימשיך בהפקת פולימרי דופן תא כפי שתואר קודם לכן 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני הדגימות לאבקה דקה עם חנקן נוזלי באמצעות Qiagen TissueLyser שני, עם 24 סטי מתאם צינור ו 3 חרוזי טונגסטן קרביד מ&quot;מ (30 הרץ, 2 x 30 שניות). לחלופין, אם רק כמה דוגמאות שנמצאות בעיבוד, מכתש ועלי משמשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את homogenates לתוך צינורות חרוטים 10 מיליליטר פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין חומרי דופן תא על ידי השטיפה בhomogenates מ&quot;ל 80% אתנול 10 V / v בRT וvortexing נמרצות עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב3500 XG ולהשליך supernatant. חזור על אתנול 70% שוטף לפחות שלוש פעמים או עד supernatant הוא ברור, במיוחד לרקמות המכילות כלורופיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה סופית עם אצטון 100% ולהשאיר את הכדורים המכילים שאריות אלכוהול מסיסות (אוויר) לייבוש אוויר הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננת דגימות האוויר עם 2 רשת 0.4 מ&quot;מ להשיג אבקה דקה, אחידה ולהסיר גדולים יותר, גרוע חלקיקי קרקע שמתישהו יישארו בhomogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל מדגם AIR 10 מ&quot;ג לmicrotubes, כל אחת מכיל 3 מ&quot;מ חרוז זכוכית כדי לסייע לערבוב של דגימות. </li></ol> 2. הפקת glycans דופן התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pectins, ופולימרים הקשורים pectins נשלפים מהדגימות על ידי הוספת 500 μl של 50 מיקרומטר CDTA (pH 7.5) לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת את הצינורות כדי להבטיח הממס הוא במגע עם החומר מדגם ואז לערבב באמצעות TissueLyser עבור 3 שעות ברץ 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב12000 XG, זהירות rסר את supernatants ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדורים ב1 מ&quot;ל של מים מיוננים כדי לדלל ולהסיר כל מערבולת שנותרה ממס וצנטריפוגה ב13000 x גרם. חזור על שלב זה מבלי להפריע הגלולה ולהסיר את כל הנוזל מהצינורות לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> glycans cross-linking מופקים ברצף מהתא שנותר קיר הגלולה עם 500 μl של NaOH 4M עם 0.1% w / v NaBH4, תוך שימוש באותו ההליך מתואר בצעדים 2.1-2.4 לחילוץ CDTA. NaBH 4 נוסף כדי לצמצם את קבוצת אלדהיד (או keto) בסוף הצמצום של הסוכרים לאלכוהול ובכך למנוע בסיס קילוף של סוכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, supernatants יוסר שוב, מאוחסן ב 4 ° C, ושטפו את הכדורים פעמים במים מיוננים לפני שימשיך לחילוץ הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כצעד אופציונלי, פולימרים השיורי, כגון תאי מופקים עם 500 cadoxen μl (31% v / v 1,2-diaminoethane עם 0.78 מ CDO) באותו האופן כפי שמתואר בצעדים 2.1-2.4. לחלופין, תוכן תאית מוחלט בכדורים נותרים ניתן לקבוע באמצעות מבחנים אצטית / חנקן (ראה דיון). </li></ol> 3. Microarrays הדפסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants צנטריפוגות מכילים פולימרי חילוץ דופן תא ב13000 XG כדי להסיר כל חומר חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 50 μl של כל דגימה לפוליפרופילן 384 גם צלחת microtiter באמצעות פריסה מותאמת אישית מראש תוכנן שבו דגימות מסודרות לפי סוג רקמה וסוג חילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את מדגם תא קיר הפולימר ב0, 5 ו 25 × סדרת דילול סדרתי עם מי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים כגון גובה סיכה, אוסף ולהתעכב זמן, וצעדי כביסה נקבעים על תוכנת שליטה microarrayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחות של חדר ההדפסה נשלטת על 60% כדי למנוע אידוי מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודת הדפסתו התחילה להשתמש LabNEXT Softwaמחדש ותכנית אשר תואמת את פריסת microarray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרובוט משתמש בסיכות ערוץ נימים להדפיס פתרונות מצלחת המדגם גבי קרום 20 x 20 סנטימטרי ניטרוצלולוזה אשר מצורף לצלחת שטוחה במכונה. כל נקודה במערך מכילה 15 nl של פתרון והוא מודפס בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microarrays הזהה מודפסים לצד זה על הקרום וחתוך למערכים בודדים לאחר עבודת ההדפסה הסתיימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל ניסוי את המערכים יכולים להיות שונים כדי להתאים פחות או יותר דגימות, דילולים או משכפל. </li></ol> 4. חיטוט של microarrays glycan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדפסה, לחסום את microarrays הבודד ב5% אבקת חלב רזה w / v מומסת בפוספט נאגרה מלוחה (Mpbs) בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות כדי להפחית מחייב הלא ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microarrays בדיקה עם נוגדנים ספציפיים לתא קיר glycan אפיטופים עבור 2 שעות בMpbs חד שבטיים. רוב antib חד השבטיodies נגד glycans דופן התא זמין מסחרי משלוש חברות; Biosupplies <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">(www.biosupplies.com.au),</a> שירותי Carbosource <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">(www.carbosource.net)</a> וPlantProbes <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">(www.plantprobes.net).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל שליטה שלילית, microarray מודגרות עם Mpbs בלבד ואין נוגדנים עיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את microarrays 3 פעמים בנאגרו מלוחות פוספט (PBS) למשך 5 דקות כדי להסיר מחייב הלא ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור את microarrays עם נוגדן מצומד לperoxidase חזרת (HRP) בMpbs ל2 שעות משני. נוגדנים חד השבטיים ביותר נגד glycans דופן התא דורשים נוגדנים משניים אנטי עכבר או אנטי עכברוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי כביסת 3 פעמים עם PBS חיץ למשך 5 דקות כדי להסיר מחייב הלא ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את microarrays באמצעות chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) או chemiluminecent (לומינול) מצעים. </li></ol> 5. קביעת כמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פיתוח, לסרוק את microarrays הבודד באמצעות רזולוציה גבוהה (1200 dpi) סורק שולחני ולשמור את התמונות כקבצים שליליים, 16-bit TIFF (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את העצמה בלתי נפרדת מכל מקום באמצעות Xplore תוכנת עיבוד תמונה (LabNEXT) המצוידת בכלי רשת אוטומטיות. עוצמת כתם בלתי נפרדת נגזרת מהסכום של פיקסלים באזור הרשת מסביב לכל מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את נתוני הרשת עבור כל microarray מיוצא כקובץ txt ויכולים ידניים ייובאו לתוך גיליון אלקטרוני Excel לצורך הניתוח. כלי מקוון <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">(http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/)</a> פותח כדי לתרגם באופן אוטומטי ולעבד נתונים מקבצי txt בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת המקום אינטגרלית בממוצע על פני דפוס משכפל ודילולים כדי להשיג &#39;נקודת ממוצעערך העצמה &quot;לכל דגימה (איור 2). לחלופין, אותות ספוט מתאימים רק לאחד הדילול ערך במערך משמשים לכמת את שפע epitope glycan היחסית לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמות הספוט הממוצעות היחסיות בין מדגמים שונים מוצגות כheatmap (איור 4) שימוש בעיצוב מותנה בכלי heatmapper Excel או מקוונים <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">(http://bar.utoronto.ca/welcome.htm).</a> נתונים לכל אחד מסוגי נוגדנים הם תקן ל 100 ו5% ערך סף מוטל להסיר אות רקע ותוצאות חיוביות שגויות. </li></ol>

<ol>
	<li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants:+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth.">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofuels.">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li><li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action,+matrix+properties,+and+cell+adhesion.">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li><li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls:+the+skeleton+of+the+plant+world.">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li><li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall:+searching+for+the+genes+that+define+structure,+architecture+and+dynamics.">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li><li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1.">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li><li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li><li>Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+in+context:+probes+for+cell+wall+analysis.">Molecules in context: probes for cell wall analysis.</a> The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).</li><li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies.">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li><li>Moller, I. E., S&#248;rensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays.">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li><li>S&#248;rensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays.">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li><li>Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens.">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).</li><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7,+JIM5+and+JIM7.">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li><li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls.">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li><li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray.">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li><li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules.">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li><li>Ca&#241;o-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana.">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li><li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea.">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li><li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles.">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li><li>S&#248;rensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+linkage+(1&#8594;3),(1&#8594;4)-&#946;-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls.">Mixed linkage (1&#8594;3),(1&#8594;4)-&#946;-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li><li>Domozych, D. S., S&#248;rensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga,+Chara.">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li><li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles.">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li><li>&#216;bro, J., S&#248;rensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays.">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

CoMPP היא שיטה מהירה ורגישה לאפיון הרכב glycan של מאה דגימות צמחיות בעניין של ימים. שיטה זו משלימה את הפלטפורמות הזמינות כבר חיידקים או יונקי glycan מערך לתפוקה גבוהה הקרנה של אינטראקציות פחמימות עם חלבוני glycan מחייב כגון קטינים, קולטנים, ונוגדנים 16. עם מגוון גדול של בדי?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 3 חרוזי טונגסטן קרביד מ&quot;מ </td><td> Qiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr><tr><td> microtubes אוסף (1.2 מ&quot;מ) </td><td> Qiagen </td><td> 19560 </td><td> 1.5 צינורות מיליליטר microfuge יכולים לשמש גם </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser השני </td><td> Qiagen </td><td> 85300 </td><td></td></tr><tr><td> 3 חרוזי זכוכית מ&quot;מ </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 34588 </td><td></td></tr><tr><td> קדמיום אוקסיד </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-diaminoethane </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 03550 </td><td></td></<html> p&gt; <tr><td> קרום ניטרוצלולוזה (0.22 גודל נקבובי מיקרומטר) </td><td> מים-GE ותהליך טכנולוגיות </td><td> EP2HY00010 </td><td> קרומים בגודל נקבובי שונים מתאימים לסוגים שונים פינים </td></tr><tr><td> Xact השני microarrayer רובוט </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> Xact השני הרובוט מצויד בצלחת מותאמת אישית 20 x 20 סנטימטר קרמיקה שקרום ניטרוצלולוזה מצורף </td></tr><tr><td> Xtend סיכות microarray RM </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> פינים חייבים להיות מתאימים להיווצרות כתם על קרומים </td></tr><tr><td> 384 צלחות microtiter היטב (פוליפרופילן) </td><td> גריינר </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים חד שבטי נגד glycan </td><td> בדיקות צמח / CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> אתרי אינטרנט; PlantProbes <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">(www.plantprobes.net),</a> (Carbosource&quot;Target =&quot; _blank ww.carbosource.net &quot;&gt; www.carbosource.net) וBiosupplies <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">(www.biosupplies.com.au).</a> </td></tr><tr><td> אנטי עכברוש IgG (כל מולקולה) - נוגדני peroxidase מיוצרים בעז. </td><td> סיגמא </td><td> A9037 </td><td> הסוג של נוגדנים משניים תלוי בנוגדן העיקרי בשימוש (למשל העלה בחולדה, עכבר, וכו &#39;עז). </td></tr><tr><td> SIGMA FAST 3,3 טבליות &#39;-Diaminobenzidine </td><td> סיגמא </td><td> D4293 </td><td> הסוג של פיתוח ריאגנט תלוי בנוגדנים מהשניים שיושמו ושל שיטת זיהוי (colourmetric, או chemiluminecent). </td></tr><tr><td> תשתית chemiluminescent פיק מערב SuperSignal </td><td> Thermoscientific </td><td> 34080 </td><td> ראה לעיל </td></tr><tr><td> Xplore תוכנת עיבוד תמונה </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> סוגים רבים תוכנה עם כלים אוטומטיים gridding זמיניםכדי למדוד את ערך פיקסל של כתמי microarray. </td></tr><tr><td> סוכרים צמחיים </td><td> סיגמא / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

glycan profiling of plant cell wall polymers using microarrays

קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות אשר משחק תפקיד חשוב בפיסיולוגיה וההתפתחות של צמחים ולספק את חומרי הגלם לחברות אנושיות (למשל תעשיות עץ, נייר, טקסטיל ודלק ביולוגיים) 1,2. עם זאת, הבנת יוסינתזה והתפקוד של רכיבים אלה נותר מאתגרים. glycans דופן תא מבחינה כימי וconformationally בשל המורכבות של אובניים הבניין שלהם, את שאריות glycosyl מגוון. קשרים אלה טופס בתפקידים מרובים ושונים במבנה טבעת, תצורת isomeric או anomeric, ובנוסף, הם מחליפים עם מערך של שאריות שאינן סוכר. הרכב glycan משתנה בתא אחר ו / או סוגי רקמות או אפילו תת דומיין של תא בודד חומה 3. יתר על כן, ההרכב שלהם גם לשינוי ב1 פיתוח, או בתגובה לאותות סביבתיים 4. ב לשעברCess של 2,000 גנים יש קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות נחזה להיות מעורבים בביוסינתזה תא קיר glycan ושינוי ב5 ארבידופסיס. עם זאת, מעטים יחסית של גני biosynthetic התאפיינו תפקודי 4,5. גישות גנטיקה הפוכות הן קשות כי את הגנים לעתים קרובות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, לעתים קרובות ברמות נמוכות, בין סוגי תאים 6. כמו כן, מחקרי מוטציה לעתים קרובות הפריעו יתירות גן או מנגנוני פיצוי על מנת להבטיח תפקוד דופן תא מתאים נשמר 7. לכן יש צורך בגישות חדשות במהירות כדי לאפיין מגוון הרחב של מבני glycan וכדי להקל על גישות גנומיקה תפקודיות לביוסינתזה הבנת תא קיר ושינוי. נוגדנים חד שבטי (בז) 8,9 צמחו ככלי חשוב לקביעת מבנה והפצת glycan בצמחים. אלה מכירים distאפיטופים נוכחיים בתוך סוגים עיקריים של glycans דופן תא צמח, כולל pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans וarabinogalactans inct. לאחרונה השימוש שלהם הוארך לניסויי הקרנה בקנה מידה גדול כדי לקבוע את השפע היחסי של glycans במגוון רחב של צמחים וסוגי רקמות זמנית 9,10,11. כאן אנו מציגים שיטת microarray מבוססת glycan הקרנה נקראת Profiling המקיף microarray הפולימר (CoMPP) (איורים 1 ו -2) 10,11 המאפשרת דגימות מרובות (100 שניות) שיוקר באמצעות פלטפורמת microarray מוקטנת עם ריאגנט המופחת וכרכי מדגם. אותות הנקודה על microarray ניתן לכמת באופן רשמי לתת נתוני כמותיות על התרחשות epitope glycan. גישה זו מתאימה גם למעקב אחר שינויים במערכות מורכבות glycan ביולוגיות 12 ומתן סקירה כללית של הרכב דופן תא במיוחד כאשר לפני הידע of זו אינה זמינה.

השפע היחסי של glycans בשישה סוגי רקמות (סיבי תועבה אחרות, אבקה, שחלות, עליי כותרת, עליי גביע וסטיגמה) מפרחי Nicotiana alata נקבע באמצעות CoMPP. האיור 3 א מציג microarray נציג שכבר גשש בJIM5 ספציפי מאב לאופן חלקי (נמוך) homogalacturonan methylesterified (ה&quot;ג), אשר מתרחש בepitope סוכרים פקטיניים 14. JIM5...

Watch this Scientific Journal Video about Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays at JoVE.com

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

טכניקה הנקראת<strong&gt; C</strong&gt; Omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; Icroarray<strong&gt; P</strong&gt; Profiling olymer (CoMPP) לאפיון של glycans דופן תא הצמח מתואר. שיטה זו משלבת את הספציפיות של נוגדנים חד שבטיים המופנים לאפיטופים glycan מוגדרות עם פלטפורמה אנליטית microarray מיניאטורי המאפשרת הקרנה של מופע glycan במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

glycan-profiling-of-plant-cell-wall-polymers-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  University of Melbourne. טכניקה הנקראת C Omprehensive M Icroarray P Profiling olymer (CoMPP) לאפיון של glycans דופן תא הצמח מתואר. שיטה זו משלבת את הספציפיות של נוגדנים חד שבטיים המופנים לאפיטופים glycan מוגדרות עם פלטפורמה אנליטית microarray מיניאטורי המאפשרת הקרנה של מופע glycan במגו?...

Video: Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The plant hormone auxin rapidly stimulates cell elongation in young stems and similar tissues at least in part by an acid-growth mechanism 2, 3. Auxin activates a H+ pump in the plasma membrane, causing acidification of the cell wall solution. Wall acidification activates expansins, which are endogenous cell wall-loosening proteins 4, causing the cell wall to yield to the wall tensions created by cell turgor pressure. As a result, the cell begins to enlarge rapidly. This 'acid growth' phenomenon is readily measured in isolated (nonliving) cell wall specimens. The ability of cell walls to undergo acid-induced extension is not simply the result of the structural arrangement of the cell wall polysaccharides (e.g. pectins), but depends on the activity of expansins 5. Expansins do not have any known enzymatic activity and the only way to assay for expansin activity is to measure their induction of cell wall extension. This video report details the sources and preparation techniques for obtaining suitable wall materials for expansin assays and goes on to show acid-induced extension and expansin-induced extension of wall samples prepared from growing cucumber hypocotyls.
 To obtain suitable cell wall samples, cucumber seedlings are grown in the dark, the hypocotyls are cut and frozen at -80 &deg;C. Frozen hypocotyls are abraded, flattened, and then clamped at constant tension in a special cuvette for extensometer measurements. To measure acid-induced extension, the walls are initially buffered at neutral pH, resulting in low activity of expansins that are components of the native cell walls. Upon buffer exchange to acidic pH, expansins are activated and the cell walls extend rapidly. We also demonstrate expansin activity in a reconstitution assay. For this part, we use a brief heat treatment to denature the native expansins in the cell wall samples. These inactivated cell walls do not extend even in acidic buffer, but addition of expansins to the cell walls rapidly restores their ability to extend.

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

We demonstrate the use of a constant-force extensometer to measure long-term extension (creep) of plant cell wall specimens induced by acidic buffers and expansin protein.

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...