המחברים מודים הווארד יוז רפואי במכון למדע UF לפרס החיים על AH

1. הכנת קלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מול נקי ובחזרה צלחות קלטת שימוש Invitrogen Nupage minigel Novex או minigel אחר קלטת מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 1-3 מ&quot;ל של כ אפוקסי פלסטיק ומערבבים היטב על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל אפוקסי לקצה בתוך צלחת הקדמי, שבו שני לוחות יבוא במגע כאשר את הקלטת מורכבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק פיסת נייר קרטון פילטר או דרך החריץ התחתון של הלוח האחורי כאשר הרכבת את הקלטת כדי למנוע אפוקסי עודפי איטום הפתיחה. הסר את הנייר מסנן מיד את שני לוחות מורכבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מהדקים יחד את הקצוות של חותם חזק, ולתת קלטות יושבים לילה עבור אפוקסי באופן מלא לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החריץ בחלק התחתון של הלוח האחורי עם הקלטת חשמל. </li></ol> 2. לשפוך ג&#39;ל לפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי בקבוק 125 מ&quot;ל בצד הזרוע, להוסיף את הדברים הבאים:2.25 מ&quot;ל של 4X-טריס בסיס פתרון של ג&#39;ל חיץ pH 8.70, 3.50 מ&quot;ל של acrylamide 30.8% / bisacrylamide, 3.25 מ&quot;ל של מים סוג אני מגיב כיתה (IRG-H 2 O) על בהיקף כולל של 9 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה גז פתרון 10 דקות על ידי הצמדת היד בצד של הבקבוק למכשיר ואקום, והנחת פקק הפוך על החלק העליון של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר 9 מ&quot;ל של פתרון דה הגזים כדי 50 מ&quot;ל הפנויה צינור פוליפרופילן צנטריפוגות ולהוסיף 30 μl של persulfate ammounium 10% (APS) ו 6 μl של N, N, N &#39;, נ&#39;,-tetramethylethylenediamine (TEMED) ומערבבים היטב על ידי מתערבל פתרון כדי למנוע החדרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מיד את הפתרון אל תוך קלטת, הפעלתו את הצד של הקלטת למנוע בועות מ טביעה בין צלחות ג&#39;ל. למלא את הקלטת של כ 2 ס&quot;מ מהקצה העליון של הלוח (קצר) הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 0.5 מ&quot;ל של butanol-1 רווי חיץ 1X ג&#39;ל לפתרון ולתת ג&#39;ל לפלמר עבור 1שעה. </li></ol> 3. לשפוך ג&#39;ל לערום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הדברים הבאים בקבוק 125 מ&quot;ל לצד הזרוע: 0.75 מ&quot;ל של pH טריס 4X-Base הערמה ג&#39;ל חיץ 6.80, 0.40 מ&quot;ל של acrylamide 30.8% / bisacrylamide, 1.85 מ&quot;ל של IRG-H 2 O על בהיקף כולל של 3 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה גז פתרון דקות 10 כמתואר בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הפתרון ג&#39;ל לערום הוא degassing, יוצקים מעל 1-butanol רווי חיץ פתרון של 1X ג&#39;ל מהחלק העליון של ג&#39;ל לפתרון. יש לשטוף את החלק העליון של ג&#39;ל לפתרון פעם אחת עם IRG-H 2 O. יוצקים את המים ולהשתמש נייר bibulous או Whatman מסנן לספוג כל נוזל הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 3 מ&quot;ל של תמיסת degassed ולהוסיף 9 μl של APS 10% ו 2 μl של TEMED ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות יוצקים את הפתרון קלטת, הפעלתו את הצד של הקלטת עד קרוב לקצה העליון של הצלחת קצר ג&#39;ל הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מסרק ג&#39;ל נקי לתוך החלק העליון של קלטת ג ​​&#39;ל,למקם קליפ קלסר על קלטת על מסרק להחזיק אותו במקום. בואו ג&#39;ל לערום לפלמר שעה 1 עד לילה. </li></ol> 4. אחסון ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ג&#39;ל יש מפולמר לגמרי, להסיר את הסרטונים בינדר למקם את הקלטת בנרתיק חום רב סגר פלסטיק או שקית מחדש סגר פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 20 מ&quot;ל של חיץ 1X לערום ג&#39;ל המכיל אזיד הנתרן 0.1% בתוך כיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים לאטום את הכיס עבור 5 שניות כדי לוודא שאין נזילות בתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן את הג&#39;ל על 4 ° C. </li></ol> 5. הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור דק דופן microcentrifuge, מסתכמים μl 6.5 המדגם חלבון, 7.5 μl של חיץ 2x Novex SDS טריס-גליצין המדגם, 1 μl של 100 mM dithiothreitol (DTT) וכן IRG-H 2 O (במקרה הצורך) על הנפח הכולל של μl 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם על ידי vortexing, ובקיצור צנטריפוגות מדגם להביא התוכן לחלק התחתון של הצינור. </li> &lt;li&gt; לפגל את המדגם על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li></ol> 6. הרצת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מנגנון ג&#39;ל Novex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מ&quot;ל של חיץ טריס-גליצין ריצה המכיל 500 μl של נוגדי חמצון Nupage לחדר הפנימי, 300 מ&quot;ל של טריס-גליצין הפעלת המאגר אל החדר החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את דגימות חלבון מפוגל (15 μl) לתוך הבארות באמצעות טעינת ג&#39;ל עצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על V 200 דקות 60-70. </li></ol> 7. מכתים ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקלטת מן המנגנון ג&#39;ל ולשבור את החותם אפוקסי ידי חטטניות שתי צלחות פלסטיק ג&#39;ל זה מזה באמצעות סכין ג&#39;ל או סכין מרק נוקשה. בזהירות להפריד ג&#39;ל מן הצלחות, נזהרת שלא לקרוע את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הג&#39;ל עם IRG-H 2 O שלוש פעמים עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל עם Invitrogen SimplyBlue SafeStain שעה 1 עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון מכתים וdestain ג&#39;ל עם IRG-H 2 O. </li></ol> 8. ניקוי קלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית מתכת לגרד או לקלף אפוקסי על כל הקלטות, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כל הצלחות ג&#39;ל פלסטיק עם פתרון חומר ניקוי עדין, ולשטוף היטב במי ברז לאחר מכן במים מזוקקים. </li></ol> 9. נציג תוצאות בגלל אפוקסי יהוו חותמת מים חזק, (איור 1), קלטות לא ידלפו כאשר הפתרון acrylamide הוא שפך לתוכם. בנוסף, קלטות הג&#39;ל ניתן לפתוח בקלות כדי לאחזר את הג&#39;ל על מכתים, ו אפוקסי ניתן קילף של הקלטות, כדי לאפשר המשך שימוש חוזר שלהם. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ג&#39;ל מראה הפרדה ברורה של סמנים חלבוניים ולהקות מדגם מתאים אלקטרופורזה חלבון שגרתית. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Appliקטיון של אפוקסי לאטום קלטות minigel. בשכבה דקה של אפוקסי מוחל על קצה 1 של הקלטות לקראת האסיפה. כדי להדגיש את אפוקסי, זה היה שקר בצבע אדום בתמונה זו. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הפרדת חלבונים על ג&#39;ל SDS-טריס-גליצין מזג באמצעות שימוש חוזר קלטות minigel. SDS-PAGE בוצע כפי שתואר לעיל. אלקטרופורזה הבאה ג&#39;ל הוסרה קלטת minigel, מוכתם ב SimplyBlue SafeStain לפי הוראות היצרן, וצילם באמצעות אור לבן מועבר. ליין M מכיל SeeBlue Plus2 מראש מוכתמים סטנדרטים חלבון. משקל מולקולרי של חלבונים במסלול M מצוינים בצד ימין של ג&#39;ל ב kiloDaltons (KDA). בסמטאות אחרים מראים חלבונים מן lysate פינה מחיידקים המבטאים גלוטתיון-S-transferase (GST), מתויג חלבון. החלבונים הם אלה המוצגים שטף מ glutathione חרוזים שקדמו elution של חלבון GST-מתויג.

<ol>
	<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis.">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shapiro, A. L., Vi&#241;uela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels.">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה חלבון היא שיטה הכרחית עבור מעבדות ביולוגיה מולקולרית ביותר. Minigels זמינים מסחרית לספק רמה גבוהה של נוחות, אבל יכול להיות יקר. כאן אנו מראים כיצד לעשות שימוש חוזר בקלטות minigel של המותג הפופולרי של minigels זמינים מסחרית. שיטה זו שומרת על הנוחות של בעל מקור המ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Invitrogen Nupage Novex Minigel קלטת (1.0 מ&quot;מ) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> ניתן להשיג 2, 5, 10, 12, 15 ו - 2 ד בארות </td></tr><tr><td> פלסטיק אפוקסי </td><td> Loctite </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> חשמל Tape </td><td> סקוטש </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 מ&quot;ל הזרוע בצד הבקבוק </td><td> פיירקס </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X-טריס בסיס פתרון של מאגר ג&#39;ל </td><td></td><td></td><td> 1.5 מ &#39;טריס בסיס pH 8.7 </td></tr><tr><td> acrylamide </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> BIS-acrylamide </td><td> Biomedicals מגה פיקסל, Inc </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> Acrylamide 30.8% הפתרון </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 acrylamide: BIS-acrylamide ב IRG-H 2 O </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP179-25 </td><td> 0.1 persulfate גרם אמוניום ב 1 מ&quot;ל IRG-H 2 O, מוכנים מיד לפני השימוש </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Arcos Organics </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-butanol רווי חיץ ג&#39;ל פתרון של 1X </td><td></td><td></td><td> 05:02 1-butanol למאגר 1X ג&#39;ל פתרון של </td></tr><tr><td> ג&#39;ל טריס 4X-Base לערום חיץ </td><td></td><td></td><td> 1.5 מ &#39;טריס בסיס pH 6.8 </td></tr><tr><td> ג&#39;ל מסרק </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 ובכן, 1.0 מ&quot;מ עובי </td></tr><tr><td> הדחף אוטם </td><td> TEW אלקטריק ציוד חימום </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פאוץ סגר חום </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 ליטר בגודל (6.5 &quot;x 8&quot;) </td></tr><tr><td> ג&#39;ל למאגר אחסון </td><td></td><td></td><td> 1X לערום חיץ ג&#39;ל עם אזיד הנתרן 0.1% </td></tr><tr><td> Novex SDS טריס-גליצין מדגם חיץ (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> ריצה 10X טריס-Gylcine חיץ </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 1 ליטר של המניה 10X: 29.0 גרם טריס-Base, 144.0 גרם גליצין, 10.0 גרם SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל סכין </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue בטוח כתמים </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </tד&gt; <td></td></tr></tbody></table>

pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes

הערכה של חלבונים באמצעות סולפט dodecyl נתרן polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ניתוח היא טכניקה נפוצה בשימוש על ידי חוקרים לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית 1-4. עבור מעבדות המבצעות בדיקות יומיות של חלבונים, העלות של ג&#39;ל polyacrylamide זמינים מסחרית (~ $ 10/gel) יכול להיות משמעותי לאורך זמן. כדי להקטין את העלות, כמה חוקרים להכין ג&#39;ל שלהם polyacrylamide. השיטות המסורתיות של לשפוך את הג&#39;לים בדרך כלל לנצל ציוד מיוחד ו ג &#39;ל זכוכית צלחות כי יכול להיות יקר למנוע לשפוך ג&#39;ל רבים ואחסונם לשימוש עתידי. יתר על כן, טיפול של לוחות הזכוכית במהלך ניקוי או ג&#39;ל לשפוך יכול לגרום שבירה בשוגג יצירת מפגע בטיחותי, אשר עשוי למנוע את השימוש בהם בשיעורי מעבדה לתואר ראשון. פרוטוקול שלנו מדגים כיצד לשפוך ג&#39;ל חלבונים רבים בו זמנית על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel, ותואר שני זולterials לרכוש בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג&#39;לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג&#39;ל פלסטיק של ג&#39;ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג&#39;ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה. בנוסף, קלטות ג&#39;ל פלסטיק עמידים מאוד שבירה, מה שהופך אותם אידיאליים עבור כיתות מעבדה לתואר ראשון.

Watch this Scientific Journal Video about Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes at JoVE.com

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

פרוטוקול שלנו מדגים כיצד למזוג ג &#39;ל חלבון מרובים בכל פעם על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel וחומרים זולים שנרכשו בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג&#39;לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג&#39;ל פלסטיק של ג&#39;ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג&#39;ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה.

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

pouring-and-running-a-protein-gel-by-reusing-commercial-cassettes

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  University of Florida. פרוטוקול שלנו מדגים כיצד למזוג ג 'ל חלבון מרובים בכל פעם על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel וחומרים זולים שנרכשו בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'...

Video: Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

A Simple and Inexpensive Running Wheel Model for Progressive Resistance Training in Mice

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most recently, weighted-sled pulling, are highly effective at providing a hypertrophic stimulus to induce skeletal muscle adaptations. While these models have proven invaluable for skeletal muscle research, they are either invasive or involuntary and labor-intensive. Fortunately, many rodent strains voluntarily run long distances when given access to a running wheel. Loaded wheel running (LWR) models in rodents are capable of inducing adaptations commonly observed with resistance training in humans, such as increased muscle mass and fiber hypertrophy, as well as stimulation of muscle protein synthesis. However, the addition of moderate wheel load either fails to deter mice from running great distances, which is more reflective of an endurance/resistance training model, or the mice discontinue running nearly entirely due to the method of load application. Therefore, a novel high-load wheel running model (HLWR) has been developed for mice where external resistance is applied and progressively increased, enabling mice to continue running with much higher loads than previously utilized. Preliminary results from this novel HLWR model suggest it provides sufficient stimulus to induce hypertrophic adaptations over the 9 week training protocol. Herein, the specific procedures to execute this simple yet inexpensive progressive resistance-based exercise training model in mice are described.

This procedure describes a translatable progressive loaded running wheel resistance training model in mice. The primary advantage of this resistance training model is that it is entirely voluntary, thus reducing stress for the animals and the burden on the researcher.

דגם גלגל ריצה פשוט וזול לאימוני התנגדות פרוגרסיביים בעכברים

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most ...

פישוט מחקרי אנגיוגנזה עם בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

מחבר זרקור: חקירת אנגיוגנזה וחדירות כלי דם באמצעות בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...