עבודה זו ממומנת על ידי DFG.

<html> Bee הכנה לראש מילוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס מלקטי מזון דבש דבורים אל הכוורת ומקררים על קרח immobilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר של פרספקס 3 חדרי הקלטה. תיקון עיניים החזה על הקירות של החדר הקלטה בשעווה נקודת התכה נמוכה קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך זכוכית נימים כמו נפוץ electrophysiology ולשבור בקצה להשיג בקוטר טיפ של CA. 10μm. כיסוי קצה של נימי עם לצבוע ולהדביק. הדבק דיי מורכב מתערובת של 10:01 Fura-2 dextran וליזין ניתן לתקן tetramethylrhodamine dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך ההליך מכתים לשתק אנטנות עם לפרטי פרטים או n-eicosane. הסר חתיכת לציפורן מעל המוח לדחוף בלוטות קנה הנשימה בצד כדי לאפשר גישה גוף הפטרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק לתוך הנימים סומה או אזור axonal של נוירונים הגוף פטריות. ניתן לעשות זאת ביד חופשית או באמצעות מניפולטור מיקרו. ואז לשחזר פיסת לציפורן על הקפסולה הראש לשחרר אנטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזנת דבורים עם פתרון סוכרוז 30% לפני אחסונם במקרה humidified לפחות ארבע שעות או יותר בלילה 20 ° C. </li></ol> בשנת vivo הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניעת תנועות למשל דבורה עם חתיכה קטנה של ספוג כי הוא נלחץ הבטן קבוע עם קליפ או סרט לתא הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע תנועה של המוח הנובע שאיבה של הוושט, לחתוך חתך קטן לתוך לציפורן מעל labrum ולשלוף בזהירות הוושט ומבנים המקיפים שלה מוצק לשים את זה תחת מתח מבלי לפגוע הוושט 4. עם כיסוי סיליקון דו רכיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חורים עם מחט ולהכניס אלקטרודות חוט הקלטה של ​​M17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פיסת לציפורן, קנה הנשימה ובלוטות מעל המוח. תמצצי heamolymph בתוך הקפסולה בראש עם פיסת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הקפסולה עם ראש סיליקון דו רכיבי. חשוב המוח מכוסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום דבורה על הבמה מיקרוסקופ ומקום טיפת מים על פני השטח של סיליקון כדי לטבול את המטרה מטבל של המיקרוסקופ לתוך אגל. פוקוס על נוירונים מוכתם. </li></ol> ריח גירויים הקלטה של ​​אותות Olfactometer: אנו משתמשים במחשב מבוקר, גירוי אישית בנוי המכשיר, או &quot;olfactometer&quot; כפי שתואר לעיל על ידי גליציה ו וטר 3. ריחות הם מדולל לתוך זרם אוויר קבוע מכוונת האנטנות. כל גירוי מורכב הדופק -3 ריח של אוויר רווי ריח 0.2ml. פרוטוקול גירוי ניתן להגדיר TILLVision את תוכנת ההקלטה. מיקרוסקופ והדמיה הגדרת: אנו משתמשים מיקרוסקופ פלואורסצנטי Zeiss. תמונות נרשמות 25 מעלות צלזיוס עם קצב הדגימה של 5 הרץ באמצעות מכשיר עד-Photonics הדמיה רכוב על המיקרוסקופ. אותות סידן נרשמים דרך X60, 0.9 W אולימפוס לטבול אובייקטיבי עם CCD Imago המצלמה (640x480 פיקסלים, 4X זרקת לפח על שבב כדי 160x120 פיקסלים). Fura-2 הוא נרגש עם אור מונוכרומטי של אורך גל 340 ו 380nm עבור מדידות ratiometric. Fluorescence מזוהה באמצעות מראה dichroic 410nm ו 440nm מסנן לעבור זמן רב. הפרמטרים של ההקלטה נקבעים בתוכנת הצריבה. מדידת משך כל 10s זמן חשיפה לשני אורכי הגל יכול להיות מותאם לעוצמת מכתים לקראת כל אחד. M17 הקלטה: השריר מד של labium (M17) היא רשמה extracellularly לפקח על תגובות התנהגותיות הקשורות למידה, כלומר 5 אחוזים, 6. להזריק חוטי נחושת לתוך השריר קרוב חלקי הפה. הזרק אלקטרודה הקרקע לתוך העין. פוטנציאלים השריר הם מוגבר עם מגבר טרום אישית לבנות, ו דיגיטלית המאוחסן במחשב. תחילת Stimulus מופעלת על ידי olfactometer. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הניסוי: ההקלטות של האות סידן מוזנים למחשב ומאוחסנים. TILLVision תוכנת הצריבה מאפשר בדיקה ראשונית של אותות, כמו חישוב היחס בין אורכי הגל (340nm/380nm) וחישוב deltaF (חיסור של הבסיס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד תמונה מבוצעת עם תוכניות נכתב מותאם אישית IDL. חישוב יחס של Ca 2 + אותות 340nm ו 380nm מדידות עבור כל פיקסל. קביעת רקע הקרינה (F) על ידי ממוצע של מעל מסגרות לפני הגירוי ואת לגרוע האות ratiometric (deltaF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר אזור אינטרסים (ROI): חישוב ממוצע של מסגרות במהלך הגירוי ואת להחיל מסנן לעבור נמוכה (3X3px). המרת מידה אפור בקנה מידה צבע שווא. קביעת פעילות מבנים עצביים כמו כתמים פעילות בתמונות צבע שווא מגדירים את ההחזר על ההשקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הדינמיקה הזמני של האזורים הפעילים על ידי חישוב ממוצע הפיקסלים ההחזר על ההשקעה על פני כל המסגרות ללא סינון או תיקון. </li></ol>&gt; ניתוח לשיקום מורפולוגיים יחד עם dextran Fura-2 אנחנו ממלאים את הנוירונים ניתן לתקן עם צבע rhodamine dextran (&quot;מיני אודם&quot;). צבעים לשניהם משקל מולקולרי דומה: הם צריכים להיות שותף נמצא הנוירונים. רחב בתחום ההדמיה מאפשר רק ברזולוציה מרחבית מוגבל מאוד, ולכן מומלץ לבדוק את המבנים מוכתם לאחר הניסוי באמצעות מיקרוסקופ סורק confocal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי מדידות פיזיולוגיות, לנתח מוח לקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב PBS ו מייבשים בשלבים באתנול וברור salycilate מתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופיה confocal להטביע במוח salycilate מתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים במיקרוסקופ TCS לייקה SP2. גל עירור הוא 543nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו לסרוק את המוח עם אוויר או טבילה אובייקטיבי שמן ולהשוות את המבנים מוכתם נתוני הדמיה. </li></ol> נציג תוצאות: אם מכתים והכנת היה מוצלח, האות בסולם צבע שווא, למשל פטריות הגוף אלפא נוירונים באונה חיצוני, יכול להיראות כמו באיור 1. התגובה ההתנהגותית (PER) ניתן לחשב את תדירות ספייק במהלך הגירוי מינוס תדירות ספייק לפני הגירוי (figure2). המבנים מוכתם עשוי להיחקר ביתר פירוט באמצעות מיקרוסקופ confocal (figure3). <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="איור 1" /> איור 1: נציג הדמיה סידן אותות (גירוי עם heptanal). ת: אזור הדמיה של המוח דבורה. ב &#39;: תמונה פלורסנט גלם כמו לראות דרך X20 לטבול אובייקטיבי עירור באורך גל 380nm, את אלפא האונה של הגוף פטריות המתואר סגול. דיי היה מוזרק לשפה ventro-לרוחב של אלפא האונות להכתים הנוירונים החיצוניים. C: תמונת צבע שקר נגזר האות הממוצע, deltaF (340/380), גירוי במהלך שלוש השני; אלפא האונה המתוארות סגול, התווה ROI נבחרים שחור. D: הדינמיקה הזמני של האות סידן בתגובה לגירוי ריח, האות הממוצע מאזור ריבית כפי שמצוין ב C. E: הדינמיקה הזמני של האות סידן בתגובה גירוי סוכרוז של ipsi ו-קונטרה לרוחב אנטנה בהתאמה ROI המצוין ב C. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> איור 2: תגובה נציג M17. לאחר מיזוג הריח הדבורה מרחיב את חוטם כאשר ריח מוצג ללא תגמול. הקו האדום מציין גירוי ריח. הבלעה: PER של דבורת דבש. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> איור 3: מחסנית תמונה ייצוגית. לאחר הניסוי הדמיה מוחית היה גזור. הנוירון מדמות 1 נסרק באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרה X20 שמן טבילה, אלפא האונה המתוארות סגול.

<ol>
	<li>Joerges, J., K&#252;ttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain.">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li><li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+honeybee's+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings.">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li><li>Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Analyzing+Odor-Evoked+Activity+in+the+Insect+Brain.">Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain.</a> Methods in Insect Sensory Neuroscience. , 345-388 (2004).</li><li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain.">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li><li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica,+Hokaido+Univ.">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li><li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+(Apis+mellifera.">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li></ol>

במצגת זו אנו עברו את כל השלבים לחקור אותות סידן vivo של דבורת דבש. אנחנו מוחלים בטכניקה זו כדי נוירונים הגוף פטריות, אבל הדמיה ניתן לעשות על כל הנוירונים אשר טכניקה מכתים ניתן להקים. התמקדנו נוירונים במסלול חוש הריח של הדבורה דבש. הניסויים מתבצעים כל בחדר חושך. הגדרת מואר באור גל ארוך הנמצא מחוץ לטווח את התפיסה האופטית של הדבורה ואינו להלהיב את צובעת. חשוב להימנע מכל החפצים ניאון, לאוויר בועות למשל הסיליקון. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא האפשרות לטעום מידע על פעילותם של הנוירונים עם רזולוציה במרחב ובזמן. במקביל, אנו עשויים לבחון את התנהגות הדבורים רלוונטי כאשר למשל פלסטיות קשור למידה בנוירונים הוא להיחקר. עם זאת, ההחלטה במרחב ובזמן מוגבל. שימוש בתחום ההדמיה סידן vivo, זמן הניסוי מוגבל. אמנם, עם שיטות אלקטרו תאיים, הקלטות יכולה להימשך שעות או כמה ימים, בניסויים שלנו מוגבלים על 90 דקות. איתותי עדיין טוב למדי כאשר אנו מבצעים 85 מדידות עם עירור על ידי שני אורכי גל בקצב דגימה 5Hz, מדידה מתמשכת כל 10 שניות, חשיפה 340nm להיות 20ms ו 5ms חשיפה 380nm קיימא, בהתאמה. לאחר מכן לצבוע הלבנת עלול להוות בעיה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>low melting point hard wax Deiberit 502</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr. B&ouml;hme & Sch&ouml;ps Dental GmbH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>F-3029</td>
<td>Protect from light.</td>
</tr>
<tr>
<td>tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>D-3312</td>
<td>Protect from light.</td>
</tr>
<tr>
<td>n-eicosane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>21, 927-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik Sil Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>KWIK SIL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Set-up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TILL Photonics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imago</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo ca2+- imaging of mushroom body neurons during olfactory learning in the honey bee

In vivo למחצה בהכנת vivo הדמיה סידן פותחה במעבדה שלנו על ידי Joerges, קוטנר ואת גליציה לפני יותר מעשר שנים, כדי למדוד את פעילות ריח עורר באונה מחושים 1. מכאן ואילך זה כבר מעודן ברציפות להחיל neuropiles שונים במוח הדבורה. כאן, אנו מתארים את הכנת המשמש כיום במעבדה כדי למדוד פעילות הנוירונים בגוף הפטרייה באמצעות מצמידים dextran סידן רגיש צבע (Fura-2). אנו retrogradely כתם נוירונים גוף הפטרייה על ידי הזרקת צבע לתוך האקסונים שלהם או באזור סומה. אנו מתמקדים בהפחתת הפולשנות, כדי להשיג הכנה שבו עדיין אפשר לאמן את הדבורים באמצעות PER מיזוג. אנו מסוגלים לפקח לכמת את התגובה ההתנהגותית באמצעות הקלטה אלקטרו myograms של השריר השולט PER (M17) 2. לאחר הניסוי פיזיולוגיים המבנים צילמו נחקרות ביתר פירוט באמצעות מיקרוסקופ סורק confocal לכתובת זהותו של הנוירונים.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee at JoVE.com

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

דבורים יכול להיות מותנה פרדיגמה למידה תיאבון חוש הריח (PER מיזוג). באמצעות ריחות כמו גירויים, הקמנו שיטה שבה התנהגות נרשם ובמקביל הדמיה סידן משמשת למדידת פעילות ריח עורר בנוירונים גוף הפטרייה<em&gt; In vivo</em&gt;.

בשנת vivo Ca 2 + - הדמיה של נוירונים גוף אינפקטד במהלך הלמידה חוש הריח של דבורת הדבש

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

in-vivo-ca2-imaging-mushroom-body-neurons-during-olfactory-learning

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

13.9K Views.  Freie Universität Berlin. דבורים יכול להיות מותנה פרדיגמה למידה תיאבון חוש הריח (PER מיזוג). באמצעות ריחות כמו גירויים, הקמנו שיטה שבה התנהגות נרשם ובמקביל הדמיה סידן משמשת למדידת פעילות ריח עורר בנוירונים גוף הפטרייה In vivo.

Video: In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible circuitry. In addition, this area's unique ability to generate new neurons throughout an organism's lifetime makes it an attractive system for developmental and regenerative biologists alike. Such interest necessitates a means for a quick, yet reliable assessment of olfactory function. Many tests of olfactory ability are complex, variable or not specifically designed for mice. Also, some tests are sensitive to memory deficits as well as defects in olfactory abilities, confounding obtained results.
Here, we describe a simple battery of tests designed to identify defects in olfactory sensitivity and preference. First, an initial general health assessment allows for the identification of animals suitable for further testing. Second, mice are exposed to various dilutions of scents to ascertain whether there is a threshold difference. Third, mice are presented with various scents, both attractive and aversive, that allow for the assessment of olfactory preference. These simple studies should make the initial characterization of olfactory behavior accessible for labs of varied resources and expertise.

Fundamental, yet unique properties of the rodent olfactory system have led to its increasing study among biologists. A relatively simple assessment of its function is then also needed. Here we describe sensitive tests for the characterization of mouse olfactory sensitivity and preference.

בדיקה התנהגותית חוש הריח של העכבר למבוגרים

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential amplitude of action potential signatures over the channels of a tetrode allows for the isolation of single-unit activity from multi-unit signals.  The ability to precisely control the stereotaxic location and depth of the tetrode is critical for studying coordinated neural activity across brain regions.  In combination with a micro-drive array, it is possible to achieve precise placement and stable control of many tetrodes over the course of days to weeks.  In this protocol, we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes using basic tools and materials, install the tetrodes into a multi-drive tetrode array for chronic in-vivo recording in the rat, make ground wire connections to the micro-drive array, and attach a protective cone onto the micro-drive array in order to protect the tetrodes from physical contact with the environment.



Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

In this protocol we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes for use with a micro-drive array, which was designed for chronic electrophysiological recordings in rats. In addition, we illustrate the final stages of micro-drive array construction, which includes installing ground wires and a protective cone.

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo</emהקלטה>: Tetrode האסיפה

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

קבלת דגימות עם מואט, מואצת והפוך הזדקנות של דבורת דבש הדגם

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

שיטות להשוואה בין חומרים מזינים בBeebread נוצרו על ידי דבורים דבש Africanized ואירופאי והשפעות על titers חלבון Hemolymph

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

דיסקציה תצפית של כלי דבש דבורים הגבי ללימודים של תפקוד הלב

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...