הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקדם את הבנתנו את הטיפול בסידן בתאי עצב, וכיצד סידן ממודר יכול לווסת מנגנונים שונים החשובים לתפקוד העצבי in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת דימות מהיר ברזולוציה גבוהה יותר in vivo בתנאים פיזיולוגיים ב- C.elegans שניתן לשלב עם כלים פלואורסצנטיים אחרים. טכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנון המווסת איתות סידן בתאי עצב בהקשרים רבים ושונים.

לדוגמה, במהלך הזדקנות, פגיעה עצבית, ניוון עצבי. מי שידגים הליך זה יהיה אניס דייהל, טכנאי מחקר. קז נייט, דוקטורנטית, ורייצ'ל דוזר, חוקרת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.

התחל בשיבוט וקטורי ביטוי המכילים מקדם ואחריו מחוון סידן, ושלושה UTR ראשוניים לבחירה. יצירת זנים טרנסגניים של C.elegans על ידי מיקרו-הזרקה של תערובת DNA המכילה את DNA ההצלה Lin-15 בתוספת בטרנסגן אינדיקטור הסידן לגונד של C.elegans בוגר בן יום אחד. שמרו על תולעי ההורה המוזרקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שצאצאי F1 יגיעו לבגרות.

בחר מבוגרים טרנסגניים על ידי הקרנה להיעדר פנוטיפ רב פות. זה מצביע על ביטוי של המערך הכרומוזומלי הנוסף המכיל את מחוון הסידן. מעבר קלונלי צאצאי F1 בוגרים שאין להם את הפנוטיפ הרב-פותי.

בצע ניסויים על הדורות הבאים של הזנים הטרנסגניים עם ביטוי אופטימלי של מחוון הסידן. השתמש במיקרוסקופ המסוגל לבצע הדמיה בהילוך מהיר לטווח ארוך. אתר את התולעת תחת יעד הגדלה נמוכה ולאחר מכן עבור ליעד הגדלה גבוהה כדי למקם את הנוירונים.

השג את התמונות באמצעות מצלמה רגישה במיוחד המסוגלת לקלוט תמונה במהירות של יותר מ- 50 FPS. לאחר מכן, השתמש במסנן פליטה סטנדרטי עבור מחוון הסידן. הוסף מתקן Z-drift לקבלת זרמי תמונה ארוכים מ- 10 שניות.

בשפופרת תרבית זכוכית בגודל 13 על 100 מילימטר, הכינו שלושה מיליליטר של 10% אגר על ידי המסת אגר ברמה מולקולרית ב-M9 וחממו במיקרוגל למשך מספר שניות. כדי להכין את רפידות האגר, ראשית, הכינו שתי שקופיות על ידי הוספת שתי שכבות של סרט מעבדה. לאחר מכן הניחו שקופית מיקרוסקופ בין שתי השקפים.

חתכו קצה של קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר והשתמשו בו כדי לקלוט טיפה קטנה של אגר למרכז חלקת הכיסוי. שטח את האגר על ידי לחיצה על שקופית נוספת למטה על גבי האגר. לאחר הקירור, חותכים את האגר לדיסק קטן באמצעות פתיחת צינור 10 מיליליטר, ולאחר מכן מסירים את האגר שמסביב.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת גלגול התולעים על ידי המסת אבקת מוסצימול ב-M9 ליצירת ציר של 30 מילימולרי. לדלל את המלאי ביחס של אחד לאחד עם חרוזי פוליסטירן כדי ליצור את הפתרון המתגלגל. כדי למקם את התולעת להדמיה, ראשית, הניחו 1.6 מיקרוליטר של התמיסה המתגלגלת על מרכז כרית האגר.

לאחר מכן באמצעות קוטף תולעים מועדף, מעבירים תולעת בגיל הרצוי לתמיסת הגלגול על כרית האגר. המתן כחמש דקות עד שהמוצימול יפחית את תנועת התולעת, ולאחר מכן שחרר כיסוי בגודל 22 על 22 מ"מ על גבי כרית האגר. להדמיית נוירוטים בחוט העצב הגחוני, גלגלו את התולעת על ידי החלקה קלה של החלקת הכיסוי.

כדי להרכיב את התולעת על המיקרוסקופ, הניחו טיפת שמן טבילה על חלקת הכיסוי. מצא את התולעת באמצעות מטרת הגדלה נמוכה בשדה בהיר. לאחר מכן עבור למטרה של 100x ואתר את נוירוט AVA באמצעות ההארה של GCaMP או mito GCaMP עם לייזר הדמיה של 488 ננומטר.

להדמיית GCaMP in vivo, כוונן את לייזר ההדמיה בהגדרות הרכישה עד שהפלואורסצנטיות של GCaMP בזיליקום תהיה בטווח האמצעי של הטווח הדינמי של המצלמה והגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות השנייה. לאחר איתור הנוירוט AVA באמצעות פלואורסצנטיות GCaMP בהגדלה של פי 100, הגדר את מתקן Z-drift והתחל מיקוד אוטומטי רציף. תקן ידנית את מישור המוקד לפי הצורך לפני ההדמיה.

קבל זרם של תמונות בהגדלה של פי 100. באמצעות פרוטוקול זה, סידן ציטופלזמי נמדד ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה. הביטוי הספציפי לתא של GCaMP6F בתאי העצב הבין-עצביים של פיקוד AVA הגלוטמטרגי חשף התפשטות כיוונית של זרם הסידן.

הכימות התת-תאי של פלואורסצנטיות GCaMP6F הראה כי תחילת זרימת הסידן התעכבה בחלק של הנוריט הממוקם במרחק של 10 מיקרומטר בלבד. כמו כן, מבנים דמויי עמוד שדרה דנדריטיים שנמצאו לאורך נוריט AVA הראו הבזקים בפלואורסצנטיות GCaMP6F שהתרחשו ללא תלות בהפעלת הנוריט ולא הובילו להתפשטות של זרם הסידן. יתר על כן, רמות הסידן היחסיות נמדדו במיטוכונדריה בודדת בנוירונים בודדים באמצעות זן תולעת עם ביטוי ספציפי AVA של המטריצה המיטוכונדריאלית המקומית אינדיקטור סידן mito GCaMP.

התוצאות הראו ספיגה סינכרונית של כמות גדולה יחסית של סידן לתת-קבוצה של מיטוכונדריה. באופן ספציפי, ספיגת הסידן בחלק מהמיטוכונדריה הייתה מסונכרנת, בעוד שבמיטוכונדריה שכנים לא נראה שהם סופגים סידן. באופן דומה, תת-קבוצות של מיטוכונדריה הראו ספיגה ושחרור מהירים של כמויות קטנות של סידן.

גם זה נראה סינכרוני, אבל רק עבור תת-קבוצה של מיטוכונדריה. מהירות ומניפולציות עדינות חיוניות למיקום בעלי חיים ולשמירה על תפקוד עצבי. גם בריאות בעלי החיים היא בעלת חשיבות עליונה.

אפילו קצת רעב הוא בעייתי. החלק הקשה ביותר ללמוד הוא ההתמצאות המהירה של בעלי החיים למיקרוסקופ קונפוקלי ללא נזק. העצה שלי היא הרבה תרגול ובקרות טובות.

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בניסויים שבהם סידן משתחרר ממקומות תת-תאיים אחרים בנוירונים, נוירונים אחרים או תאים שאינם נוירונים ב- C.elegans. מכיוון שגישה זו ב- C.elegans משאירה בעלי חיים ללא פגע, ניתן לענות על שאלות לגבי ויסות הטיפול בסידן תת-תאי in vivo בתאי עצב בודדים של מערכת עצבים שלמה.