כמה אנשים תרמו לעבודה מתוארת במאמר זה. CVG נבנה מערך הניסוי, וLS, הא&quot;ס, וCVG בצעו את הניסויים. CVG והא&quot;ס כתבו את כתב היד. כל המחברים לאחר מכן לקחו חלק בתהליך השינוי ואשרו את העותק הסופי של כתב היד. אנו מודים לפול סטרנברג למתח GCaMP. כמה זנים נמטודות משמשים בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז (CGC), אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). תכנית ניתוח תמונת MATLAB עובדת מזה המשמש בגיל 18. המחברים נתמכו על ידי אוניברסיטת בוסטון ומסצ&#39;וסטס חי מרכז המדעים.

<ol>
	<li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Kerr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875 (2009).</li><li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Rand, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine.">Acetylcholine.</a> WormBook. , (2005).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).</li><li>Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li><li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li><li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans.">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li><li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li><li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans.">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxic+MEC-4(d)+DEG/ENaC+sodium+channel+conducts+calcium:+implications+for+necrosis+initiation.">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אינדיקטורים סיד מקודד גנטי כבר נוצלו באופן נרחב בג elegans נוירוביולוגיה. קבוצות רבות שהעסיקו הטכניקות הללו כדי ללמוד תגובה של תאי עצב התחושתי העיקרי לגירויים חיצוניים כפי שמודגם כאן בתגובת ASJ לשדה חשמלי. דוגמאות בולטות כוללות תחושת המגע מכאני, כימיקלים מסוימים, ט?...

כאן אנו מציגים שיטות מעשיות לתחום הדמית vivo סיד בג הנוירונים elegans. הפיתוח של fluorophores סיד רגיש המקודד גנטי עם יחס גבוה בין אות לרעש גורם ג elegans מערכת יעילה יחסית פשוטה ועלות למדידת נוירופיזיולוגיה ופעילות. ההדמיה שלנו נעשתה באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי באמצעות דימות פלואורסצנטי שדה הרחב של fluorophores הזמין בדרך כלל. אנו מציגים כמה טכניקות המעסיקות fluorophores שונה ותכשירים שונים לדוגמה, דנים בנקודתי החוזק והחולשה של כל אחד. נתונים שהוצגו אז משני ניסויים לדוגמה. משאב נוסף מצוין בטכניקות המתוארות כאן ניתן למצוא בWormBook, &quot;הדמיה את הפעילות של תאי עצב ושרירים&quot; על ידי ר &#39;קר, <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">(http://www.wormbook.org</a> 3). שני סוגים עיקריים של genetiכתבי סיד ניאון מקודדים קאלי משמשים בדרך כלל בג elegans: GCaMP ערוץ אחד וCameleon סריג מבוסס. אנו מתארים שיטות ולהראות דוגמאות לנתונים שנוצרו על ידי כל אחד. GCaMP מבוסס על חלבון שונה גרין פלורסנט (GFP), כי הוא רגיש לריכוז הסיד שמסביב. המטרה זו מושגת על ידי שילוב של GFP וcalmodulin חלבון זיקת סידן הגבוה, באופן שמחייב של סידן על ידי calmodulin מביא מולקולת GFP לאישור ניאון יעיל 2. את הפיתוחים האחרונים בfluorophores אלה יוצרים גודל אות יוצא דופן עם גידול של עד 500% בעוצמת קרינה על פני טווח פיסיולוגי של רמות הסידן וקינטיקה במהירות סבירה של זמן ~ 95 אלפיות עלייה ודעיכה ~ 650 אלפית 4. על פני תקופות זמן קצרות יחסית (דקות), האותות הגדולים האלה יכולים לאפשר להדמיה ברזולוציה נמוכה יותר (גדלה נמוכה יותר), וניתנו מחונך initמדידת קו הבסיס IAL, שוללת את הצורך הבסיסי רציפות או מדידות השוואתיות. Cameleon יש את היתרון של להיות fluorophore סריג מבוסס שמייצר מדידת ratiometric השוואה שני ערוצים או אורכי גל 1 עצמאיים. זה מורכב משני fluorophores הנפרד (חלבוני ניאון וצהוב ציאן פולט, וYFP CFP) מקושר על ידי חלבון calmodulin. המתחם מואר באור כחול (440 ננומטר) שמרגש CFP. עקידת הסיד מביאה את fluorophores ביחד קרוב, הגדלת העברת אנרגית תהודת פלואורסצנטי (סריג) מCFP (תורם) לYFP (acceptor) וגורם לפליטת CFP (480 ננומטר) כדי להקטין וYFP הפליטה (535 ננומטר) כדי להגדיל . רמות סידן יחסיות נמדדות כיחס בין עוצמת YFP / CFP. קינטיקה Cameleon היא איטיות יותר מזה של GCaMP, נמדד בגוף חי יש זמן עלייה של ~ 1 שניות וזמן דעיכה של ~ 3 שניות 5. עם זאת,היחס של אותות הפוכים נעים מגדיל את גודל האות ומפצה על מספר החפצים אפשריים עקב שינויים בריכוז fluorophore, תנועה או להיסחף פוקוס וההלבנה. כתבי ניאון מקודד גנטי לשלול הרבה של הכנת המדגם הנדרש עם בדיקות מנוהלות exogenously וג גוף שקוף קטן elegans מאפשר הדמיה תוך שימוש בבעלי החיים בשלמות פלואורסצנטי שדה הרחב פשוט. האתגר הטכני העיקרי בהכנת מדגם לכן, כדי לשתק את החיות בשלום. ישנן מספר טכניקות שונות נפוצים כל אחד עם יתרונות וחסרונות. שימוש תרופתי לשתק את בעלי החיים הוא קל לביצוע ומאפשר הרכבה של חיות מרובות בהכנה אחד (Levamisole, אגוניסט כולינרגית שגורם לרקמת שריר לתפוס הוא בדרך כלל בשימוש 6). ג elegans גם יכול להיות משותק מבחינה פיזית על ידי הרכבתםעל נוקשה 10% agarose 7, 8. השפעה זו מצמצמת בפיזיולוגית בעלי חיים, מאפשרת הדמיה לטווח ארוך (שעות) והתאוששות של בעלי חיים רבים, אבל הוא יותר קשה מבחינה טכנית. שתי הטכניקות האלה להגביל את הגישה פיזית לבעלי החיים (שהם תחת תלוש כיסוי) ולכן יכולים לשמש רק עם גירויים ניסיוניים מסוימים (כמו אור, טמפרטורת שדה, חשמלי או ניזק ליזר). לגירויים שבו גישה פיזית נדרשת, כגון מגע או ממשל של כימיקלים, מחקרים רבים דבוקים בהצלחה ג elegans במקום (באמצעות דבק כיתת וטרינרית) 9. זה יותר מאתגר מבחינה טכנית, הוא תכשיר בהמה אחת ולא מאפשר התאוששות של בעלי חיים. לבסוף, מכשירי microfluidic רבים להיות מועסקים כי פיזי לרסן ג elegans, שימור פיזיולוגית בעלי חיים, המאפשר חשיפה למרבית סוגי גירויים (תלוי בעיצוב המכשיר) ויכול לאפשר חליפין והתאוששות מהירים של בעלי החיים <sup&gt; 10, 11. עם זאת מיקרופלואידיקה דורשת כישורים טכניים נוספים ויכולות בעיצוב, ייצור ויישום. בפעילות וגירוי חיות משותקות תגובה כלל ניתן למדוד בחושי וinterneurons. פעילות של תאי עצב מוטורי דורשת טכניקות מתוחכמות יותר עבור הדמיה בחיות נעות. כאן אנחנו נציג שיטות מפורטות המעסיקות את שתי טכניקות הפשוטות ביותר של השבתה וקיבוע עם agarose הנוקשה תרופתיות. השיטות שהוצגו כאן יכולות לשמש למדידת פעילות עצבית ופיזיולוגיה של תא בג elegans. אנחנו נותנים דוגמה לכל אחד: שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של ASJ נוירון לשדה חשמלי חיצוני, ובאמצעות Cameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית לסיד ניזק ליזר של תא עצב. דוגמאות אלו מראות את היתרונות וחסרונות של שני סוגים של fluorophores ולהמחיש מה אפשרי עם המערכת.

<table><tbody><tr><td>Eclipse Ti-U inverted&lt;br/&gt; microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Fluorescent light source</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical table or 3&#039;X3&#039; optical&lt;br/&gt; grade breadboard</td><td>Thor Labs</td><td></td><td>If an optical table is not used an&lt;br/&gt; optical grade breadboard on a&lt;br/&gt; solid laboratory bench should&lt;br/&gt; suffice.</td></tr><tr><td>Clara Interline Camera</td><td>Andor&lt;br/&gt; Technology</td><td></td><td>High-sensitivity CCD camera</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emission</td><td>Chroma Technology&lt;br/&gt; Corp.</td><td>41015</td><td>GFP filter set for imaging GCaMP</td></tr><tr><td>Filter 440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>excitation filter for cameleon</td></tr><tr><td>Dichroic mirror &amp;gt; 455 nm&lt;br/&gt; longpass</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>microscope dichroic for cameleon&lt;br/&gt; imaging</td></tr><tr><td>Dichroic mirror &amp;gt; 515 nm&lt;br/&gt; longpass</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>dichroic mirror for cameleon&lt;br/&gt; imaging</td></tr><tr><td>Filter 535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP emission filter</td></tr><tr><td>Filter 480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP emission filter</td></tr><tr><td>Lens, 200 mm, Achromat</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Relay lens for FRET optics (3)</td></tr><tr><td>Silver broadband mirror</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>FRET optics (2)</td></tr><tr><td>NGM buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, 2.5% by&lt;br/&gt; volume, 50 nm&lt;br/&gt; diameter</td><td>polystyrene nanoparticles for &lt;em&gt;C.&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;elegans &lt;/em&gt;immobilization</td></tr><tr><td>Transgenic strain, Strain&lt;br/&gt; &lt;em&gt;gpa-9::GCaMP3(in pha-1;&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;him-5 bkg) &lt;/em&gt;</td><td>Sternberg Lab</td><td>Strain PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Transgenic strain, &lt;em&gt;mec-&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;4::YC3.60&lt;/em&gt;</td><td>Gabel Lab</td><td>Strain CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

נמטודות התולעת ג elegans הוא אורגניזם מודל אידיאלי להדמיה פשוטה יחסית, בעלות נמוכה עצבית בגוף חי. גופו הקטן השקוף ופשוט, מערכת עצבים היטב מאופיינת מאפשר זיהוי והדמית קרינה של כל נוירון בתוך החיים השלמים. טכניקות קיבוע פשוטות עם השפעה מינימאלית על הפיסיולוגיה של בעלי החיים מאפשרות שיקוף מורחב זמן לשגות. הפיתוח של fluorophores הרגיש סיד הגנטי מקודד כגון 1 Cameleon וGCaMP 2 לאפשר בתחום הדמית vivo של סיד עצבי הנוגע גם פיזיולוגיה של תא ופעילות עצבית. זנים מהונדסים רבים מבטאים fluorophores אלה בתאי עצב ספציפיים הם זמינים או ניתן לבנות תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים הליכים מפורטים למדידת דינמיקת הסידן בתוך תא עצב יחיד בגוף החי הוא באמצעות GCaMP וCameleon. אנו דנים ביתרונות וdisadvantגילים גם כן שיטות שונות של הכנת מדגם (קיבוע בעלי חיים) וניתוח תמונה. לבסוף, אנו מציגים תוצאות משני ניסויים: 1) שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של נוירון ספציפי לשדה חשמלי חיצוני ו2) שימוש בCameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית של סיד נוירון לניזק ליזר טראומטי. שיטות הדמית סידן כגון אלה נמצאים בשימוש נרחב בג elegans והורחב למדידות בבעלי חיים שנעו בחופשיות, נוירונים מרובים בו זמנית והשוואה על פני רקע גנטי. ג elegans מציג מערכת חזקה וגמישה להדמיה עצבית vivo עם יתרונות על פני מערכות מודל אחרות בפשטות ועלות טכניות.

כאן אנו מציגים תוצאות משני ניסויים נפרדים. 1 מעסיק GCaMP למדוד את התגובה של תא עצב תחושתי ספציפי לגירוי חיצוני מוגדר, נותן דוגמה טובה כיצד ניתן להשתמש בו לכתבי סיד ניאון אופטי כדי לעקוב אחר פעילות עצבית בג השלם elegans. 2 מעסיקים Cameleon למדוד סיד החולף התאי מופעל בתוך...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans at JoVE.com

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים ריאגנטים,<em&gt; ג elegans</em&gt; עושה אורגניזם מודל אידיאלי עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה עצבית תוך שימוש בטכניקות פשוטות יחסית, בעלות נמוכה. כאן אנו מתארים הדמית נוירון בודדה בתוך בעלי חיים מבוגרים ללא פגע באמצעות אינדיקטורים סיד ניאון מקודד גנטי.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.8K Views.  Boston University School of Medicine. עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים ריאגנטים, ג elegans עושה אורגניזם מודל אידיאלי עבור In vivo הדמיה עצבית תוך שימוש בטכניקות פשוטות יחסית, בעלות נמוכה. כאן אנו מתארים הדמית נוירון בודדה בתוך בעלי חיים מבוגר?...

Video: In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Behavior

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Developmental Biology

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Biology

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video