עבודה זו נתמכה על ידי טכנולוגיות proteomic קליניים בסרטן יוזמת, 5U24CA126477-04.

1) הכן לקטינים, מצומדות עמודות פורוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו מסכה על מנת להגן מפני שאיפה של פורוס-AL חרוזים במהלך השלבים 1.1-1.2. תשקלי את הכמות הרצויה של חרוזים פורוס (100 מ&quot;ג beads/300 נפח סופי μl) ולהעביר לתוך צינור Eppendorf נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם תוספת של 1 מ&quot;ל בופר פוספט (PBS). גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge במהירות המרבית במשך 3 דקות. הסר supernatant וחזור על לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקלי את הכמות הרצויה של לקטינים unconjugated (1 - 4 מ&quot;ג / 200 חרוזים μl) ומעבירים צינור Eppendorf נקי. הוסף PBS להקים 5-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון. רזרב 25 μl של פתרון זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לקטינים הנותרים החרוזים פורוס. הוסף cyanoborohydride נתרן לריכוז סופי של 50 מ&quot;מ. מניחים את הצינור על כיסא נדנדה ולהגיב הלילה בטמפרטורת החדר. (הערה:. Cyanoborohydride נתרן הוא רעיל ויש לטפל במנדף קטר פסולת מזוהמות חייב להיות מסולק כראוי.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה פורוס חרוזים כמו בשלב 1.2. הסר supernatant ולשמור כפתרון שלאחר נטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוזים הצפת 1 מ&quot;ל מרווה (1 טריס M-Cl, pH 7.4). חרוזים גלולה כמו בשלב 1.2 בבטחה להשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת האתרים תגובתי הנותרים על חרוזים פורוס עם הצפת מרווה 1 מ&quot;ל. הוסף cyanoborohydride נתרן לריכוז סופי של 50 מ&quot;מ. מניחים את הצינור על כיסא נדנדה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים כמו בשלב 1.2 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוזים 1 מ&quot;ל 1 M NaCl. גלולה חרוזים להשליך supernatant. חזרו על התרגיל ארבע פעמים עבור סכום כולל של חמישה שוטף. החרוזים מוכנים כעת לארוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את כמות החלבון כי היה מצומדות של חרוזים פורוס, לבצע ריכוז חלבון assay על הפתרונות לקטינים מראש מצומדות ופוסט מצומדות. ההבדל בריכוזים הוא כמות חלבון זה היה מצומדות של חרוזים. כמות החלבון מצומדות לכל נפח חרוז שווה את הריכוז של לקטינים על החרוזים. לקטינים ריכוזי היעד הם בין 2 ל -20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> 2) אריזה לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הצצה לתוך עמודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מערכת אריזה (תיאור להלן) ותמיכה אותו על דוכן טבעת מתכת. מערכת האריזה כוללת, מלמטה למעלה, צמצם לחץ, טור סוף מצמד 1, frit, עמודה (2 x 50 מ&quot;מ), טור סוף מצמד 2, מחבר טור, טור סוף מצמד 3, עמודה (4.5 x 50 מ&quot;מ), טור סוף מצמד 4 והתאמת סוף. העמודה העליונה משמשת כמאגר חומר האריזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend החרוזים פורוס בנפח הרצוי מאגר (10 mM טריס חיץ, pH 7.4, נתרן כלוריד 150 מ&quot;מ, סידן כלוריד 10 מ&quot;מ, 10 מגנזיום כלוריד mM). אם האריזה עמודה אחת (~ 200 נפח המיטה μl), resuspend א &#39;400 הצפת μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה מצומדת חרוזים פורוס לתוך הטור העליון (מאגר). הוסף חוצץ למאגר עד למאגר מגיע לראש הטור. בעדינות למקום הולם על סוף החלק העליון של העמוד, מנסה למנוע בועות אוויר בעמודה. חיבור מתאים לסוף הטור העליון למערכת HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבילת הטור ידי הצפת זורם דרך מערכת. התחל עם קצב הזרימה של 0.5 mL / min. להגדיל את קצב הזרימה על ידי כל דקה 0.5 mL / min עד 4 או mL / min או את הלחץ המקסימלי (3,000 psi) הושג. המשך בקצב הזרימה המקסימלית האפשרית לפחות עד 35 מ&quot;ל של הצפת עברו הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את משאבות לאפשר את הלחץ על הטור לרדת &lt;20 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות, לפרק את המערכת האריזה, החל מלמעלה. כאשר טור סוף 2 מצמד הוא הגיע, להסיר בזהירות. כמה חומר צריך להיות ארוז extruding מהחלק העליון של העמודה. עם סכין גילוח או קצה חד דומה, בעדינות לנגב את אגלי extruding, משאיר משטח חרוז זה גם עם החלק העליון של העמודה. אל תפעילו לחץ על החרוזים בעוד עושה את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הטור ארוז מדוכן טבעת. מניחים frit חדשים מצמד סיום חדש ולהפוך את הטור ארוז על להתחבר זה עם מצמד frit / סוף בקצה (העליון לשעבר) לפתוח עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית העמודה כראוי. עכשיו זה מוכן לשימוש. כאשר לא בשימוש, בעמודה ניתן לאחסן PBS עם אזיד הנתרן 0.02% ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li></ol> 3) תוכנית HPLC השיטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרטים של תכנות HPLC שלך ישתנו בהתאם הפרטים של תוכנה של היצרן. אנו משתמשים HPLC פרדיגמה Michrom MG4. במחשב זה, שיטות בנויים לגשת תחת הלשונית &quot;הגדרות&quot; בחלק העליון של המסך. תוכנית בשיטה הבאה: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זמן </td><td> קצב זרימה (μl / min) </td><td> % </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> הצפת: 10 mM טריס חיץ, pH 7.4, נתרן כלוריד 150 מ&quot;מ, סידן כלוריד 10 מ&quot;מ, 10 מגנזיום כלוריד mM מאגר ב &#39;: 0.5 חומצה אצטית M גלאי UV צריך להיות מתוכנת לקרוא 280 ננומטר 0:00-19:50. ציר y צריך להיות מותאם כדי לזהות נמוכה ספיגת רמות, למשל, 0 -. 50 יחידות אסטרונומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם autosampler היא תוכנית זמין, את לוח הזמנים הבאים עבור אוסף חלק. אחרת, לאסוף את השברים ביד, כמצוין בעת ​​ביצוע כרומטוגרפיה. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חלק </td><td> עיכוב לאוסף של הזרקה מדגם </td><td> משך האיסוף (דקות) </td></tr><tr><td> זרימה דרך </td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td> כבול </td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) הכן דגימות HPLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש בפרוטוקול זה, פלזמה אדם צריך להיות מדולדל של 14 חלבונים ביותר שופע באמצעות טור MARS (Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה). מדולדלים פלזמה, אדם לקטופרין ו invertase שמרים צריך להיות בנפרד טריפסין-מתעכל desalted כפי שתואר לעיל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את לקטינים ספציפי לקטופרין סטנדרטי, לבצע כרומטוגרפיה על UG 50 טריפסין-מתעכל לקטופרין מעל או אאל או העמודה SNA בשיטת בחלק 3. חלק מחויב יכיל לקטינים ספציפי glycopeptides לקטופרין. לנטרל את דגימות כמו חלק 4.4, ו desalt כמו חלק 6. Resuspend המדגם ב 1 מ&quot;ל הצפת א המדגם המתקבל הוא מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ניסויים משכפל יבוצעו. כדי להכין מדגם שלושה משכפל, להוסיף 3 pmol של invertase-טריפסין מתעכל 1 μl של לקטינים ספציפי לקטופרין (או אאל-LAC או SNA-LAC) עד 30 μl מאדים מדולדל, טריפסין, מתעכל, ושווי פלזמה (PE). PE מוגדר בנפח הפלסמה non-processed/intact/original שממנו כמות נתונה של פלסמה מעובד (Mars-מדולל טריפסין מעוכל) נגזר. הוסף חוצץ המדגם להגיע נפח סופי של μl 330. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ נטרול (1 מ טריס pH 8.0), את בקבוקוני מדגם כי תאסוף eluate. מספר ונפח צלוחיות אתה עובד עם יהיה תלוי האילוצים של autosampler שלך. עבור הפרדיגמה MG4, אחד בקבוקון אוספת את הזרימה דרך שתי לאסוף את eluate. זה ידרוש כ -1.5 מ&quot;ל טריס חיץ לנטרל 1 מ&quot;ל של eluate. PH יעד לנטרל הוא 7.0-8.0; מבחן מבחן ה-pH הסופי עם נייר אינדיקטור pH. </li></ol> 5) בצעו כרומטוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל ריק מדגם פועל שאחריו יהיה להשתמש בשיטה המתוארת חלק 1. טור מאגרים הם בטמפרטורת החדר בזמן השימוש. עמודות מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס, בעוד מאגרים מאוחסנות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף גם את אאל או העמודה לקטינים SNA למערכת HPLC ולהפעיל שתי שיטות ריק (הזרקת הצפת בלבד). ודא כי עמודת לקטינים תואמת את לקטינים ספציפי לקטופרין (חלק 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומטוגרף שלוש דגימות פלזמה, הזרקת ריק בין כל דגימה מוזרק, עבור סכום כולל של 7 ריצות HPLC. שברים של ריצות ריק לא צריך להיות אסף. </li></ol> 6) Desalt שנאספו שברים לשבריר אחד להשתמש באחד 1 מ&quot;ל ווטרס אואזיס HLB SPE מחסנית כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מספר מחסניות נדרש סעפת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב כל מחסנית עם ACN מ&quot;ל 1 80% חומצה פורמית 1% (מד ואקום על סעפת צריך לקרוא 5-20 lnHg). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן מחסניות עם חומצה פורמית 0.1 מ&quot;ל 1.5% (מד ואקום על סעפת צריך לקרוא 5-20 lnHg) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען נפח שלם של דגימה אחת על גבי מחסנית אחת (מד אבק על סעפת צריך לקרוא 2 -. 2.5 lnHg, וקצב הזרימה לא יעלה על 1 mL / min) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 3 מחסניות חומצה פורמית x 1 מ&quot;ל 0.1% (מד אבק על סעפת צריך לקרוא 5-20 lnHg) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים Elute / glycopeptides שכותרתו לתוך צינורות Eppendorf עם אצטוניטריל 1 x 1 מ&quot;ל 80% ב חומצה פורמית 0.1%. (מד אבק על סעפת צריך לקרוא 2-2.5 lnHg, ואת קצב הזרימה לא יעלה על 1 mL / min). צינורית אוסף יחיד אמור לשמש עבור כל מחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל eluate ידי הוספת 60 μl ביקרבונט 0.5 M אמוניום על כל צינור איסוף. יעד neutrpH alized הוא הוא 7.0-8.0; pH המבחן הסופי עם נייר אינדיקטור pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז פפטידים eluted / glycopeptides כדי μL 50 ~ ידי הפעלת אותם על צנטריפוגה ואקום (למשל, מלומד Thermo SpeedVac) עבור ~ 2 שעות @ 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם בדיקת pH כדי להבטיח שהוא בין 7.0-8.0. במידת הצורך, להוסיף 50 אמוניום ביקרבונט mM להגדיל את ה-pH. אם נפח דגימה סופית&gt; 100 מדגם μl, speedvac עד שהוא μl בין 50-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.5 μl (250 U) גליצרול ללא F PNGase על צינור אחד מדגם לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 8) עצה דגימות Zip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל PNGase F-מתעכל דגימות, ziptip כל אחד כדלקמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ziptip רטוב עם אצטוניטריל 10 μl 100%, ואחריו אצטוניטריל 10 μl 80%, חומצה פורמית 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן ziptip עם חומצה פורמית μl 20 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען המדגם על ziptip על ידי pipetting אותה למעלה ולמטה באמצעות המטריצה ​​ziptip 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ziptip ידי pipetting 10 חומצה פורמית μl 0.1%, 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המדגם לתוך צינור Eppendorf נקי עם אצטוניטריל 10 μl 80%, חומצה פורמית 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על elution ולהוסיף את μl 10 second לתוך הצינור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Speedvac דגימות לנפח של 2 μl &lt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Resuspend ב חומצה פורמית μl 20 0.1%. דוגמאות מוכנים כעת לניתוח על ידי LC-MS/MS. </li></ol> 9) נציג תוצאות: נטיה פורוס בדרך כלל התשואות על חרוז ריכוזי לקטינים בטווח של 2-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. זה אופטימלי זיקה כרומטוגרפיה. כרומטוגרפיה לקטינים של טריפסין-מתעכל מאדים מדולדל האדם פלזמה בדרך כלל מעשיר glycopeptides בשבריר כבול. כפי glycopeptides הם PNGase F-שטופלו לפני LC-MS/MS, הם מזוהים פפטידים עם רצף N-linked את הקונצנזוס, NXS / T (כאשר X הוא שאריות אבל פרולין), שבו asparagine שהומרה חומצה אספרטית דרך הפעולה של פפטידים PNGase פ עם מאפיינים אלה נחשבים deglycosylated פפטידים (או &quot;deglycopeptides&quot;). בממוצע את הזרימה דרך שבריר (FT) מ אאל או SNA כרומטוגרפיה deglycopeptides מכיל 2-4%, לעומת 30-50% של פפטידים התאושש בשבריר כבול הם deglycopeptides. בדרך כלל, באמצעות עלית QStar, 1000-1300 פפטידים יזוהו בשבריר FT, ו - 200-400 פפטידים יזוהו בשבריר כבול. שניים או יותר deglycopeptides Invertase ברורים צריכים להיות שנצפתה השבר FT ושני או יותר deglycopeptides ברורים לקטופרין בשבריר כבול (טבלה 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="טבלה 1" /> טבלה 1.

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה עבור בידוד וזיהוי glycopeptides glycan באופן ספציפי. כפי glycosylation משתנה בהרחבה בתוך אורגניזם, במיוחד במהלך פיתוח בפתוגנזה, טכניקה זו עשויה להיות ישימה כתובת מגוון רחב של שאלות. בפרט, אנו משתמשים בשיטה באופן סלקטיבי להעשיר glycopeptides ששונו עם סרטן הקשורים epitopes כצעד ראשון לקראת גילוי סמן ביולוגי.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aleuria aurantia lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sambucus nigra agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

Glycans הם המעמד החשוב של הפוסט translational שינויים. נמצא בדרך כלל על מופרש ומולקולות תאית, מבנים glycan האות מצב פנימי של התא. Glycans על תאים סרטניים נוטים להיות חומצה sialic שפע moieties fucose. אנו מציעים כי אלו סרטן הקשורים וריאנטים glycan ניתן לנצל לפיתוח סמנים ביולוגיים שנועדו לאבחן בשלב מוקדם של המחלה. בהתאם לכך, פיתחנו ספקטרומטריית מסה מבוססי זרימת עבודה המשלבת כרומטוגרפיה על מטריצות זיקה נוצר לקטינים, חלבונים הנקשרים glycan מבנים ספציפיים. Sambucus לקטינים nigra (SNA) ו Aleuria aurantia (אאל), אשר נקלטות חומצה fucose sialic ו, בהתאמה, היו מצמידים קוולנטית כדי חרוזים פורוס (Applied Biosystems) וארז לעמודות הצצה עבור כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC). בקצרה, פלזמה היה מדולדל של עשר חלבונים הנפוץ ביותר בשימוש זיקה מרובים הסרת מערכת (Mars-14, Agilent). היה מדולדל פלזמה טריפסין-מתעכל מופרדים זרימה דרך שברים מחויב SNA או אאל HPLC. שברים טופלו PNGaseF להסיר N-linked glycans, ונותחו על ידי LC-MS/MS על עלית QStar. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה Mascot. תכנון הניסוי כללו חיובי שולטת-fucosylated ו sialylated האדם glycopeptides ו לקטופרין השלילית שולטת גבוהה glycopeptides מנוז מ-Saccharomyces cerevisiae ששימשו כדי לפקח על סגוליות של לכידת לקטינים. התכונות העיקריות של זרימת עבודה זו לכלול את שחזור שמקורם בפורמט HPLC, זיהוי חיובי של glycopeptides בשבי PNGaseF שטופלו מן המוטיבים deamidated שלהם Asn-Xxx-Ser/Thr, והערכת איכות באמצעות סטנדרטים גליקופרוטאין. פרוטוקול אופטימיזציה כללה גם בקביעת יחס מתאים של חומר המוצא ליכולת טור, זיהוי ללכוד היעילה ביותר מאגרים elution, וניטור PNGaseF הטיפול כדי להבטיח deglycosylation מלא. כיוונים עתידיים כוללים באמצעות זרימת עבודה זו כדי לבצע ספקטרומטריית מסה מבוססי ניסויים הגילוי על הפלזמה של חולי סרטן השד ויחידים שליטה.

Watch this Scientific Journal Video about A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples at JoVE.com

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הועסקו על HPLC. סטנדרטים Glycopeptide שימש שולטת חיוביים ושליליים. מאדים 14 מדולדל, טריפסין-מתעכל פלזמה האדם היה chromatographed ו flow-through (FT) וכן שברים מחויב שנאספו עבור ניתוחים ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides היו מועשר בשבריר מחויב לעומת FT.

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Views.  University of California, San Francisco - UCSF. לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הועסקו על HPLC. סטנדרטים Glycopeptide שימש שולטת חיוביים ושליליים. מאדים 14 מדולדל, טריפסין-מתעכל פלזמה האדם היה chromatographed ו flow-through (FT) וכן שברים מחויב שנאספו עבור ניתוחים ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides היו מועשר בשבריר מחויב לעומת FT.

Video: A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects on bone repair in a unicortical defect model. Treatment of mesenchymal cells produced an increase in alkaline phosphatase activity, showed nodule formation by the cells, and increased the expression of genes for runx2, osterix, bone sialoprotein, and osteocalcin. A collagen sponge soaked with peptide promoted repair of bone defects, whereas the control was less effective. The results from this study demonstrated that mesenchymal cells treated with peptide in vitro differentiate towards osteogenesis, and, that peptides delivered in vivo using a collagen sponge promote the repair of unicortical defects.

A phage display library was used to identify peptide sequences that target bone. The objective was to investigate the effect of these peptides on mesenchymal cell differentiation and to determine their effect on bone regeneration.

פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות<em&gt; א coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.