<p class="jove_content"> Este trabalho foi financiado pela Clinical Technologies Proteômica para o cancro da iniciativa, 5U24CA126477-04. </p>

<p class="jove_title"> 1) Prepare colunas lectina-conjugada POROS </p><ol><li> Colocar uma máscara para se proteger contra a inalação de POROS-AL contas durante as etapas de 1,1-1,2. Pesar a quantidade desejada de contas POROS (100 mg mL de volume beads/300 final) e transferir para um tubo eppendorf limpo. </li><li> Lavar contas com adição de 1 mL tampão fosfato (PBS). Contas de pelotas por centrifugação em microcentrífuga a velocidade máxima por 3 minutos. Remover o sobrenadante e repetir a lavagem. </li><li> Pesar a quantidade desejada de lectina não conjugada (1-4 mg / 200 mL contas) e transferir para um tubo eppendorf limpo. Adicionar PBS para formar uma 5-20 mg / mL. Reserve 25 mL desta solução. </li><li> Transferir a solução lectina restantes para as contas POROS. Adicionar cyanoborohydride de sódio a uma concentração final de 50 mM. Colocar o tubo em um rocker e reagir durante a noite a temperatura ambiente. (Nota:. Cyanoborohydride de sódio é tóxico e deve ser tratado em um exaustor resíduos contaminados devem ser eliminados de forma adequada.) </li><li> Pellet as contas POROS como no passo 1.2. Remover o sobrenadante e salvar como a solução de pós-conjugação. </li><li> Lavar contas com um buffer Quenching mL (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Contas da pelota como no passo 1.2 e segurança descartar o sobrenadante. </li><li> Bloquear os sites restantes reativa nas contas POROS com um buffer Quenching mL. Adicionar cyanoborohydride de sódio a uma concentração final de 50 mM. Colocar o tubo em um rocker e incubar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Contas da pelota como no passo 1.2 e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar contas com 1 mL 1 M NaCl. Contas de pelotas e descartar o sobrenadante. Repita quatro vezes para um total de cinco lavagens. As contas estão agora prontos para embalar. </li><li> Para determinar a quantidade de proteína que foi conjugado com as contas POROS, realizar um ensaio de concentração de proteínas nas soluções de pré-lectina conjugada e pós-conjugados. A diferença nas concentrações é a quantidade de proteína que foi conjugado com as contas. A quantidade de proteína conjugada por volume de talão é igual a concentração de lectina nas esferas. Concentrações lectina-alvo são entre 2 -20 mg / mL. </li></ol><p class="jove_title"> 2) as contas de embalagem lectina-conjugada POROS em uma coluna PEEK </p><ol><li> Montar o sistema de embalagem (descrição abaixo) e apoiá-lo em um suporte de anel de metal. O sistema de embalagem consiste em, de baixo para cima, restritor de pressão, coluna final acoplador coluna 1, fritas, (2 x 50 mm), acoplador final coluna 2, conector de coluna, coluna final acoplador 3, coluna (4,5 x 50 mm), final 4 acoplador coluna e montagem final. A coluna superior serve como um reservatório para o material de embalagem. </li><li> Volte a suspender as contas POROS no volume desejado de tampão A. (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio, cloreto de cálcio 10 mM, 10 mM de cloreto de magnésio) Se uma coluna de embalagem (~ 200 mL volume do leito), ressuspender em 400 mL de buffer A. </li><li> Transferência de contas conjugado POROS na coluna superior (reservatório). Adicionar tampão A para o reservatório até que o buffer atinge o topo da coluna. Delicadamente, coloque a montagem final para o topo da coluna, tentando evitar as bolhas de ar na coluna. Ligar a montagem final da coluna superior para o sistema de HPLC. </li><li> Encher a coluna pelo fluxo de buffer A através do sistema. Comece com um fluxo de 0,5 mL / min. Aumentar a vazão de 0,5 mL / min a cada minuto até que 4 mL / min ou a pressão máxima (3000 psi) foi atingido. Continue com o caudal máximo possível até, pelo menos, 35 mL de tampão A passaram pela coluna. </li><li> Desligar as bombas e permitir que a pressão sobre a coluna cair para &lt;20 psi. </li><li> Delicadamente, desmontar o sistema de embalagem, a partir do topo. Quando o fim 2 acoplador coluna é atingido, retire com cuidado. Algum material deve ser embalado de extrusão a partir do topo da coluna. Com uma lâmina de barbear ou borda afiada similar, gentilmente limpe as contas de extrusão, deixando uma superfície das esferas que é mesmo com a parte superior da coluna. Não aplique pressão para as contas ao fazer isto. </li><li> Desengatar a coluna empacotada do suporte do anel. Coloque uma nova fritas em um acoplador novo final e vire a coluna empacotada mais para conectar este com o acoplador fritas / fim na extremidade coluna aberta (antiga topo). </li><li> O título da coluna apropriada. Ele agora está pronto para uso. Quando não em uso, a coluna pode ser armazenada em PBS com azida de sódio 0,02% a 4 ° C por até 6 meses. </li></ol><p class="jove_title"> 3) Programa de método HPLC </p><ol><li> Os detalhes da programação do seu HPLC irá variar de acordo com as especificidades do software do fabricante. Nós usamos um Paradigma Michrom HPLC MG4. Nesta máquina, os métodos são construídas e acesso no âmbito do &quot;Setup&quot; guia na parte superior da tela. Programa o seguinte método: <br /><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Vazão (mL / min) </td><td> % A </td><td> B% </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table><br /> Um buffer: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio, cloreto de cálcio 10 mM, 10 mM de cloreto de magnésio <br /> Tampão B: 0,5 M de ácido acético <br /> O detector de UV deve ser programado para leitura a 280 nm 0:00-19:50. O eixo y deve ser ajustado para detectar baixos níveis de absorção, <em>por exemplo,</em> 0 -. 50 UA. </li><li> Se um amostrador automático é um programa, disponível o seguinte calendário para a coleta de fração. Caso contrário, recolha as frações à mão, como indicado na execução cromatografia. <br /><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Fração </td><td> Atraso à recolha de injeção de amostra </td><td> Duração da coleta (min) </td></tr><tr><td> Fluxo através </td><td> 2,8 </td><td> 4,1 </td></tr><tr><td> Obrigado </td><td> 9 </td><td> 2,6 </td></tr></tbody></table></li></ol><p class="jove_title"> 4) Prepare amostras para HPLC </p><ol><li> Antes de usar neste protocolo, plasma humanos devem ser esgotados os 14 proteínas mais abundantes usando uma coluna MARS (Agilent; Santa Clara, CA). Esgotados plasma humano, lactoferrina e invertase de levedura deve ser individualmente tripsina-digerido e dessalgado conforme descrito anteriormente <sup>1.</sup> </li><li> Para preparar a lectina específica lactoferrina padrão, execute cromatografia em 50 ug de tripsina-digerida lactoferrina mais tanto o AAL ou a coluna SNA usando o método na Parte 3. A fração ligada conterá glicopeptídeos lectina específica lactoferrina. Neutralize as amostras como na parte 4.4, e dessalinizar como na Parte 6. Ressuspender a amostra em 1 mL tampão A. A amostra obtida está pronta para uso. </li><li> Três réplicas experimentais será realizada. Para preparar amostra para três repetições, adicionar 3 pmol de tripsina-digerida invertase e 1 ml de lectina específica lactoferrina (ou AAL-LAC ou SNA-LAC) a 30 mL MARS-empobrecido, tripsina-digerida equivalentes, plasma (PE). A PE é definido como o volume de plasma non-processed/intact/original a partir do qual uma determinada quantidade de processados ​​plasma (MARS-empobrecido e tripsina digerido) foi derivada. Adicionar tampão A para a amostra para chegar a um volume final de 330 mL. </li><li> Adicionar tampão de neutralização (1 M Tris pH 8,0), para os frascos de amostra que irá recolher eluído. O número eo volume de frascos de você trabalhar com dependerá das limitações de seu amostrador automático. Para a Paradigm MG4, um frasco de coleta do fluxo através e dois recolher o eluato. Vai exigir cerca de 1,5 mL tampão Tris para neutralizar 1 mL de eluato. PH neutralizado é alvo 7,0-8,0; pH teste teste final com papel indicador de pH. </li></ol><p class="jove_title"> 5) Realizar cromatografia </p><ol><li> Todas as execuções em branco e da amostra que se seguem vai usar o método descrito na Parte 1. A coluna e os amortecedores estão em temperatura ambiente durante o uso. As colunas são armazenadas a 4 ° C, enquanto que os amortecedores são armazenados em temperatura ambiente. </li><li> Acople a AAL ou a coluna lectina SNA para o sistema de HPLC e executar dois métodos em branco (injeção de tampão de apenas A). Garantir que a coluna lectina corresponde à lactoferrina lectina específica (Parte 2). </li><li> Cromatógrafo a três amostras de plasma, injetando uma em branco entre cada amostra injetado, para um total de 7 é executado HPLC. Frações de corridas em branco não precisam ser recolhidos. </li></ol><p class="jove_title"> 6) dessalinizar coletadas frações </p><p class="jove_content"> Para cada fração de usar um 1 mL Waters Oasis HLB SPE cartucho da seguinte forma: </p><ol><li> Anexar o número de cartuchos necessários para múltiplas vácuo. </li><li> Wet cada cartucho com 1 mL ACN 80% em 1% de ácido fórmico (vacuômetro em múltiplas deve ler 5-20 lnHg). </li><li> Equilibrar cartuchos com 1,5 mL de ácido fórmico 0,1% (vacuômetro em múltiplas deve ler 5-20 lnHg) </li><li> Volume total de carga de uma amostra em um cartucho (Vacuômetro em múltiplas deve ler 2 -. LnHg 2,5, ea taxa de fluxo não deve exceder 1 mL / min) </li><li> Lavar com 3 cartuchos de 1 mL x ácido fórmico 0,1% (Vacuômetro em múltiplas deve ler 5-20 lnHg) </li><li> Peptídeos eluir / glicopeptídeos em tubos eppendorf rotulados com 1 x 1 mL de acetonitrila 80% em 0,1% de ácido fórmico. (Vacuômetro em múltiplas deve ler 2-2,5 lnHg, ea taxa de fluxo não deve exceder 1 mL / min.) Um tubo de coleta única deve ser usado para cada cartucho. </li><li> Neutralize eluído pela adição de 60 mL 0,5 M de bicarbonato de amónio para cada tubo de coleta. Alvo neutrpH é desmineralizada é 7,0-8,0; pH teste final com papel indicador de pH. </li><li> Concentre-se peptídeos eluídos / glicopeptídeos para ~ 50 mL por executá-los em uma centrífuga a vácuo (por <em>exemplo,</em> a Thermo Savant SpeedVac) por aproximadamente 2 horas @ 35 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> 7) PNGase F-digestão </p><ol><li> PH da amostra de teste para garantir que ele está entre 7,0-8,0. Se necessário, adicione bicarbonato de amônio 50 mM para aumentar o pH. Se o volume da amostra final é&gt; 100 da amostra, mL speedvac até que esteja entre 50-100 mL. </li><li> Adicionar 0,5 mL (250 U) de glicerol livre F PNGase a cada tubo de amostra e incubar a 37 ° C durante a noite. </li></ol><p class="jove_title"> 8) amostras Dica Zip </p><ol><li> Começando com PNGase F-digerida amostras, ziptip cada um como se segue. </li><li> Ziptip molhado com 10 mL de acetonitrila 100%, seguido por 10 mL de acetonitrila 80%, 0,1% de ácido fórmico. </li><li> Equilibrar ziptip com 20 mL de ácido fórmico 0,1%. </li><li> Carga da amostra para a ziptip pipetando cima e para baixo através da matriz ziptip 10 vezes. </li><li> Lave o ziptip pipetando 10 mL de ácido fórmico 0,1%, 5 vezes. </li><li> Eluir a amostra em um tubo eppendorf limpo com 10 mL de acetonitrila 80%, 0,1% de ácido fórmico. </li><li> Repita a eluição e adicione o mL 10 segundo para o mesmo tubo. </li><li> Speedvac as amostras a um volume de &lt;mL 2. </li><li> Amostras ressuspender em 20 mL de ácido fórmico 0,1%. As amostras estão prontas para análise por LC-MS/MS. </li></ol><p class="jove_title"> 9) Resultados Representante: </p><p class="jove_content"> A conjugação POROS tipicamente rendimentos on-bead lectina concentrações na faixa de 2-20 mg / mL. Isso é ótimo para cromatografia de afinidade. </p><p class="jove_content"> Cromatografia lectina de tripsina-digerida MARS com depleção de plasma humano normalmente enriquece glicopeptídeos na fração ligada. Como a glicopeptídeos são PNGase F-tratados antes de LC-MS/MS, elas são identificadas como peptídeos com a seqüência consenso N-ligados, NXS / T (onde X é qualquer resíduo, mas prolina), em que a asparagina foi convertido para um ácido aspártico através da ação de Peptídeos PNGase F. com essas características são consideradas como peptídeos deglycosylated (ou &quot;deglycopeptides&quot;). Em média o fluxo-through (FT), fração de AAL ou cromatografia SNA contém deglycopeptides 2-4%, enquanto que 30-50% dos peptídeos recuperada na fração ligada são deglycopeptides. Normalmente, usando uma Elite QStar, 1000-1300 peptídeos serão identificados na fração FT, e 200-400 peptídeos serão identificados na fração ligada. Dois ou mais deglycopeptides invertase distintas devem ser observados na fração de FT e dois ou mais deglycopeptides distintas lactoferrina na fração ligada (Tabela 1). </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabela 1" /><br /> <strong>Tabela 1.</strong> </p>

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> <em style='font-style: italic'>Mol Cell Proteomics</em>. <b>6</b>, 2212-2229 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content"> Este protocolo fornece um método rápido para isolar e identificar glicopeptídeos de forma glicano específico. Como glicosilação varia amplamente dentro de um organismo, particularmente durante o desenvolvimento e patogênese, esta técnica pode ser aplicável para tratar uma grande variedade de perguntas. Em particular, estamos usando o método para seletivamente enriquecer glicopeptídeos que foram modificados com câncer associado epítopos como um primeiro passo para a descoberta de biomarcadores. </p>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Aleuria aurantia</em> lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Sambucus nigra</em> agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

<p class="jove_content">Glicanos são uma classe importante de modificações pós-translacionais. Tipicamente encontradas em moléculas secretadas e extracelular, as estruturas glicano sinal de estatuto interno da célula. Glicanos em células tumorais tendem a ter ácido siálico abundante e metades fucose. Propomos que essas variantes associadas ao câncer glicano ser explorada para o desenvolvimento de biomarcadores visa diagnosticar doença em estágio inicial. Assim, desenvolvemos uma espectrometria de massa com base em fluxo de trabalho que incorpora cromatografia de afinidade em matrizes formadas a partir de lectinas, proteínas que se ligam glicano estruturas específicas. As lectinas Sambucus nigra (SNA) e Aleuria aurantia (AAL), que se ligam ácido siálico e fucose, respectivamente, foram covalentemente acoplado a contas POROS (Applied Biosystems) e embalados em colunas PEEK para cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Resumidamente, o plasma foi esgotada dos quatorze proteínas mais abundantes usando um sistema de remoção de múltiplos afinidade (MARS-14; Agilent). Esgotados plasma foi tripsina-digerida e separados em flow-through e frações vinculado por SNA ou HPLC AAL. As frações foram tratados com PNGaseF para remover N-glicanos ligados, e analisados ​​por LC-MS/MS em um Elite QStar. Os dados foram analisados ​​usando o software da mascote. O delineamento experimental incluídos controles positivos e-fucosylated sialylated glicopeptídeos e lactoferrina humana negativa controles de alta manose glicopeptídeos de Saccharomyces cerevisiae, que foram utilizados para monitorar a especificidade da captura de lectina. As principais características deste fluxo de trabalho incluem a reprodutibilidade derivado do formato de HPLC, a identificação positiva dos glicopeptídeos capturados e tratados com PNGaseF de seus motivos Asn-Xxx-Ser/Thr desamidados, e avaliação da qualidade usando padrões glicoproteína. Protocolo de otimização também incluiu determinação da relação adequada de matéria-prima para a capacidade da coluna, identificando a captura mais eficiente e buffers de eluição, e monitorar a PNGaseF tratamento para garantir deglycosylation completo. Direções futuras incluem o uso deste fluxo de trabalho para realizar experimentos de espectrometria de massa baseada na descoberta de plasma de pacientes com câncer de mama e indivíduos controle.</p>

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A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

<p class="jove_content">Contas lectina-conjugada POROS foram empregadas para HPLC. Padrões glicopeptídeo serviram como controle positivo e negativo. MARS-14 empobrecido, tripsina-digerida plasma humano foi cromatografada e flow-through (FT) e frações ligado coletadas para análises ESI-LC-MS/MS. Glicopeptídeos foram enriquecidos na fração ligada quando comparado com FT.</p>

Um método HPLC Lectin enriquecer Peptídeos seletivamente glicosilada de Complexo Amostras Biológicas

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K visualizações.  University of California, San Francisco - UCSF. Contas lectina-conjugada POROS foram empregadas para HPLC. Padrões glicopeptídeo serviram como controle positivo e negativo. MARS-14 empobrecido, tripsina-digerida plasma humano foi cromatografada e flow-through (FT) e frações ligado coletadas para análises ESI-LC-MS/MS. Glicopeptídeos foram enriquecidos na fração ligada quando comparado com FT.