אנו מודים לד&quot;ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג&#39;לים. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו - SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.

חלק 1: דו מימדי (2-D) ג&#39;ל אלקטרופורזה באמצעות כוס העמסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IPG-רצועת התייבשות ומיקוד isoelectric (IEF) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם ג&#39;לים Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 ס&quot;מ) בתמיסה 125 התייבשות μl [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 4%, 50 hydroxyethyldisulfide מ&quot;מ 2% IPG pH הצפת 6-11] באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling עבור לפחות 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים מדגם חלבון זירז במאגר מדגם IEF [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 2%, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide מ&quot;מ 2% IPG pH הצפת 6-11] המקביל לחלבון 60-100 מיקרוגרם לכל 100 μl . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר solubilization (לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר), להחיל מדגם חלבון באמצעות anodic כוס טעינה באמצעות כוסות המדגם. נפח כוס הוא 100 μl (כוסות סעפת לאפשר עד μl 150). הערה: אתה יכול לטעון כמויות מדגם גדול יותר אם תוסיף צעד מתח נמוך בתחילת פרוטוקול התמקדות ולמלא את הכוסות כל עוד יש סרט הנוזל בכוס! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע isoelectric התמקדות עבור קו&quot;ה 11.1 במצב שיפוע ביחידה אלקטרופורזה Multiphor השנייה. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון ו SDS-PAGE <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר IEF, רצועות IPG ​​היו נתונים הפחתת אלקילציה, בכל פעם 15 דקות על שייקר, באמצעות dithiothreitol 1% ו 2.5% בהתאמה iodoacetamide בפתרון איזון [50 מ&quot;מ Tris-HCl/pH 8.8, 6 M אוריאה, גליצרול 30% ו -2% SDS]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את רצועות equilibrated עם H 2 O ו - כתם אותם על גבי נייר whatman להסיר חיץ איזון עודף. לאחר מכן טובלים את רצועות חיץ SDS ריצה (1X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממד השני מבוצע על ידי SDS-PAGE על מערכות אלקטרופורזה אנכי עם ריכוז acrylamide סך של 12%. רצועות IPG ​​equilibrated הונחו על החלק העליון של ג&#39;לים להפריד קבוע עם פתרון agarose חם [agarose 0.5% בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלבונים הופרדו עבור 2.5 שעות, החל מהשעה V 80 ל -15 דקות ואחריו V 120 עד הכניסה לצבוע מגיע התחתון של הקלטת ג&#39;ל. </li></ul></li></ol> חלק 2: Colloidal מכתים Coomassie עם CBB G-250 1. מכתים פתרונות הערה: להכנת הפתרונות מכתים, להשתמש בחומרים כימיים עם איכות גבוהה כגון כיתה אנליטית (רש&quot;פ) ומים של טוהר גבוה ככל שאתה מקבל Millipore מערכות (מילי-Q מים). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie פתרון: </td><td> מודעה 2000 מ&quot;ל H 2 O </td></tr><tr><td> 0.02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 גרם </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> אלומיניום סולפט (14-18), מימה </td><td> 100 גרם </td></tr><tr><td> 10% (V / V) </td><td> אתנול (96%) </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2% (V / V) </td><td> orthophosphoric חומצה (85%) </td><td> 47 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הערה: להכנת הפתרון מכתים, הוספת רציפים המרכיבים לפי הסדר הבא חייב להישמר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> first לפזר סולפט אלומיניום במים מילי-Q </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להוסיף אתנול, homogenize, ומערבבים CBB G-250 לפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי לאחרונה כמו הפתרון הוא נמס לגמרי, מוסיפים חומצה זרחתית (שילוב של חומצה לתקשורת אלכוהוליים מאפשר מולקולות Coomassie המצרפי למצב colloidal שלהם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוף סוף להתמלא מים מילי-Q </li></ol> הערה: הפתרון הסופי מכתים יש מראה כהה ירוק כחלחל מלא חלקיקים שחייה סביב: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנין פתרון זה! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שינית את סדר ההכנה, היית מקבל פתרון יותר סגול כחלחל כי הוא רגיש פחות. </li></ul><table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Destaining פתרון: </td><td> מודעה 2000 מ&quot;ל H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (V / V) </td><td> אתנול (96%) </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2% (V / V) </td><td> orthophosphoric חומצה (85%) </td><td> 47 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> 2. מכתים נוהל <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההפרדה המימד השני, בזהירות להסיר את הג&#39;לים של לוחות זכוכית ולהעביר אותם לתוך צלחת מכתים מלא מים מילי-Q. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;לים שלוש פעמים במים מילי-Q במשך 10 דקות על שייקר האופקי (שטיפה לא מספקת גורמת רגישות העניים כי SDS הנותרים על הג&#39;לים מפריעה התוחמת של הצבע לחלבון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake הפתרון Coomassie לפני השימוש כדי לפזר את חלקיקי colloidal שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;לים מכוסה היטב על ידי תסיסה על שייקר עם פתרון Coomassie במשך 2-12 שעות. מכתים זה יוצר רקע שולית, כך שתוכל לבחון את התקדמות מכתים שביניהם. הערה: לאחר 10 דקות ניתן לראות כתמי חלבון הראשון המופיע בתוך 2 שעות הדגירה כ 80% מכתים את זהרמה מקסימלית של הושלמה. עבור מכתים כמעט 100%, הדגירה לילה מומלץ. במקרים מסוימים, כאשר כמות החלבון להיות מוכתם הוא עצום פתרון הופך כחול בהיר, רענון של הפתרון מכתים הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך מכתים להסיר את הפתרון Coomassie ולשטוף את הג&#39;לים פעמיים עם מים מילי-Q. הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר פתרון מכתים עוד חלקיקים עדיין הנותרים, אחרת לבטל את זה (יש לזכור כי במעבדה שלך יכול להיות תקנות מיוחדות עבור סילוק פסולת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת דבק חלקיקי צבע מצלחת מכתים במגבת-מוך חופשי נייר destain עבור 10 - 60 דקות. הערה: ניתן גם לשטוף את הג&#39;לים רק עם מים מילי-Q אבל זה מומלץ רק עבור preparative ג&#39;לים כי תימשך לא סדיר, חלש הסרט Coomassie על ג&#39;לים שתקום במהלך הליך הסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לשטוף את הג&#39;לים פעמיים עם מים מילי-Q: ג&#39;לים יגיע עובי המקורי שלהם (את האלכוהול חומצה התקשורת עושה את התכווצות ג&#39;לים) ו נטרול במים בנוסף משפר את עוצמת הצבע של Coomassie. </li></ul> חלק 3: תוצאות נציג אם אתה מבין את הפרוטוקול המתואר לעיל תקבל על 2-D שלך הייחודי ג&#39;ל נקודות נפתרה גם מוכתם כחול כהה חלבון. אפילו בהשוואה ג&#39;ל 2-D מוכתם כסף לפי שבצ&#39;נקו et al. 5, פרוטוקול בטענה רגישות תאימות טובה עם ספקטרומטריית מסה, אנחנו משיגים תוצאות מכתים שווים. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: התוצאה הסופית של הניסויים שתוארו לעיל. Coomassie קאנג של פרוטוקול (א) מבצע חזק כמו מכתים את הכסף על פי שבצ&#39;נקו et al. (ב) באיתור חלבונים לאחר אלקטרופורזה 2 D-ג&#39;ל. חלק 4: טיפים וטריקים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו כמה stainings בדיקה לפני עיבוד דגימות משלך. מסיבות בלתי מוסברים דיווחנו כי לפעמים חלבון של עניין לא ניתן היה לזהות בהצלחה גם כאשר מיליגרם יושמו. במקרה זה אנו ממליצים להכין כמה סדרות דילול כדי לבדוק רגישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך נמוך ג&#39;ל זיהוי של חלבון (ים) העברה, בכלל לא מוצלח מן הערמה על ג&#39;ל המפריד במהלך SDS-PAGE יהיה להיות הסיבה. אתה יכול לבדוק חלבונים דביק כזה על ידי מכתים את הג&#39;ל מלא כולל באזור הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אימות מהיר של תוצאות isoelectric שלך התמקדות, אתה יכול ישירות הכתם IPG, רצועות ללא הפרדה ממד נוסף בכל שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם להפוך את ג&#39;לים במהלך ההליך מכתים ולכן הם מוכתמים באופן שווה משני הצדדים (אם אתה שומר הג&#39;לים מתרגשים, לצבוע רק נקשר בצד אחד של הג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חווינו את זה אחסון של הפתרון מכתים בבקבוק כהה מגביר את חייה (בבקבוקים שקופים עד חודש 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכתים ותיעוד אתה יכול לשמור את ג&#39;ל במקרר במשך כמה שנים (אם תוסיף פתרון חומצי לך למנוע זיהומים על ידי פטריות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destaining של אטמי ג&#39;ל למשך לעכל tryptic יכול להיות מואץ על ידי חימום בתנור אבן. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie? כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> עבור IEF ו SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip ג&#39;לים </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> יכול גם לשמש 2 שנים לאחר פקיעת תאריך. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip מגש Reswelling </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> אין לנקות עם ממסים אורגניים. עוצב עבור 7-18 ס&quot;מ IPG, רצועות. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> כולל מגש, מחזיק אלקטרודות, אנודה קתודה אלקטרודות, aligner וכוס בר מדגם כוסות המדגם. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL ספק כוח </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> ספקי מתח עד 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II יחידת אלקטרופורזה </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> אלקטרודות Movable לאפשר IEF ברצועות IPG ​​אורך הכול (7-24 ס&quot;מ IPG רצועות) </td></tr><tr><td> PerfectBlue ג&#39;ל מערכת Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE בפורמט 10x10 ס&quot;מ מיני ג&#39;ל. ג&#39;ל קאמרית כולל מערכת קירור. </td></tr><tr><td> עבור colloidal מכתים Coomassie G-250: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מכתים מנות עם מכסים </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> מתאים עבור מיני ג&#39;לים. Stackable על שייקר. </td></tr><tr><td> אלומיניום סולפט-18-מימה </td><td> מרק </td><td> 1.01102.5000 </td><td> עשינו את החוויה הטובה ביותר עם מרק. זמין רק בחבילה 5 ק&quot;ג. </td></tr><tr><td> orthophosphoric חומצה </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> נמכר בתוך בקבוקי זכוכית. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג&#39;ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic. שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים. הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג&#39;לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג<em&gt; Et al.</em&gt; לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג&#39;לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג&#39;ל מבוסס proteomics.

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

40.3K Views.  University Duesseldorf. וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג Et al. לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג'לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג'ל מבוסס proteomics.

Video: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may be classified as either clinically functional or nonfunctional PA (FPA and NFPA). NFPA is difficult for early stage diagnosis and therapy due to barely elevating hormones in the blood compared to FPA. Our long-term goal is to use proteomics methods to discover reliable biomarkers for clarification of PA molecular mechanisms and recognition of effective diagnostic, prognostic markers and therapeutic targets. Effective two-dimensional gel electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry (MS) methods were presented here to analyze human PA proteomes, including preparation of samples, 2D gel electrophoresis, protein visualization, image analysis, in-gel trypsin digestion, peptide mass fingerprint (PMF), and tandem mass spectrometry (MS/MS). 2-Dimensional gel electrophoresis matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS, and 2DE-liquid chromatography (LC) MS/MS procedures have been successfully applied in an analysis of NFPA proteome. With the use of a high-sensitivity mass spectrometer, many proteins were identified with the 2DE-LC-MS/MS method in each 2D gel spot in an analysis of complex PA tissue to maximize the coverage of human PA proteome.

Here, we present a two-dimensional gel electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry (MS) to separate and identify human pituitary adenoma tissue proteome, which presents a good and reproducible 2DE pattern. Many proteins are observed in each 2DE spot when analyzing complex cancer proteome with the use of high-sensitivity MS.

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Cancer Research

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver staining is a widely used method for the detection of SSR markers in a polyacrylamide gel. However, conventional protocols for silver staining are technically demanding and time-consuming. Like many other biological laboratory techniques, silver staining protocols have been steadily optimized to improve detection efficiency. Here, we report a simplified silver staining method that significantly reduces reagent costs and enhances the detection resolution and picture clarity. The new method requires two major steps (impregnation and development) and three reagents (silver nitrate, sodium hydroxide, and formaldehyde), and only 7 min of processing for a non-denaturing polyacrylamide gel. Compared to previously reported protocols, this new method is easier, quicker and uses fewer chemical reagents for SSR detection. Therefore, this simple, low-cost, and effective silver staining protocol will benefit genetic mapping and marker-assisted breeding by a quick generation of SSR marker data.

Here, we report a simple and low-cost silver staining protocol which requires only three reagents and 7 min of processing, and is suitable for fast generation of high-quality SSR data in the genetic analysis.

מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Genetics

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Biochemistry

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Determining Total Protein and Bioactive Protein Concentrations in Bovine Colostrum

Colostrum is a complex biological fluid produced by mammals immediately after parturition. It meets all the nutritional requirements for neonates as a good source of macro- and micronutrients, bioactive peptides, and growth factors. Bovine colostrum is also a potential source of nutrition and bioactive because of its rich protein content that includes immunoglobulin G (IgG) and lactoferrin. However, the level of lactoferrin and IgG in bovine colostrum changes markedly during the lactation period. Therefore, monitoring the concentration of IgG and lactoferrin for the use of bovine colostrum as a protein source is an important question to study. Methods in this article describe how to determine protein content, as well as specific concentrations of lactoferrin and IgG. These methods include the following steps: Isolation of bovine colostrum proteins, Determination of protein concentration via Bicinchoninic acid assay (BCA), Visualization of proteins via SDS-PAGE, Determination of lactoferrin, and IgG concentration using an ELISA Assay.

Bovine colostrum is both a primary source of nutrients and immunological support for the newborn calf. The understanding of the level of therapeutic proteins (lactoferrin and IgG) is important for the bovine colostrum dosing and standardization for human consumption.

Colostrum is a complex biological fluid produced by mammals immediately after parturition. It meets all the nutritional requirements for neonates as a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

שבירה מיטוכונדריאלית בדגימות רקמה קטנות לאנליזה סופר-מורכבת

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

מחבר זרקור: חשיפת דינמיקה של מערכת זרחן חמצוני ותפקידים מיטוכונדריאליים בבריאות ובמחלות

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג'ל polyacrylamide

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing

מכתים חלבונים ג'ל

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

הכתמה של חלבונים עם ג'ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

Determining Total Protein and Bioactive Protein Concentrations in Bovine Colostrum

ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים