אנו מודים לד&quot;ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג&#39;לים. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו - SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.

חלק 1: דו מימדי (2-D) ג&#39;ל אלקטרופורזה באמצעות כוס העמסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IPG-רצועת התייבשות ומיקוד isoelectric (IEF) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם ג&#39;לים Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 ס&quot;מ) בתמיסה 125 התייבשות μl [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 4%, 50 hydroxyethyldisulfide מ&quot;מ 2% IPG pH הצפת 6-11] באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling עבור לפחות 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים מדגם חלבון זירז במאגר מדגם IEF [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 2%, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide מ&quot;מ 2% IPG pH הצפת 6-11] המקביל לחלבון 60-100 מיקרוגרם לכל 100 μl . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר solubilization (לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר), להחיל מדגם חלבון באמצעות anodic כוס טעינה באמצעות כוסות המדגם. נפח כוס הוא 100 μl (כוסות סעפת לאפשר עד μl 150). הערה: אתה יכול לטעון כמויות מדגם גדול יותר אם תוסיף צעד מתח נמוך בתחילת פרוטוקול התמקדות ולמלא את הכוסות כל עוד יש סרט הנוזל בכוס! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע isoelectric התמקדות עבור קו&quot;ה 11.1 במצב שיפוע ביחידה אלקטרופורזה Multiphor השנייה. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון ו SDS-PAGE <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר IEF, רצועות IPG ​​היו נתונים הפחתת אלקילציה, בכל פעם 15 דקות על שייקר, באמצעות dithiothreitol 1% ו 2.5% בהתאמה iodoacetamide בפתרון איזון [50 מ&quot;מ Tris-HCl/pH 8.8, 6 M אוריאה, גליצרול 30% ו -2% SDS]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את רצועות equilibrated עם H 2 O ו - כתם אותם על גבי נייר whatman להסיר חיץ איזון עודף. לאחר מכן טובלים את רצועות חיץ SDS ריצה (1X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממד השני מבוצע על ידי SDS-PAGE על מערכות אלקטרופורזה אנכי עם ריכוז acrylamide סך של 12%. רצועות IPG ​​equilibrated הונחו על החלק העליון של ג&#39;לים להפריד קבוע עם פתרון agarose חם [agarose 0.5% בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלבונים הופרדו עבור 2.5 שעות, החל מהשעה V 80 ל -15 דקות ואחריו V 120 עד הכניסה לצבוע מגיע התחתון של הקלטת ג&#39;ל. </li></ul></li></ol> חלק 2: Colloidal מכתים Coomassie עם CBB G-250 1. מכתים פתרונות הערה: להכנת הפתרונות מכתים, להשתמש בחומרים כימיים עם איכות גבוהה כגון כיתה אנליטית (רש&quot;פ) ומים של טוהר גבוה ככל שאתה מקבל Millipore מערכות (מילי-Q מים). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie פתרון: </td><td> מודעה 2000 מ&quot;ל H 2 O </td></tr><tr><td> 0.02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 גרם </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> אלומיניום סולפט (14-18), מימה </td><td> 100 גרם </td></tr><tr><td> 10% (V / V) </td><td> אתנול (96%) </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2% (V / V) </td><td> orthophosphoric חומצה (85%) </td><td> 47 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הערה: להכנת הפתרון מכתים, הוספת רציפים המרכיבים לפי הסדר הבא חייב להישמר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> first לפזר סולפט אלומיניום במים מילי-Q </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להוסיף אתנול, homogenize, ומערבבים CBB G-250 לפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי לאחרונה כמו הפתרון הוא נמס לגמרי, מוסיפים חומצה זרחתית (שילוב של חומצה לתקשורת אלכוהוליים מאפשר מולקולות Coomassie המצרפי למצב colloidal שלהם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוף סוף להתמלא מים מילי-Q </li></ol> הערה: הפתרון הסופי מכתים יש מראה כהה ירוק כחלחל מלא חלקיקים שחייה סביב: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנין פתרון זה! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שינית את סדר ההכנה, היית מקבל פתרון יותר סגול כחלחל כי הוא רגיש פחות. </li></ul><table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Destaining פתרון: </td><td> מודעה 2000 מ&quot;ל H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (V / V) </td><td> אתנול (96%) </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2% (V / V) </td><td> orthophosphoric חומצה (85%) </td><td> 47 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> 2. מכתים נוהל <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההפרדה המימד השני, בזהירות להסיר את הג&#39;לים של לוחות זכוכית ולהעביר אותם לתוך צלחת מכתים מלא מים מילי-Q. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;לים שלוש פעמים במים מילי-Q במשך 10 דקות על שייקר האופקי (שטיפה לא מספקת גורמת רגישות העניים כי SDS הנותרים על הג&#39;לים מפריעה התוחמת של הצבע לחלבון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake הפתרון Coomassie לפני השימוש כדי לפזר את חלקיקי colloidal שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;לים מכוסה היטב על ידי תסיסה על שייקר עם פתרון Coomassie במשך 2-12 שעות. מכתים זה יוצר רקע שולית, כך שתוכל לבחון את התקדמות מכתים שביניהם. הערה: לאחר 10 דקות ניתן לראות כתמי חלבון הראשון המופיע בתוך 2 שעות הדגירה כ 80% מכתים את זהרמה מקסימלית של הושלמה. עבור מכתים כמעט 100%, הדגירה לילה מומלץ. במקרים מסוימים, כאשר כמות החלבון להיות מוכתם הוא עצום פתרון הופך כחול בהיר, רענון של הפתרון מכתים הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך מכתים להסיר את הפתרון Coomassie ולשטוף את הג&#39;לים פעמיים עם מים מילי-Q. הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר פתרון מכתים עוד חלקיקים עדיין הנותרים, אחרת לבטל את זה (יש לזכור כי במעבדה שלך יכול להיות תקנות מיוחדות עבור סילוק פסולת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת דבק חלקיקי צבע מצלחת מכתים במגבת-מוך חופשי נייר destain עבור 10 - 60 דקות. הערה: ניתן גם לשטוף את הג&#39;לים רק עם מים מילי-Q אבל זה מומלץ רק עבור preparative ג&#39;לים כי תימשך לא סדיר, חלש הסרט Coomassie על ג&#39;לים שתקום במהלך הליך הסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לשטוף את הג&#39;לים פעמיים עם מים מילי-Q: ג&#39;לים יגיע עובי המקורי שלהם (את האלכוהול חומצה התקשורת עושה את התכווצות ג&#39;לים) ו נטרול במים בנוסף משפר את עוצמת הצבע של Coomassie. </li></ul> חלק 3: תוצאות נציג אם אתה מבין את הפרוטוקול המתואר לעיל תקבל על 2-D שלך הייחודי ג&#39;ל נקודות נפתרה גם מוכתם כחול כהה חלבון. אפילו בהשוואה ג&#39;ל 2-D מוכתם כסף לפי שבצ&#39;נקו et al. 5, פרוטוקול בטענה רגישות תאימות טובה עם ספקטרומטריית מסה, אנחנו משיגים תוצאות מכתים שווים. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: התוצאה הסופית של הניסויים שתוארו לעיל. Coomassie קאנג של פרוטוקול (א) מבצע חזק כמו מכתים את הכסף על פי שבצ&#39;נקו et al. (ב) באיתור חלבונים לאחר אלקטרופורזה 2 D-ג&#39;ל. חלק 4: טיפים וטריקים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו כמה stainings בדיקה לפני עיבוד דגימות משלך. מסיבות בלתי מוסברים דיווחנו כי לפעמים חלבון של עניין לא ניתן היה לזהות בהצלחה גם כאשר מיליגרם יושמו. במקרה זה אנו ממליצים להכין כמה סדרות דילול כדי לבדוק רגישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך נמוך ג&#39;ל זיהוי של חלבון (ים) העברה, בכלל לא מוצלח מן הערמה על ג&#39;ל המפריד במהלך SDS-PAGE יהיה להיות הסיבה. אתה יכול לבדוק חלבונים דביק כזה על ידי מכתים את הג&#39;ל מלא כולל באזור הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אימות מהיר של תוצאות isoelectric שלך התמקדות, אתה יכול ישירות הכתם IPG, רצועות ללא הפרדה ממד נוסף בכל שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם להפוך את ג&#39;לים במהלך ההליך מכתים ולכן הם מוכתמים באופן שווה משני הצדדים (אם אתה שומר הג&#39;לים מתרגשים, לצבוע רק נקשר בצד אחד של הג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חווינו את זה אחסון של הפתרון מכתים בבקבוק כהה מגביר את חייה (בבקבוקים שקופים עד חודש 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכתים ותיעוד אתה יכול לשמור את ג&#39;ל במקרר במשך כמה שנים (אם תוסיף פתרון חומצי לך למנוע זיהומים על ידי פטריות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destaining של אטמי ג&#39;ל למשך לעכל tryptic יכול להיות מואץ על ידי חימום בתנור אבן. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie? כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> עבור IEF ו SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip ג&#39;לים </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> יכול גם לשמש 2 שנים לאחר פקיעת תאריך. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip מגש Reswelling </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> אין לנקות עם ממסים אורגניים. עוצב עבור 7-18 ס&quot;מ IPG, רצועות. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> כולל מגש, מחזיק אלקטרודות, אנודה קתודה אלקטרודות, aligner וכוס בר מדגם כוסות המדגם. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL ספק כוח </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> ספקי מתח עד 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II יחידת אלקטרופורזה </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> אלקטרודות Movable לאפשר IEF ברצועות IPG ​​אורך הכול (7-24 ס&quot;מ IPG רצועות) </td></tr><tr><td> PerfectBlue ג&#39;ל מערכת Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE בפורמט 10x10 ס&quot;מ מיני ג&#39;ל. ג&#39;ל קאמרית כולל מערכת קירור. </td></tr><tr><td> עבור colloidal מכתים Coomassie G-250: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מכתים מנות עם מכסים </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> מתאים עבור מיני ג&#39;לים. Stackable על שייקר. </td></tr><tr><td> אלומיניום סולפט-18-מימה </td><td> מרק </td><td> 1.01102.5000 </td><td> עשינו את החוויה הטובה ביותר עם מרק. זמין רק בחבילה 5 ק&quot;ג. </td></tr><tr><td> orthophosphoric חומצה </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> נמכר בתוך בקבוקי זכוכית. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג&#39;ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic. שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים. הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג&#39;לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג<em&gt; Et al.</em&gt; לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג&#39;לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג&#39;ל מבוסס proteomics.

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

40.0K Views.  University Duesseldorf. וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג Et al. לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג'לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג'ל מבוסס proteomics.

Video: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...