Nous remercions le Dr Nicola Wiethölter de la préparation et la coloration de 1 D-gels. Ce travail a été financé par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 à ND et SM) et soutenu par une bourse de recherche de l&#39;Manchot Jürgen Stiftung à ND.

Partie 1: l&#39;électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-D) à l&#39;aide de la Coupe de chargement <ol><li> IPG-bande de la réhydratation et la focalisation isoélectrique (IEF) <ul><li> Réhydrater les gels DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) dans 125 ul solution de réhydratation [7 M urée, 2 M thiourée, CHAPS 4%, 50 mM hydroxyethyldisulfide et 2% IPG 6-11 pH Tampon] à partir du bac DryStrip Immobiline Reswelling pour au moins 10 heures. </li><li> Dissoudre l&#39;échantillon de protéines précipités dans le tampon d&#39;échantillon IEF [7 M urée, 2 M thiourée, CHAPS 2%, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide et 2% IPG 6-11 pH Tampon] correspondant à 60-100 pg de protéine par 100 ul . </li><li> Après solubilisation (au moins 30 minutes à température ambiante), appliquer échantillon de protéine par l&#39;intermédiaire anodique tasse de chargement en utilisant des tasses échantillon. Le volume de la coupe est de 100 ul (tasses collecteur permettre jusqu&#39;à 150 pl.) Remarque: vous pouvez charger des quantités plus grandes de l&#39;échantillon si vous insérez une étape à basse tension au début du protocole de concentrer et de remplir les tasses pendant qu&#39;il est encore un film de liquide dans la tasse! </li><li> Effectuer isoélectrofocalisation pour 11,1 KVH en mode dégradé dans l&#39;unité d&#39;électrophorèse Multiphor II. </li></ul></li><li> Equilibration et SDS-PAGE <ul><li> Après l&#39;IEF, les bandes IPG ont été soumis à une réduction et d&#39;alkylation, à chaque fois 15 minutes sur un agitateur, en utilisant le dithiothréitol 1% et 2,5% respectivement iodoacétamide dans une solution d&#39;équilibration [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M d&#39;urée, glycérol 30% et 2% de SDS]. </li><li> Rincez les bandes équilibrée avec H 2 O et les effacera sur papier Whatman pour enlever l&#39;excès de tampon d&#39;équilibration. Ensuite tremper les bandes en SDS-Tampon (1X). </li><li> La seconde dimension est réalisée par SDS-PAGE sur un système d&#39;électrophorèse verticale avec une concentration d&#39;acrylamide total de 12%. Les bandes IPG équilibrée ont été placés sur le haut de la séparation et des gels d&#39;agarose fixe avec solution chaude [agarose à 0,5% dans la gestion de tampon contenant bleu de bromophénol]. </li><li> Les protéines ont été séparées pendant 2,5 h, à partir de 80 V pendant 15 minutes suivie par 120 V jusqu&#39;à ce que le front atteint le fond de la cassette de gel. </li></ul></li></ol> Partie 2: coloration de Coomassie colloïdal avec CBB G-250 1. Solutions de coloration Remarque: pour la préparation des solutions de coloration, utiliser des produits chimiques de haute qualité tels que la qualité analytique (PA) et d&#39;eau de grande pureté que vous obtenez à partir de systèmes Millipore (eau Milli-Q). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Solution de Coomassie: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (p / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (p / v) </td><td> sulfate d&#39;aluminium (14-18)-hydrate </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> l&#39;éthanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> l&#39;acide orthophosphorique (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Remarque: pour la préparation de la solution de coloration, l&#39;addition séquentielle des composants dans l&#39;ordre suivant doit être maintenu: <ol><li> première dissolution du sulfate d&#39;aluminium en eau Milli-Q </li><li> puis ajouter de l&#39;éthanol, homogénéiser et mélanger CBB G-250 à la solution </li><li> aussi récemment que la solution soit complètement dissoute, ajouter de l&#39;acide phosphorique (l&#39;incorporation de l&#39;acide pour les médias alcoolisées permet de molécules Coomassie globale dans leur état colloïdal) </li><li> Enfin remplir avec eau Milli-Q </li></ol> Remarque: la solution de coloration finale a une couleur vert foncé-bleu apparence et est plein de particules nageant autour: <ul><li> Ne pas filtrat cette solution! </li><li> Si vous avez modifié l&#39;ordre de préparation, vous obtiendrez une solution plus violet bleuté qui est moins sensible. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Décoloration solution: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> l&#39;éthanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> l&#39;acide orthophosphorique (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Procédure de coloration <ul><li> Après la séparation deuxième dimension, retirez soigneusement les gels des plaques de verre et de les transférer dans un plat rempli de taches eau Milli-Q. </li><li> Lavez les gels à trois reprises avec eau Milli-Q pendant 10 minutes sur un agitateur horizontal (lavage insuffisant entraîne une mauvaise sensibilité parce que le reste sur les gels SDS perturbe la délimitation de la teinture à la protéine). </li><li> Agiter la solution avant de l&#39;utiliser de Coomassie pour disperser les particules colloïdales uniformément. </li><li> Incuber les gels bien couvert avec la solution de Coomassie par l&#39;agitation sur un agitateur pour 2-12 heures. Cette coloration de fond génère marginale sorte que vous pouvez observer la progression coloration entre les deux. Remarque: après 10 minutes, vous pouvez voir des taches de protéines première apparition, dans les 2 heures d&#39;incubation d&#39;environ 80% de coloration pour elleniveau maximum s est terminée. Depuis près de 100% coloration, une nuit d&#39;incubation est recommandée. Dans certains cas, lorsque la quantité de protéines à teindre est énorme et la solution se transforme en un bleu vif, un rafraîchissement de la solution de coloration est nécessaire. </li><li> Après la procédure de coloration éliminer la solution de Coomassie et rincer deux fois avec les gels eau Milli-Q. Remarque: vous pouvez réutiliser la solution de coloration aussi longtemps que les particules sont encore en suspens, sinon jetez-le (n&#39;oubliez pas que votre laboratoire peut avoir des règlements spéciaux pour l&#39;élimination des déchets). </li><li> Retirer coller des particules de colorant de l&#39;antenne avec une coloration non pelucheux serviette en papier et Décolorer pendant 10 - 60 minutes. Note: Vous pouvez aussi laver les gels juste avec eau Milli-Q, mais cela nous recommandons que pour la chromatographie préparative gels car il y aura une dernière irrégulière, film faibles Coomassie sur les gels qui se poseront pendant la procédure de numérisation. </li><li> Enfin rincez les gels à deux reprises avec eau Milli-Q: les gels atteindront leur épaisseur d&#39;origine (les médias l&#39;alcool-acide fait du rétrécissement des gels) et de neutralisation dans l&#39;eau augmente l&#39;intensité des couleurs de plus de Coomassie. </li></ul> Partie 3: Les résultats représentatifs Si vous suivez le protocole décrit ci-dessus, vous obtiendrez sur votre 2-D de gel distinctifs résolus et bien teinté foncé spots protéiques bleu. Même par rapport à un gel 2-D taché avec de l&#39;argent en fonction de Shevchenko et al. 5, un protocole affirmant une bonne sensibilité et une compatibilité avec la spectrométrie de masse, nous obtenons des résultats coloration égale. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Résultat final de l&#39;expérimentation décrite ci-dessus. Kang Coomassie protocole (A) effectue vivement, comme la coloration d&#39;argent conformément à Shevchenko et al. (B) dans la détection des protéines après 2-D électrophorèse sur gel. Partie 4: Trucs et astuces <ul><li> Effectuez quelques colorations test avant le traitement vos propres échantillons. Pour des raisons inexplicables, nous avons signalé que, parfois une protéine d&#39;intérêt ne pouvait pas être détecté avec succès, même lorsque milligrammes ont été appliquées. Dans ce cas nous vous conseillons de préparer quelques séries de dilution de tester la sensibilité. </li><li> Si vous avez peu de gel de détection de la protéine (s) en général, le transfert échoue de l&#39;empilement au gel de séparation au cours de SDS-PAGE sera peut-être la raison. Vous pouvez vérifier ces protéines collantes par coloration du gel complet incluant la zone d&#39;empilage. </li><li> Pour une vérification rapide de vos résultats axés isoélectrique, vous pouvez directement tacher les bandes IPG-sans aucune séparation seconde dimension supplémentaire. </li><li> Parfois leur tour, les gels pendant la procédure de coloration afin qu&#39;ils soient uniformément teinté des deux côtés (si vous gardez les gels impassible, le colorant se lie à un seul côté du gel). </li><li> Nous avons connu que le stockage de la solution de coloration dans une bouteille sombre augmente sa durée de vie (dans des bouteilles transparentes jusqu&#39;à 4 mois). </li><li> Après coloration et la documentation que vous pouvez garder les gels dans le réfrigérateur pendant plusieurs années (si vous ajoutez une solution acide, vous éviter les contaminations par des champignons). </li><li> Décoloration de bouchons de gel pour une digestion trypsique peut être accéléré par le réchauffement dans un chauffe-bloc. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Innovants ou tout simplement un autre protocole de Coomassie? À l&#39;heure actuelle, il existe plusieurs protocoles pour les procédures de coloration de Coomassie Brilliant Blue. La plupart d&#39;entre eux résultent de modifications mineures ou majeures de l&#39;un des protocoles les plus couramment utilisés par les Neuhoff et ses collègues 2. Aussi le protocole Kang est basé sur la formule de Neuhoff. Mais est-ce vraiment une méthode de coloration au bleu de Coomassie alt...

<table border="1" ><tr><td> Nom du produit </td><td> Société </td><td> No de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Pour l&#39;IEF et SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip gels </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Peut même être utilisé 2 ans après la date d&#39;expiration. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling Plateau </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Ne pas nettoyer avec des solvants organiques. Conçu pour les 7-18 cm IPG-bandes. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Comprend un plateau électrodes, porte-électrodes, anode et cathode, aligneur et le bar de la Coupe de l&#39;échantillon et des coupes de l&#39;échantillon. </td></tr><tr><td> EPS 3501 Alimentation XL </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Fournitures de tension jusqu&#39;à 3500 V. </td></tr><tr><td> Unité Multiphor électrophorèse II </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Électrodes mobiles permettent l&#39;IEF dans les bandes IPG de toute longueur (7-24 cm IPG strips) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel de système Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE en 10x10 cm mini-gel format. Gel chambre comprend un système de refroidissement. </td></tr><tr><td> Pour colloïdale Coomassie G-250 de coloration: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coloration des plats avec des couvercles </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Convient pour les mini-gels. Empilable sur agitateur. </td></tr><tr><td> sulfate d&#39;aluminium-18-hydrate </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Nous avons fait une meilleure expérience avec Merck. Juste disponible en 5 kg emballage. </td></tr><tr><td> l&#39;acide orthophosphorique </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Vendu en bouteilles de verre. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines séparées par SDS-PAGE, offrant une procédure de coloration simple et quantification élevée. Par ailleurs, il est totalement compatible avec l&#39;identification des protéines par spectrométrie de masse. Mais malgré ces avantages, CBB est considéré comme moins sensible que d&#39;argent ou de colorations fluorescence et donc rarement utilisés pour la détection des protéines dans les approches protéomiques analytiques à base de gel. Plusieurs améliorations de l&#39;original du protocole 1 de Coomassie ont été faits pour augmenter la sensibilité de la CBB. Deux modifications majeures ont été introduites pour améliorer la détection de protéines de faible abondance par la conversion des molécules de colorant dans les particules colloïdales: En 1988, Neuhoff et ses collègues ont utilisé 20% de méthanol et de plus fortes concentrations de sulfate d&#39;ammonium dans le CBB G-250 une solution de coloration basée 2, et en 2004, al Candiano et al. établie Blue Silver utilisant CBB G-250 avec de l&#39;acide phosphorique en présence de sulfate d&#39;ammonium et de méthanol 3. Néanmoins, toutes ces modifications permettent simplement une détection d&#39;environ 10 ng de protéines. Un protocole largement fameless pour Coomassie coloration colloïdale a été publié par Kang et al. En 2002 où ils ont modifié le protocole Neuhoff colloïdale coloration CBB concernant les substances complexantes. Au lieu de sulfate d&#39;ammonium ils ont utilisé du sulfate d&#39;aluminium et de méthanol a été remplacé par le 4 éthanol moins toxiques. La base d&#39;aluminium dans l&#39;étude de nouvelles taches de Kang a montré une sensibilité supérieure, qui détecte aussi bas que 1 ng / bande (phosphorylase b) avec une variation peu de sensibilité en fonction des protéines. Ici, nous démontrons l&#39;application du protocole de Kang rapide et sensible pour la coloration de Coomassie colloïdal de protéines à des fins analytiques. Nous allons illustrer le protocole rapide et facile en utilisant des gels bidimensionnels en routine dans notre groupe de travail.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Pour la détection de protéines moyenne 4 ng dans les gels. La coloration est terminé dans les 2 heures et sans aucun effort. Nous utilisons régulièrement le protocole de Kang des fins d&#39;analyse en gel à base de protéomique.

Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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40.0K vues.  University Duesseldorf. Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang Et al. Pour la détection de protéines moyenne 4 ng dans les gels. La coloration est terminé dans les 2 heures et sans aucun effort. Nous utilisons régulièrement le protocole de Kang des fins d'analyse en gel à base de protéomique.

Vidéo: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Coloration protéines dans les gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

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Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Électrophorèse sur gel dénaturant Urée polyacrylamide (PAGE urée)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Développement d&#39;une bande de test immunochromatographique à base d&#39;or colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...