Agradecemos ao Dr. Nicola Wiethölter para a preparação e coloração de 1-D gels. Este trabalho foi financiado por uma doação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e apoiado por uma bolsa de pesquisa do Manchot Jürgen Stiftung para ND.

Parte 1: Two-dimensional eletroforese em gel (2-D), utilizando taça de carregamento <ol><li> IPG strip-reidratação e focalização isoelétrica (IEF) <ul><li> Reidratar géis DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) em 125 mL de solução de reidratação [7 M uréia, 2 M tiouréia, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampão pH 6-11] usando a bandeja DryStrip Immobiline Reswelling para pelo menos 10 horas. </li><li> Dissolver amostra de proteína precipitado em IEF tampão de amostra [7 M uréia, tiouréia 2 M, CHAPS 2%, 2% ASB-14, hydroxyethyldisulfide mM 50 e 2% IPG tampão pH 6-11] correspondente a 60-100 mg de proteína por 100 ml . </li><li> Após solubilização (pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente), aplicar amostra de proteína via anódica xícara de carga, utilizando copos de amostras. O volume do copo é de 100 l (cups Manifold permitem até 150 mL). Nota: você pode carregar grandes quantidades de amostra, se você inserir um passo de baixa tensão no início do protocolo de foco e encher os copos enquanto ainda há uma película de líquido no copo! </li><li> Realizar focalização isoelétrica para 11,1 KVH no modo gradiente na Unidade de Eletroforese Multiphor II. </li></ul></li><li> Equilíbrio e SDS-PAGE <ul><li> Depois IEF, as tiras IPG foram submetidos a uma redução e alquilação, cada tempo de 15 minutos em um agitador, usando ditiotreitol 1% e 2,5% respectivamente iodoacetamida em solução de equilíbrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M de uréia, glicerol 30% e 2% SDS]. </li><li> Lave as tiras equilibrada com H 2 O e exterminá-los em papel Whatman para remover excesso de tampão de equilíbrio. Depois mergulhar as tiras em SDS-tampão de corrida (1X). </li><li> Segunda dimensão é realizada por SDS-PAGE em um sistemas de eletroforese vertical, com uma concentração de acrilamida total de 12%. As tiras IPG foram equilibradas colocados no topo dos géis de separação e fixados com solução de agarose quente [agarose 0,5% em tampão de corrida contendo azul de bromofenol]. </li><li> Proteínas foram separadas por 2,5 horas, a partir de 80 V por 15 minutos, seguida de 120 V até a frente de corante atinge o fundo da gaveta gel. </li></ul></li></ol> Parte 2: coloração Coomassie coloidal com CBB G-250 1. Soluções de coloração Nota: para a preparação das soluções de coloração, utilize produtos químicos com alta qualidade, tais como grau analítico (pa) e água de alta pureza como você começa a partir Millipore sistemas (água Milli-Q). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Solução de Coomassie: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> sulfato de alumínio (14-18)-hidrato </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> ácido ortofosfórico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Nota: para a preparação da solução de coloração, a adição seqüencial dos componentes na seguinte ordem tem de ser mantido: <ol><li> dissolver primeiro sulfato de alumínio em água Milli-Q </li><li> depois adicionar etanol, homogeneizar e mix CBB G-250 para a solução </li><li> recentemente, a solução é totalmente dissolvido, acrescentar ácido fosfórico (a incorporação do ácido para a mídia alcoólicas permite que as moléculas de Coomassie agregar em seu estado coloidal) </li><li> finalmente, encher com água Milli-Q </li></ol> Nota: a solução de coloração final tem uma aparência verde-azulado escuro e está cheio de partículas de natação ao redor: <ul><li> Não filtrado esta solução! </li><li> Se você alterou a ordem de preparação, você teria uma solução mais violeta-azulada que é menos sensível. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Descoloração solução: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> ácido ortofosfórico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Processo de coloração <ul><li> Após a separação segunda dimensão, remova cuidadosamente os géis das placas de vidro e transferi-los para um prato cheio de coloração água Milli-Q. </li><li> Lave o gel três vezes com água Milli-Q por 10 minutos em um agitador horizontal (lavagem insuficiente causa sensibilidade pobres porque a SDS restante no gel perturba o delimitadora do corante à proteína). </li><li> Agitar a solução Coomassie antes do uso para dispersar as partículas coloidais uniformemente. </li><li> Incubar o gel bem coberto com a solução de Coomassie por agitação em um agitador de 12/02 horas. Esta coloração gera marginais de fundo para que você possa observar o progresso coloração no meio. Nota: após 10 minutos você pode ver manchas primeira proteína que aparece, dentro de 2 horas de incubação de cerca de 80% da coloração a elas nível máximo é concluída. Por quase 100% de coloração, a incubação durante a noite é recomendado. Em alguns casos, quando a quantidade de proteína a ser manchado é enorme ea solução se transforma em um azul brilhante, uma atualização da solução de coloração é necessário. </li><li> Após o procedimento de coloração remover a solução Coomassie e lavar o gel duas vezes com água Milli-Q. Nota: você pode reutilizar a solução de coloração, desde que as partículas são ainda remanescentes, caso contrário, descarte-o (lembre-se que o seu laboratório pode ter regras especiais para a eliminação de resíduos). </li><li> Remover partículas de corante degola do prato com uma coloração que não solte fiapos toalha de papel e destain para 10-60 minutos. Nota: Você também pode lavar o gel apenas com água Milli-Q, mas isso recomendamos apenas para preparativa géis porque não vai durar um irregular, o filme de Coomassie fraco no gel que irão surgir durante o processo de digitalização. </li><li> Finalmente lavar o gel duas vezes com água Milli-Q: o gel chegará a sua espessura original (a mídia álcool-ácido faz o encolhimento géis) e neutralização em água, adicionalmente, aumenta a intensidade de cor Coomassie. </li></ul> Parte 3: Os resultados representativos Se você seguir o protocolo descrito acima, você receberá em seu gel 2-D distintas e bem resolvida manchado manchas escuras proteína azul. Mesmo comparado a um gel 2-D corados com prata de acordo com Shevchenko et al. 5, um protocolo alegando boa sensibilidade e compatibilidade com espectrometria de massa, conseguimos resultados de coloração igual. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Resultado das experiências descritas acima. Coomassie Kang protocolo (A) realiza fortemente como a coloração pela prata de acordo com Shevchenko et al. (B) na detecção de proteínas após o 2-D eletroforese em gel. Parte 4: Dicas e truques <ul><li> Executar algumas colorações teste antes de processar suas próprias amostras. Por razões inexplicáveis, por vezes, nós informamos que uma proteína de interesse não pode ser detectado com sucesso, mesmo quando miligramas foram aplicados. Neste caso, recomendamos a preparar algumas séries de diluição para teste de sensibilidade. </li><li> Se você tem baixa em gel de detecção da proteína (s) na transferência, em geral mal sucedidas do empilhamento para o gel de separação durante a SDS-PAGE será possivelmente a razão. Você pode verificar essas proteínas adesivas através da coloração do gel completo, incluindo a área de empilhamento. </li><li> Para uma verificação rápida dos seus resultados com foco isoelétrico, você pode diretamente mancha as tiras IPG, sem qualquer separação outra dimensão segundo. </li><li> Ocasionalmente, por sua vez o gel durante o procedimento de coloração para que eles sejam manchadas por igual de ambos os lados (se você manter o gel imóvel, o corante liga-se a apenas um lado do gel). </li><li> Fizemos a experiência de que o armazenamento da solução de coloração em uma garrafa escura aumenta sua vida útil (em garrafas transparentes até 4 meses). </li><li> Após a coloração e documentar você pode manter o gel na geladeira por vários anos (se você adicionar solução ácida a evitar contaminações por fungos). </li><li> Descoloração de plugues gel para uma digestão tríptica pode ser acelerado pelo aquecimento em um aquecedor de bloco. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Inovadora ou apenas outro protocolo Coomassie? No momento existem vários protocolos para a coloração de procedimentos com Coomassie Brilliant Blue. A maioria deles o resultado de modificações maiores ou menores de um dos protocolos mais comumente usados ​​por Neuhoff e colegas 2. Também protocolo Kang é baseado na fórmula de Neuhoff. Mas é realmente um método de coloração Coomassie alternativa para a pesquisa proteômica? Vamos imagem duas questões principais, lim...

<table border="1" ><tr><td> Nome do produto </td><td> Companhia </td><td> No. de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Para IEF e SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip géis </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Pode até ser usado dois anos após a data expirar. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Bandeja Reswelling </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Não devem ser limpos com solventes orgânicos. Projetado para 7-18 centímetros IPG-tiras. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Inclui uma bandeja, porta-eletrodo anodo e catodo de eletrodos, alinhador e bar copo de amostra e copos de amostra. </td></tr><tr><td> EPS 3501 Alimentação XL </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Fontes de tensão até 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor Unidade II Eletroforese </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Eletrodos móveis permitem IEF em tiras IPG de todo o comprimento (7-24 centímetros IPG strips) </td></tr><tr><td> Perfectblue gel sistema Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE em formato 10x10 cm mini-gel. Gel câmara inclui um sistema de refrigeração. </td></tr><tr><td> Para coloidal Coomassie G-250 coloração: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coloração pratos com tampas </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Se encaixa para mini-géis. Empilhável em shaker. </td></tr><tr><td> sulfato de alumínio-18-hidrato </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Fizemos melhor experiência com a Merck. Apenas disponível em 5 pacote kg. </td></tr><tr><td> ácido ortofosfórico </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Vendidas em garrafas de vidro. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) é um corante comumente usado para a visualização de proteínas separadas por SDS-PAGE, oferecendo um processo de coloração simples e quantificação de altura. Além disso, é totalmente compatível com identificação de proteínas espectrometria de massa. Mas, apesar dessas vantagens, a CBB é considerado para ser menos sensível do que a prata ou colorações de fluorescência e, portanto, raramente usado para a detecção de proteínas em gel analítica abordagens baseadas em proteômica. Várias melhorias do original Coomassie protocolo 1 foram feitas para aumentar a sensibilidade da CBB. Duas grandes modificações foram introduzidas para aumentar a detecção de proteínas de baixa abundância, convertendo as moléculas de corante em partículas coloidais: Em 1988, Neuhoff e colegas aplicaram 20% de metanol e maiores concentrações de sulfato de amônio no G-250 CBB solução corante com base 2, e em 2004 Candiano et al. estabelecida Prata Azul usando CBB G-250 com ácido fosfórico na presença de sulfato de amônio e metanol 3. No entanto, todas estas modificações apenas permitem uma detecção de aproximadamente 10 ng de proteína. Um protocolo muito obscuro para a coloração Coomassie coloidal foi publicado por Kang et al. Em 2002, onde eles modificaram Neuhoff protocolo de coloração coloidal CBB sobre as substâncias complexantes. Em vez de sulfato de amônio que usaram sulfato de alumínio e metanol foi substituído pelo 4 etanol menos tóxicos. A base de alumínio romance coloração em estudo Kang mostrou sensibilidade superior que detecta tão baixos como 1 ng / banda (fosforilase b) com variação pouca sensibilidade dependendo proteínas. Aqui, nós demonstrar a aplicação do protocolo de Kang para rápido e sensível coloração Coomassie coloidal de proteínas em fins analíticos. Vamos ilustrar o protocolo rápido e fácil usando géis bi-dimensional realizada rotineiramente em nosso grupo de trabalho.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Este vídeo é popularizar uma coloidal Coomassie G-250 protocolo de coloração de acordo com Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Para a detecção de proteínas ng média de 4 em géis. A coloração é concluída dentro de duas horas e sem qualquer esforço. Rotineiramente utilizam o protocolo Kang para fins analíticos, de gel com base em proteômica.

Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

40.0K visualizações.  University Duesseldorf. Este vídeo é popularizar uma coloidal Coomassie G-250 protocolo de coloração de acordo com Kang Et al. Para a detecção de proteínas ng média de 4 em géis. A coloração é concluída dentro de duas horas e sem qualquer esforço. Rotineiramente utilizam o protocolo Kang para fins analíticos, de gel com base em proteômica.

Vídeo: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Coloração Proteínas em Gel

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...