מימון ותמיכה המסופקים על ידי NIH מענק HL89764, NSF מענקים 0546012, 0730503 ו - 0725528.

א Biotinylation של דנ&quot;א פלסמיד דנ&quot;א היו biotinylated קוולנטית עם גואנן ספציפי תוויות ביוטין כפי שתואר על ידי היצרן (Mirus ביו, מדיסון, ויסקונסין), אך בקנה מידה יש ​​~ 1-2 תוויות ביוטין לכל ה-DNA. ה-DNA פלסמיד (pEGFP-C1, 4.9 קילו, Clontech, Mountain View, CA) סומן בפרוטוקול זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס כמות הרצויה של pDNA לתוך TE חיץ של DNase-RNase חופשי חופשי (איכות ביולוגיה מולקולרית כיתה) מים כדי ליצור פתרון ה-DNA 1μg/μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתנהגות התגובה תיוג באמצעות תערובות התגובה הבאה. מוסיפים את תווית ה-IT מגיב האחרון. </li></ol> עבור התגובה DNA 100μg: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> DNase-חופשית RNase ללא מים </td><td> 75 μL </td></tr><tr><td> תיוג הצפת 10X </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> תווית ה-IT מגיב </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> סך נפח </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מדגם מתויג על ידי אתנול או משקעים isopropanol הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים. </li></ol> הערה: סינון ג&#39;ל עמודות מבוסס עלול להוביל ספיגת UV גבוה או רקע הקרינה, אשר עשויים להשפיע על כימות ואפיון DNA או פלואורסצנטי. הערה: רמת biotinylation עשוי להיקבע על ידי הבה מבוסס בדיקות. ב תיוג של פולימר קטיוני-Cy5 Chitosan (390 kDa, 83.5% deacetylated, Vanson, ברדמונד, וושינגטון) שימש פולימר קטיוני המודל במחקר זה. אמינים ראשוני בחינם על עמוד השדרה chitosan פולימר תויגו עם Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על בנין שלם של צבע Cy5, לחשב את הכמות הנדרשת של Cy5-NHS כזה יחס טוחנת של Cy5: אמינים העיקרי הוא 1: 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה chitosan (במאגר אצטט 25mm) ל ~ 6.5 על ידי תוספת של NaOH. שים לב התגובה NHS הוא יעיל יותר ב-pH בסיסי, אך מסיסות של chitosan כאן מגביל את טווח ה-pH עובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב, מוסיפים באיטיות את כמות מחושבת של Cy5-NHS (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DMSO) לפתרון chitosan באופן טיפה אחר טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס את תערובת בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטהר, dialyze עם 10k MWCO Slide-a-Lyzer (פירס) במשך שעה 2 נגד המאגר אצטט 1% על טמפ החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף חיץ dialyze עוד שעה 2 ב temp בחדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף חיץ dialyze לילה ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מטוהרים שכותרתו פולימר ב -20 ° C. </li></ol> הערה: במחקר זה, עקומת הסטנדרטי הוא נבנה על ידי מדידת עוצמת פליטת Cy5-NHS אסתר ב 670 ננומטר. לאפיין את צפיפות תיוג על ידי מדידת הפליטה המתקבל מ - 670 ננומטר Cy5 שכותרתו chitosan בעקומה הסטנדרטית. ספיגת עשוי לשמש גם כדי לקבוע את היעילות תיוג אך לא בוצע כאן. ג הכנת QD שכותרתו DNA ו-Polymer Cy5 היחס של טוחנת pDNA כדי QD הוחזק עודף (pDNA: QD ≈ 1: 2) על מנת להבטיח בנין שלם של QDs כדי pDNA. מספר QDs שכותרתו על כל pDNA ניתן להעריך דרך TEM הדמיה או מתקנים מקבילים אחרים. במחקר שלנו, במספר QDs לכל pDNA מוערך על ידי ~ 1-3 TEM וספקטרוסקופיה מולקולה בודדת. 1 השתמש Millipore מילי-Q שיפוע מים (&gt; 18.0 מגוואט, 0.2um מסונן) במהלך תקופת ההכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום הנדרש עבור chitosan 10μg pDNA לפי יחס N / P הרצוי, את היחס התיאורטי של אמינים protonated בפתרון chitosan על פוספטים שלילי פתרון ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף streptavidin-פונקציונליות 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לתוך התמיסה pDNA biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ה-DNA QD שכותרתו לתוך 50 mM פתרון נתרן סולפט להפוך את 200μL נפח סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל Cy5-chitosan, על פי היחס N / P הרצוי, עם מים מילי-Q על מנת להפוך את 200μL נפח סופי. </li></ol> הערה: שמור את התגובה בחושך כדי למנוע photobleaching אפשרי. חשוב: היזהר להשתמש 605 Qdot ITK ™ streptavidin המצומד (סדרת ITK), כמו נקודות קוונטיות בקטלוג זה נועדו לצורך סריג. סדרת Qdot קבוע הם מצומדות בשכבה PEG למנוע הלא ספציפית מחייב, במיוחד עבור תיוג הסלולר. עם זאת, ציפוי נוסף מגדיל את המרחק-acceptor התורם, וכתוצאה מכך reduced העברת יעילות אנרגיה. ד ייצור של SU-8 מאסטרס באמצעות photolithography רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקיק Si הוא פיראניה ניקה אפוי ב 200 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עובי האב המיועד של 25μm, מעיל ספין photoresist שלילית (SU-8 2025, Microchem, ניוטון, MA) על פרוסות סיליקון Si בסל&quot;ד 2000 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפות Soft רקיק על פלטה חמה עם הרמפה של 65 ° C / שעה עד 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את האור האולטרה סגול (365nm) עבור 250mJ/cm 2 דרך הסרט מסכה (CAD / אמנות שירותים, Bandon, OR) המכיל את העיצוב של microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפה לאפות את רקיק על פלטה חמה עם הרמפה של 65 ° C / שעה עד 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח רקיק באמצעות SU-8 מפתח photoresist. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקיק בדוגמת הוא אפוי קשה עם הרמפה של 65 על פלטה חמה ° C / שעה עד 200 ° C. שמירה על פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס במשך לפחות 5 שעות, ואז להתקרר בהדרגה רקיק לטמפרטורת החדר. </li></ol> חשוב: ramping הדרגתית במהלך SU-8 אפייה תהליך הורים הוא הכרחי, אחרת SU-8 מבנה עשוי מנותקת פרוסות סיליקון או סדקים על SU-8 מבנה עשוי להיגרם על ידי שחרור מתח. א Replica דפוס של PDMS מן המאסטרים Bonding כדי זכוכית מכסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדון SU-8 ממוקם סירה במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון מערבבים סוכן אלסטומר וריפוי (פולי (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) בתוך 10: 1 יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת PDMS על המאסטר SU-8 ולהשאיר את הסירה במשקל ייבוש ואקום כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure PDMS על 65 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל רצועת PDMS מהתבנית האב סי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ ערוץ פתחי הכניסה שקעים של המכשיר fluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את רצועת PDMS זכוכית לכסות עם אתנול ואז אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייחס ניקה PDMS רצועת זכוכית מכסים פלזמה חמצן (20W עבור 1min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד האג&quot;ח PDMS רצועה עם כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את שבב microfluidic מלוכדות בתנור על 95 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol> חשוב: טיפול פלזמה ואפייה לילה חיוניים כוח מליטה משופרת. פ צג היווצרות Nanocomplexes DNA במכשיר Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את ערוץ microfluidic עם מים (כדי להבטיח שאין בועות בתוך הערוץ microfluidic), לפני טעינת ריאגנטים על מנת להבטיח זרימה חלקה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ה-DNA-QD שכותרתו Cy5 שכותרתו chitosan פתרונות לשני מזרקים זכוכית בודדים, דרך צינורות המתואר בסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורות עם שני פתחי הכניסה של מכשירים microfluidic. היזהר לא להכניס כל האוויר במהלך התהליך. הגדר את קצב הזרימה ב 20nL/min (PHD-2000 משאבת מזרק, Holliston, MA), בתנאים זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את microchannels מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תזרים יציב (~ 15 עד 20 דקות), QD בתיווך סריג יש לשים לב במרכז הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות פלואורסצנטי (CCD מקורר, Qimaging, BC, קנדה) במקומות שונים לאורך התעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונות פלואורסצנציה עם ImageJ ו OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. QD-סריג מספק אינדיקציה רגיש של תחילת Nanocomplexes DNA הרכבה עצמית <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה קוונטית בתיווך תהודה פלואורסצנציה העברת אנרגיה (QD-סריג) יכול לספק אינדיקציה כמותית רגישות גבוהה של יציבות polyplex באחת סביבות חוץ או פנים סלולריים, המאפשר זיהוי חד משמעי של תחילת יחסי הגומלין בין דנ&quot;א נושאת גן. הזוג סריג, 605QD ו Cy5, נבחרה בהתבסס על מיקסום חפיפה ספקטרלית בין התורם acceptor ומזעור פוטנציאל לחצות לדבר. עבור זוג זה, המרחק פורסטר היא 69.4Å 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה עצמית של QD-סריג nanocomplexes DNA. פלסמיד דנ&quot;א anionic (pDNA) ואת המוביל גן קטיוני תויגו עם QD (תורם אנרגיה) ו Cy5 (אנרגיה acceptor), בהתאמה. QD-סריג nanocomplexes נוצרו באמצעות coacervation מורכב אלקטרוסטטית. לאחר עירור ב 488 ננומטר, QD-סריג בתיווך Cy5 פליטת הצביעו היווצרות nanocomplex קומפקטי ללא פגע. השעה מגורים (t R) יכול להיות מחושב על פי המרחק (x) אשר מודד שממנו שני הזרמים נפגשים למצב של תגובה תחת חקירה, ואת מהירות זרימת אומר (v). בשל אופיו של זרימה למינרית, ערבוב מתרחשת רק על הממשק (במרכז של כל תמונה), מאפשר חישוב מדויק של תחבורה המונית כפונקציה של t R. רזולוציה הזמני יכול להיות מותאם על ידי שינוי applieד ספיקות. (הבלעה) סריג בתיווך אות נצפתה מיד בממשק כאשר שני זרמים נפגשו, המציין מחייב כי היה מהיר, המתרחשים בתוך כמה אלפיות לפי שיעורי זרימה שימושית. בר סולם: 100μm. </li></ol>

<ol>
	<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li><li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li><li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor.">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשמעות של העבודה שלנו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהו ניסיון ראשון לעקוב אחר פולימריות nanocomplex DNA הרכבה עצמית קינטיקה בזמן אמת (אלפית השנייה רזולוציה) דרך QD-סריג התגובות בתוך microfluidic שבב פשוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> QD בתיווך סריג מספק אינדיקציה רגיש מאוד כמותי של תחילת אינטראקציות מולקולריות לאורך כל תהליך ההרכבה העצמית, בעוד מיקרופלואידיקה מציעה microenvironment מבוקר היטב מרחבית כדי לנתח את התהליך במהלך הסינתזה nanocomplex DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השילוב של מיקרופלואידיקה nanophotonics מציע גישה חדשה ומעניינת לחקור כל סוג של תגובות complexation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך QD-סריג nanocomplexes DNA פולימריות יכול להיות מיושם בקלות להקמת מבנה תפקודי מערכות יחסים. 1,2 </li></ol></li></ul>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem</td>
<td>SU-8 2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>pEGFP-C1</td>
<td>4.9 kb, MW = 3.3 x 106</td>
</tr>
<tr>
<td>LabelIT Biotin Labeling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mirus Bio LLC</td>
<td>MIR 3400</td>
<td>Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin 605QD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Qdot&reg; 605 ITK&trade; Streptavidin Conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5-NHS Ester</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>PA15101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chitosan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vanson</td>
<td>390 kDa </td>
<td>83.5% deacetylated</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545C</td>
<td>No. 1; Size: 40 x 22mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastight Glass Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>TLL series</td>
<td>50&mu;L to 500&mu;L depending on sample volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Tygon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>0.02 ID, 100ft</td>
<td>Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft</td>
</tr>
<tr>
<td>Connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>HTX-23R</td>
<td>Customized in length of 0.750"</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qimaging</td>
<td>Intensified Retiga Cooled</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX-51</td>
<td>100W mercury arc lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>v1.36b</td>
<td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td>
</tr>
<tr>
<td>Origin Pro8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OriginLab</td>
<td>Student Version</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>475AF40</td>
<td>Excitation filter in both channels</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595AF60</td>
<td>Emission filter in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>670DF40</td>
<td>Emission filter in QD-FRET channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>500 DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in QD-FRET channel</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining qd-fret and microfluidics to monitor dna nanocomplex self-assembly in real-time

ההתקדמות הגנומיקה להמשיך את הפיתוח של דלק ותרופות כי יכול למקד בפתוגנזה ברמה תאית ומולקולרית. פונקציונלי בדרך כלל בתוך התא, גרעין חומצה מבוסס הרפוי דורשים מערכת יעילה משלוח תאיים. גישה אחת היא לאימוץ נרחב ל-DNA מורכב עם הספק גן כדי ליצור nanocomplexes אלקטרוסטטית באמצעות הרכבה עצמית, להקל על ספיגת הסלולר של דנ&quot;א תוך הגנה עליו מפני השפלה. האתגר טמון בעיצוב רציונלית של נשאי הגן יעיל, שכן מוקדם מדי מחייב ניתוק או יציבה לא להזיק ספיגת הסלולר היעילות הטיפולית. Nanocomplexes מסונתז על ידי ערבוב בתפזורת הראה מגוון רחב של התנהגות תאיים לפרוק וסחר, אשר יוחס ההטרוגניות בגודל וביציבות של nanocomplexes. ההטרוגניות כזו המקשה על הערכה מדויקת של הרכבה עצמית קינטיקה ומוסיף הקושי correlating המאפיינים הפיזיים שלהם יעילות transfection או bioactivities. אנו מציגים התכנסות הרומן של nanophotonics (כלומר QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לאפיין בזמן אמת קינטיקה של nanocomplex את הרכבה עצמית תחת זרימה למינרית. QD-סריג מספק אינדיקציה רגישה מאוד של תחילת אינטראקציות מולקולריות למדוד כמותית לאורך כל תהליך הסינתזה, ואילו מיקרופלואידיקה מציעה microenvironment מבוקר היטב מרחבית כדי לנתח את התהליך עם רזולוציה גבוהה הזמני (~ אלפיות השנייה). עבור מערכת מודל של nanocomplexes פולימריות, בשני שלבים נפרדים בתהליך הרכבה עצמית נתפסו על ידי פלטפורמה זו האנליטית. ההיבט הקינטית של תהליך ההרכבה העצמית המתקבל על microscale יהיה יקר במיוחד microreactor מבוססי התגובות אשר רלוונטיים יישומים מיקרו בקנה מידה ננו רבים. יתר על כן, nanocomplexes עשוי להיות מותאם אישית באמצעות תכנון נכון של מכשירים microfludic, ואת התוצאה QD-סריג nanocomplexes DNA פולימריות יכול להיות מיושם בקלות להקמת מבנה תפקודי מערכות יחסים.

Watch this Scientific Journal Video about Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time at JoVE.com

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  Johns Hopkins University. אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

Video: Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

מחקרים Chemotaxis חיידקית שימוש מיקרופלואידיקה - ראיון

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

יישום מיקרופלואידיקה Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...