Apoio financeiro fornecido pelo NIH conceder HL89764, NSF concede 0546012, 0730503 e 0725528.

A. Biotinilação de DNA DNA plasmidial foram covalentemente biotinilado guanina com etiquetas específicas biotina, conforme descrito pelo fabricante (Mirus Bio, Madison, WI), mas dimensionada para ter ~ 1-2 rótulos biotina por DNA. DNA plasmídeo (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) foi rotulada neste protocolo. <ol><li> Dissolver quantidade desejada de PDNA em tampão TE de DNase e livre de RNase-free (qualidade de biologia molecular-grade) de água para fazer uma solução de DNA 1μg/μL. </li><li> Realizar a reação rotulagem usando as misturas de reacção seguinte. Adicione o rótulo de TI último reagente. </li></ol> DNA para a reação 100μg: <table border="1"><tbody><tr><td> DNase-RNase livre e sem água </td><td> 75 mL </td></tr><tr><td> Tampão 10X Labeling A </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 L </td></tr><tr><td> Rotulá-la de reagente </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Volume Total </td><td> 200 mL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Incubar a reação a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Purificar a amostra rotulada por etanol ou isopropanol precipitação seguintes protocolos padrão. </li></ol> Nota: as colunas de filtração em gel com base pode levar a absorbância UV alto ou o fundo de fluorescência, que pode afetar a quantificação de DNA ou a caracterização de fluorescência. Nota: O nível de Biotinilação pode ser determinada por Haba baseado em testes. B. Rotulagem da Polymer Cy5-Catiônicos Quitosana (390 kDa, 83,5% desacetilado, Vanson, Redmond, WA) foi usado como um polímero catiônico modelo neste estudo. As aminas primária gratuita na espinha dorsal do polímero quitosana foram marcados com Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). <ol><li> Para facilitar a conjugação completa dos Cy5 corante, calcular a quantidade necessária de Cy5-NHS tal que a relação molar de Cy5: aminas primárias é de 1: 200. </li><li> Ajustar o pH da solução de quitosana (em tampão acetato 25mM) para ~ 6,5 pela adição de NaOH. Note-se que a reação do SNS é mais eficiente em pH básico, mas a solubilidade da quitosana aqui limita a faixa de pH de trabalho. </li><li> Agitando, lentamente adicione o montante calculado de Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) para a solução de quitosana de forma gota a gota. </li><li> Agitar a mistura no escuro à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Para purificar, diálise com 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) por 2 horas contra tampão acetato de 1% à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Substituir buffer e diálise outra hr 2 à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Substituir buffer e diálise overnight a 4 ° C no escuro. </li><li> Loja purificada rotulados de polímero a -20 ° C. </li></ol> Nota: Neste estudo, uma curva padrão é construída através da medição da intensidade de emissão de Cy5 NHS-éster a 670 nm. Caracterizar a densidade de rotulagem, pela medição da emissão obtidos a 670 nm de Cy5 marcado com quitosana na curva padrão. Absorbância também pode ser usado para determinar a eficiência de marcação, mas não foi realizado aqui. C. Preparação do QD-rotulados de DNA e Cy5-Polymer A razão molar de PDNA para QD foi mantido em excesso (PDNA: QD ≈ 1, 2) para garantir a conjugação completa dos QDs para PDNA. O número de QDs rotulados em cada PDNA pode ser estimado através TEM imagens ou outros recursos equivalentes. Em nosso estudo, o número de QDs por PDNA é estimado em ~ 1-3 por TEM e espectroscopia única molécula. Use um Millipore Milli-Q de água gradiente (&gt; 18,0 MW, 0.2um filtrada) durante a preparação. <ol><li> Calcular a quantidade necessária de quitosana para 10μg PDNA desejado de acordo com relação N / P, a relação teórica de aminas protonadas na solução de quitosana para os fosfatos negativa na solução de DNA. </li><li> Adicionar estreptavidina-funcionalizados 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) para a solução PDNA biotinilado. </li><li> Incubar a solução à temperatura ambiente no escuro por 15 min. </li><li> Adicione o DNA-QD rotulados em 50 solução de sulfato de sódio mM para fazer a 200μL volume final. </li><li> Diluir Cy5-quitosana, de acordo com a desejada relação N / P, com água Milli-Q para fazer a 200μL volume final. </li></ol> Nota: Mantenha a reação no escuro para evitar fotobranqueamento possível. Importante: Tenha cuidado ao usar o Qdot 605 ITK ™ estreptavidina conjugada (a série ITK), como pontos quânticos neste catálogo são projetados com a finalidade de FRET. A série Qdot regulares são conjugados com uma camada de PEG para evitar ligações não específicas, especialmente para a rotulagem celular. No entanto, essa camada adicional aumenta a distância doador receptor, resultando em reduced eficiência da transferência de energia. D. Fabricação do SU-8 Mestres usando fotolitografia padrão <ol><li> Wafer Si é piranha limpo e cozido a 200 ° C por 5 min. </li><li> Para a espessura de 25μm mestre designado, casaco girar o fotorresiste negativo (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA), em Si wafer a 2000 rpm por 30 seg. </li><li> Bake suave a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Exponha à luz UV (365 nm) para 250mJ/cm 2 a máscara de um filme (CAD / Art Services, Bandon, OR), contendo o projeto de microcanais. </li><li> Pós-exposição cozer a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Desenvolver o wafer usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste. </li><li> O wafer é difícil cozido estampados numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / h até 200 ° C. Manter o wafer de 200 ° C por pelo menos 5 horas, então, gradualmente, esfriar a bolacha até à temperatura ambiente. </li></ol> Importante: rampa gradual durante o SU-8 processo de cozimento mestre é necessário, caso contrário, o SU-8 estrutura pode destacada do wafer de silício ou fissuras na estrutura do SU-8 pode ser induzida pelo estresse de liberação. E. Moldagem Réplica de PDMS com os mestres e União para a tampa de vidro <ol><li> O mestre SU-8 é colocado em um barco de pesagem. </li><li> Mix de silicone elastômero e agente de cura (Poli (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI), em um 10: 1 ratio. </li><li> Despeje a mistura sobre o PDMS mestre SU-8 e deixar o barco pesa num exsicador de vácuo para remover as bolhas. </li><li> Curar o PDMS a 65 ° C por 1-2 horas. </li><li> Descasque a tira PDMS do molde mestre Si. </li><li> Entradas e saídas de soco canal do dispositivo fluídico. </li><li> Limpe a tira de PDMS e tampa de vidro com etanol e, em seguida, secar ao ar. </li><li> Tratar a limpo PDMS tiras e tampa de vidro com plasma de oxigênio (20W por 1min). </li><li> Imediatamente tira o vínculo PDMS com tampa de vidro. </li><li> Deixe o chip colado microfluídicos no forno a 95 ° C para pernoite. </li></ol> Importante: O tratamento do plasma e assar durante a noite são essenciais para a força de ligação reforçada. F. Monitorar a formação de DNA Nanocomplexes No dispositivo micro <ol><li> Preencha o canal microfluídicos com água (para garantir que não haja bolhas dentro do canal microfluídicos), antes de carregar os reagentes para garantir fluidez durante o experimento. </li><li> Carregar o DNA QD-rotulados e Cy5 marcado quitosana soluções em duas seringas de vidro individuais, através da tubulação descrito no vídeo. </li><li> Conecte o tubo com as duas entradas de dispositivos microfluídicos. Ser cautelosos para não introduzir qualquer ar durante o processo. Definir a taxa de fluxo em 20nL/min (PHD-2000 bomba de seringa, Holliston, MA), sob condições de fluxo laminar. </li><li> Verifique os microcanais sob o microscópio. </li><li> Quando o fluxo é estável (~ 15 a 20 minutos), QD-mediada FRET devem ser observadas no centro do canal. </li><li> Tirar fotos de fluorescência (CCD refrigerado, Qimaging, BC, Canadá) em diferentes locais ao longo do canal. </li><li> Analisar as imagens de fluorescência com ImageJ e OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. QD-FRET fornece uma indicação sensível do início da Nanocomplexes DNA auto-montagem <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Quantum dot-mediada transferência de energia de ressonância de fluorescência (QD-FRET) pode fornecer uma indicação quantitativa e altamente sensível de estabilidade Polyplex em qualquer ambientes extra-ou intra-celular, permitindo a detecção inequívoca do início das interações entre o DNA eo portador do gene. O par FRET, 605QD e Cy5, foi escolhido com base na maximização sobreposição espectral entre o doador eo receptor e minimizar o potencial cross-talk. Para este par, a distância é 69.4Å Förster. 3 </li><li> Auto-montagem do nanocomplexes QD-FRET DNA. DNA plasmídeo aniônicos (PDNA) ea transportadora gene catiônicos foram marcadas com QD (doador de energia) e Cy5 (energia aceitante), respectivamente. QD-FRET nanocomplexes foram formados através de coacervação complexa eletrostática. Após a excitação a 488 nm, QD-FRET mediada emissão Cy5 indicado formação de um nanocomplex compacto e intacta. O tempo de permanência (t R) pode ser calculado de acordo com a distância (x) que mede a partir de onde as duas correntes se encontram para a posição de reação sob investigação, ea velocidade média do fluxo (v). Devido à natureza do fluxo laminar, mistura só ocorre na interface (centro de cada imagem), permitindo o cálculo preciso de transporte de massa em função de t R. A resolução temporal pode ser ajustada pela variação da applietaxas de fluxo d. (Inset) FRET mediada por sinal foi observada imediatamente na interface, quando as duas correntes atendidas, indicando que a ligação foi rápida, ocorrendo dentro de alguns milissegundos de acordo com as taxas de fluxo aplicadas. Bar escala: 100μm. </li></ol>

<ol>
	<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li><li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li><li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor.">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<ul><li> Importância do nosso trabalho: <ol><li> Esta é a primeira tentativa de monitorar poliméricos DNA nanocomplex auto-montagem cinética em tempo real (milissegundo resolução) através QD-FRET respostas dentro de um chip simples microfluídicos. </li><li> QD-mediada FRET fornece uma indicação altamente sensível e quantitativa do aparecimento de interações moleculares e em todo o processo de auto-montagem, enquanto que a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo durante a síntese nanocomplex DNA. </li><li> A integração de microfluídica e nanofotônica sugere uma abordagem nova e interessante investigar qualquer tipo de reações de complexação. </li><li> O resultado QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função 1,2. </li></ol></li></ul>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem</td>
<td>SU-8 2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>pEGFP-C1</td>
<td>4.9 kb, MW = 3.3 x 106</td>
</tr>
<tr>
<td>LabelIT Biotin Labeling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mirus Bio LLC</td>
<td>MIR 3400</td>
<td>Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin 605QD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Qdot&reg; 605 ITK&trade; Streptavidin Conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5-NHS Ester</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>PA15101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chitosan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vanson</td>
<td>390 kDa </td>
<td>83.5% deacetylated</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545C</td>
<td>No. 1; Size: 40 x 22mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastight Glass Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>TLL series</td>
<td>50&mu;L to 500&mu;L depending on sample volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Tygon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>0.02 ID, 100ft</td>
<td>Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft</td>
</tr>
<tr>
<td>Connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>HTX-23R</td>
<td>Customized in length of 0.750"</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qimaging</td>
<td>Intensified Retiga Cooled</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX-51</td>
<td>100W mercury arc lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>v1.36b</td>
<td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td>
</tr>
<tr>
<td>Origin Pro8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OriginLab</td>
<td>Student Version</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>475AF40</td>
<td>Excitation filter in both channels</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595AF60</td>
<td>Emission filter in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>670DF40</td>
<td>Emission filter in QD-FRET channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>500 DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in QD-FRET channel</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining qd-fret and microfluidics to monitor dna nanocomplex self-assembly in real-time

Avanços na genômica continuar a alimentar o desenvolvimento de terapêuticas que possam alvo patogenia a nível celular e molecular. Tipicamente funcional dentro da célula, baseados em ácido nucléico terapêuticas requerem um sistema de entrega eficiente intracelular. Uma abordagem amplamente adotado é o de DNA complexo com um portador do gene para formar nanocomplexes via eletrostática auto-montagem, facilitando a captação celular de DNA, protegendo-o contra a degradação. O desafio consiste no desenho racional de portadores do gene eficiente, uma vez que a dissociação prematura ou excessivamente ligação estável seria prejudicial para a absorção celular e eficácia terapêutica. Nanocomplexes sintetizados através da mistura de massa mostrou uma grande diversidade de comportamento intracelular desembalar e tráfico, o que foi atribuído à heterogeneidade no tamanho e na estabilidade do nanocomplexes. Essa heterogeneidade dificulta a avaliação exata da cinética de auto-montagem e contribui para a dificuldade em correlacionar suas propriedades físico para a eficiência de transfecção ou bioativos. Nós apresentamos uma convergência romance de nanofotônica (ie QD-FRET) e microfluídica para caracterizar a cinética em tempo real do nanocomplex auto-montagem sob fluxo laminar. QD-FRET fornece uma indicação altamente sensível do início de interações moleculares e medida quantitativa em todo o processo de síntese, enquanto a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo com alta resolução temporal (~ milissegundos). Para o sistema modelo de nanocomplexes poliméricos, duas etapas distintas no processo de auto-montagem foram capturados por esta plataforma analítica. O aspecto cinética do processo de auto-montagem obtidos em microescala seria particularmente valiosos para microreactor baseado reações que são relevantes para muitas aplicações de micro e nano-escala. Além disso, nanocomplexes pode ser personalizada através de um design adequado dos dispositivos microfludic, ea conseqüente QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função.

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Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K visualizações.  Johns Hopkins University. Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.