دعم التمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة منح HL89764 NSF ، منح 0546012 ، 0730503 0725528 و.

ألف Biotinylation من الحمض النووي وbiotinylated تساهميا DNA البلازميد مع تسميات البيوتين جوانين محددة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة (Mirus بيو ، ماديسون ، ويسكونسن) ، ولكن أن يكون تحجيم ~ 1-2 التسميات البيوتين في الحمض النووي. وكان المسمى DNA البلازميد (pEGFP - C1 ، 4.9 كيلوبايت ، Clontech ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا) في هذا البروتوكول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل المبلغ المطلوب في pDNA العازلة من الدناز TE - ريبونوكلياز حرة وخالية من (البيولوجيا الجزيئية الصف الجودة) المياه لجعل الحل 1μg/μL الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسم سلوك رد الفعل باستخدام خليط التفاعل التالية. إضافة تسمية تكنولوجيا كاشف الماضي. </li></ol> للتفاعل الحمض النووي 100μg : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الدناز خالية والمياه الخالية من ريبونوكلياز </td><td> 75 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 10X العازلة وصفها </td><td> 20 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 1μg/μL الحمض النووي </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td> تسميته كاشف </td><td> 5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية عينة المسمى من قبل هطول الأمطار أو الإيثانول الأيزوبروبانول التالية البروتوكولات القياسية. </li></ol> ملاحظة : الأعمدة الترشيح جل تستند قد يؤدي إلى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عالية أو الخلفية مضان ، والتي قد تؤثر على الحمض النووي أو التوصيف الكمي مضان. ملاحظة : يمكن تحديد مستوى biotinylation بواسطة هبة القائم على الاختبارات. باء وصفها من البوليمرات Cy5 - الكاتيوني وقد استخدم الشيتوزان (390 كيلو دالتون ، 83.5 ٪ deacetylated ، Vanson ، ريدموند ، واشنطن) بوصفها نموذجا البوليمر الموجبة في هذه الدراسة. وكانت تسمية الأمينات الابتدائي المجاني على العمود الفقري البوليمر الشيتوزان مع NHS - Cy5 (أمرشام العلوم البيولوجية ، بيسكاتواي ، نيو جيرسي). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسهيل تصريف كامل Cy5 صباغة ، وحساب مثل هذه النسبة من المولي Cy5 المبلغ المطلوب من NHS - Cy5 : الأمينات الأولية هي 1 : 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل الشيتوزان (في المخزن خلات 25mM) إلى ~ 6.5 إضافة هيدروكسيد الصوديوم. علما بأن رد فعل NHS أكثر كفاءة في الرقم الهيدروجيني الأساسية ، ولكن ذوبان الشيتوزان هنا يحد من نطاق العمل الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التحريك ، إضافة ببطء المبلغ المحسوب Cy5 - NHS (1 ملغ / مل DMSO) إلى حل الشيتوزان بطريقة قطرة تلو قطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم الخليط في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنقية ، dialyze مع 10K MWCO الشرائح - A - Lyzer (بيرس) لمدة 2 ساعة عازلة ضد خلات 1 ٪ عند درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال العازلة وdialyze آخر ساعة 2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال العازلة وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن تنقية المسمى البوليمر في -20 درجة مئوية. </li></ol> ملاحظة : في هذه الدراسة ، هي التي شيدت منحنى القياسية عن طريق قياس كثافة الانبعاثات من Cy5 NHS - استر في 670 نانومتر. تميز العلامات الكثافة من خلال قياس الانبعاثات في الحصول على 670 ميل بحري من الشيتوزان - Cy5 المسمى في منحنى القياسية. ويمكن أيضا أن تستخدم الامتصاصية لتحديد كفاءة التوسيم ولكن لم يتم تنفيذ هنا. جيم إعداد QD التي تحمل علامات الحمض النووي وCy5 البوليمر تم الإبقاء على نسبة من المولي لpDNA QD في الفائض (pDNA : QD ≈ 1 : 2) لضمان التصريف الكامل لQDs pDNA. ويمكن تقدير عدد QDs المسمى على كل pDNA من خلال التصوير TEM أو مرافق أخرى مماثلة. في دراستنا ، ويقدر عدد QDs في pDNA أن ~ 1-3 بواسطة تيم واحد الطيفي الجزيء. 1 استخدام المياه ميليبور التدرج الملة - Q (&gt; 18.0 ميغاواط ، 0.2um تصفيتها) أثناء الإعداد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المبلغ المطلوب من أجل الشيتوزان pDNA 10μg وفقا لنسبة N / P المرجوة ، فإن نسبة الأمينات البروتونية النظرية في حل الشيتوزان إلى الفوسفات السلبية في حل الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة streptavidin - functionalized 605QDs (605 Qdot ITK ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) في حل pDNA biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة QD التي تحمل علامات الحمض النووي في 50 ملي محلول كبريتات الصوديوم لجعل 200μL الحجم النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Cy5 - الشيتوزان ، وفقا لنسبة N / P المطلوب ، مع ميلي - Q المياه لجعل 200μL الحجم النهائي. </li></ol> ملاحظة : حافظ على رد الفعل في الظلام لمنع photobleaching ممكن. المهم : كن حذرا في استخدام 605 Qdot ITK ™ streptavidin المتقارن (سلسلة ITK) ، كما تم تصميم نقاط الكم في هذا الكتالوج لغرض الحنق. سلسلة Qdot العادية هي مترافق مع طبقة الربط لمنع غير محددة وملزمة ، ولا سيما لوصفها الخلوية. ومع ذلك ، هذا الطلاء إضافية يوسع المسافة متقبل المانحين ، مما أدى إلى صeduced كفاءة الطاقة النقل. دال التصنيع للاساتذة SU - 8 عن طريق الطباعة التصويرية قياسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سي الرقاقة البيرانا تنظيفها والمخبوزة في 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسمك الرئيسي المعين من 25μm ، ومعطف تدور مقاومة للضوء سلبي (SU - 8 2025 ، Microchem ، نيوتن ، ماجستير) على رقاقة سيليكون على 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لينة خبز الرقاقة على موقد مع منحدر من 65 درجة مئوية / ساعة إلى 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض للأشعة فوق البنفسجية (365nm) ل250mJ/cm 2 من خلال فيلم القناع (CAD / خدمات فنية ، باندون ، OR) الذي يحتوي على تصميم microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعرض للخبز الرقاقة على موقد مع منحدر من 65 درجة مئوية / ساعة إلى 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير الرقاقة باستخدام SU - 8 المطور مقاومة للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثابت هو خبز الرقاقة منقوشة على موقد مع منحدر من 65 درجة مئوية / ساعة إلى 200 درجة مئوية. رقاقة في الحفاظ على 200 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 5 ساعات ، ثم تبرد تدريجيا وصولا الى رقاقة درجة حرارة الغرفة. </li></ol> المهم : التعلية تدريجي خلال عملية SU - 8 الخبز الرئيسي هو ضروري ، وإلا فإن SU - 8 هيكل قد فصل من رقاقة السيليكون أو تشققات على SU - 8 قد يكون محرضا بواسطة بنية الإفراج الإجهاد. هاء صب طبق من PDMS من سادة والترابط على الزجاج غطاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوضع سيد SU - 8 في قارب وزنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكيل وعلاج الاستومر مزيج من السيليكون (بولي (dimethylsiloxane) ، PDMS ، Sylgard 184 ، داو كورننغ ، ميدلاند ، ميتشيغن) في 10 : 1 النسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصب الخليط على PDMS سيد SU - 8 وترك القارب وزنها في مجفف فراغ لإزالة الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج PDMS في 65 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الشريط PDMS من القالب الرئيسي سي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة مداخل ومنافذ قناة الجهاز fluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الشريط PDMS والزجاج مع تغطية الايثانول ثم الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج تنظيف الشريط PDMS والزجاج غطاء البلازما مع الأكسجين (20W ل1min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور السندات الشريط PDMS مع زجاج الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك شريحة ميكروفلويديك المستعبدين في الفرن على درجة حرارة 95 درجة مئوية ليلة وضحاها. </li></ol> المهم : العلاج البلازما والخبز بين عشية وضحاها ضرورية لتعزيز قوة الترابط. F. مراقب تشكيل Nanocomplexes الحمض النووي في الجهاز ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء قناة ميكروفلويديك بالماء (لضمان عدم وجود فقاعات داخل القناة ميكروفلويديك) ، قبل تحميل الكواشف لضمان التدفق السلس أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل QD الحمض النووي المسمى والمسمى Cy5 حلول الشيتوزان الى قسمين المحاقن الزجاجية الفردية ، من خلال الأنبوب هو موضح في الفيديو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب مع اثنين من منافذ الأجهزة ميكروفلويديك. الحرص على عدم إدخال أي الهواء خلال هذه العملية. ضبط معدل التدفق في 20nL/min (الدكتوراه - 2000 ضخ حقنة ، Holliston ، MA) ، في ظل ظروف التدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من microchannels تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تدفق غير مستقرة (~ 15 إلى 20 دقيقة) ، QD بوساطة الحنق ينبغي مراعاتها في مركز للقناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور مضان (CCD المبردة ، Qimaging ، BC ، كندا) في مواقع مختلفة على طول القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الصور مع مضان ImageJ وOriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. QD - الحنق يوفر مؤشرا الحساسة من ظهور Nanocomplexes DNA التجميع الذاتي <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن الكم نقطة بوساطة الطاقة الرنين مضان نقل (QD - الحنق) تقديم مؤشرات كمية وحساسة للغاية للاستقرار في أي من البيئات polyplex خارج أو داخل الخلوية ، مما يسمح للكشف لا لبس فيه من ظهور التفاعلات بين الحمض النووي والجينات الحاملة. وقد تم اختيار الزوج الحنق ، و605QD Cy5 ، على أساس تحقيق أقصى قدر من التداخل الطيفي بين الجهات المانحة ومتقبل وتقليل احتمال عبر الحديث. لهذا الزوج ، والمسافة هي فورستر 69.4Å 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجميع الذاتي للnanocomplexes DNA - QD الحنق. وكان المسمى DNA البلازميد أنيوني (pDNA) والناقل الجينات الموجبة مع QD (الطاقة المانحة) وCy5 (الطاقة متقبل) ، على التوالي. وتم تشكيل QD - الحنق nanocomplexes تقوصر المعقدة من خلال كهرباء. على الإثارة في 488 نانومتر ، وأشار QD - الحنق بوساطة Cy5 الانبعاثات تشكيل nanocomplex المدمجة وسليمة. ويمكن حساب الوقت الإقامة (ر R) وفقا للمسافة (خ) الذي يقيس تيارات من حيث يلتقي الاثنان في موقف رد الفعل قيد التحقيق ، وسرعة تدفق يعني (V). نظرا لطبيعة التدفق الصفحي ، والخلط يستغرق سوى مكان في واجهة (وسط كل صورة) ، مما يسمح الحساب الدقيق للنقل الجماعي بوصفها وظيفة من R ر. ويمكن تعديل القرار الزماني من خلال تغيير applieد معدلات التدفق. (الشكل) الحنق بوساطة وحظ إشارة مباشرة في الواجهة عندما التقى الاثنان تيارات ، مشيرا إلى أن الربط كان سريعا ، والتي تحدث في غضون بضع ميلي ثانية وفقا لمعدلات تدفق التطبيقية. بار النطاق : 100μm. </li></ol>

<ol>
	<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li><li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li><li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor.">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأهمية في عملنا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه هي أول محاولة لرصد البوليمرية DNA nanocomplex التجميع الذاتي حركية في الوقت الحقيقي (ملي القرار) من خلال ردود QD - الحنق داخل رقاقة ميكروفلويديك بسيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> QD بوساطة الحنق يوفر مؤشرا حساسة للغاية والكمي لبدء التفاعلات الجزيئية وخلال عملية التجميع الذاتي ، في حين يقدم على microfluidics المكروية التي تسيطر عليها بشكل جيد لتحليل عملية مكانيا خلال توليف الحمض النووي nanocomplex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكامل على microfluidics وnanophotonics يوحي نهج جديد ومثير للاهتمام في التحقيق في أي نوع من التفاعلات complexation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن ينجم عن ذلك الحنق nanocomplexes QD - DNA البوليمرية تطبيقها بيسر لإقامة هيكل وظيفة العلاقات. 1،2 </li></ol></li></ul>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem</td>
<td>SU-8 2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>pEGFP-C1</td>
<td>4.9 kb, MW = 3.3 x 106</td>
</tr>
<tr>
<td>LabelIT Biotin Labeling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mirus Bio LLC</td>
<td>MIR 3400</td>
<td>Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin 605QD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Qdot&reg; 605 ITK&trade; Streptavidin Conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5-NHS Ester</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>PA15101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chitosan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vanson</td>
<td>390 kDa </td>
<td>83.5% deacetylated</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545C</td>
<td>No. 1; Size: 40 x 22mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastight Glass Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>TLL series</td>
<td>50&mu;L to 500&mu;L depending on sample volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Tygon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>0.02 ID, 100ft</td>
<td>Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft</td>
</tr>
<tr>
<td>Connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>HTX-23R</td>
<td>Customized in length of 0.750"</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qimaging</td>
<td>Intensified Retiga Cooled</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX-51</td>
<td>100W mercury arc lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>v1.36b</td>
<td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td>
</tr>
<tr>
<td>Origin Pro8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OriginLab</td>
<td>Student Version</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>475AF40</td>
<td>Excitation filter in both channels</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595AF60</td>
<td>Emission filter in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>670DF40</td>
<td>Emission filter in QD-FRET channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>500 DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in QD-FRET channel</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining qd-fret and microfluidics to monitor dna nanocomplex self-assembly in real-time

التقدم في علم الجينوم الاستمرار في تطوير وقود من العلاجات التي يمكن أن تستهدف المرضية على المستوى الخلوي والجزيئي. وظيفية عادة داخل الخلية ، حمض النووي القائم على العلاجات تتطلب كفاءة نظام توصيل الخلايا. أحد النهج المعتمد على نطاق واسع هو الحمض النووي معقد مع الجين الناقل للكهرباء من خلال النموذج nanocomplexes التجميع الذاتي ، وتسهيل امتصاص الخلوية من الحمض النووي في حين حمايته من التدهور. التحدي يكمن في تصميم الرشيد للناقلات الجينات كفاءة ، سابق لأوانه منذ تفكك أو ملزمة مستقرة بشكل مفرط سيكون ضارا لامتصاص الخلوية والنجاعة العلاجية. وأظهرت Nanocomplexes توليفها من قبل معظم خلط مجموعة متنوعة من السلوك داخل الخلايا التفريغ والاتجار بها ، والتي كانت تعزى إلى عدم التجانس في الحجم واستقرار nanocomplexes. عدم التجانس هذا يعوق تقييم دقيق لحركية التجميع الذاتي ، ويضيف إلى صعوبة في ربط خصائصها الفيزيائية إلى الكفاءة أو ترنسفكأيشن bioactivities. نقدم تقارب الرواية من nanophotonics (أي QD - الحنق) و microfluidics لتوصيف حركية في الوقت الحقيقي من nanocomplex التجميع الذاتي تحت التدفق الصفحي. QD - الحنق يوفر مؤشرا حساسة للغاية من ظهور التفاعلات الجزيئية ، وقياس الكمي في جميع مراحل عملية التجميع ، في حين يقدم على microfluidics المكروية التي تسيطر عليها بشكل جيد لتحليل عملية مكانيا مع القرار الزماني عالية (~ مللي ثانية). لنظام نموذجي للnanocomplexes البوليمرية ، تم القبض على مرحلتين متميزتين في عملية التجميع الذاتي من قبل هذه المنصة التحليلية. والجانب الحركي لعملية التجميع الذاتي التي تم الحصول عليها في microscale تكون ذات قيمة خاصة بالنسبة للmicroreactor المستندة ردود الفعل التي هي ذات الصلة لكثير من التطبيقات المتناهية الصغر والنانوية الحجم. كذلك ، قد تكون مخصصة nanocomplexes من خلال التصميم الجيد للأجهزة microfludic ، وما ينجم عن ذلك الحنق QD - DNA يمكن nanocomplexes البوليمرية تطبيقها بيسر لإقامة هيكل وظيفة العلاقات.

Watch this Scientific Journal Video about Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time at JoVE.com

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

نقدم الرواية والتكامل قوية من nanophotonics (QD - الحنق) و microfluidics للتحقيق في تشكيل polyplexes polyelectrolyte ، والتي من المتوقع أن يوفر سيطرة أفضل وتوليف polyplexes موحدة وقابلة للحمض النووي في المستقبل على أساس المداواة.

الجمع بين QD - الحنق و microfluidics الحمض النووي لرصد Nanocomplex الذاتي الجمعية في الوقت الحقيقي

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  Johns Hopkins University. نقدم الرواية والتكامل قوية من nanophotonics (QD - الحنق) و microfluidics للتحقيق في تشكيل polyplexes polyelectrolyte ، والتي من المتوقع أن يوفر سيطرة أفضل وتوليف polyplexes موحدة وقابلة للحمض النووي في المستقبل على أساس المداواة.

Video: Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

الكيميائي استجابة الكائنات المجهرية البحرية الصغيرة الحجم لطبقات غذائية

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

دراسات لاستخدام الانجذاب الكيميائي الجرثومي على microfluidics -- مقابلة

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

تطبيق على microfluidics لالكهربية

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

الكشف عن وتوصيف البروتين التجميع الذاتي في الجسم الحي عن طريق قياس التدفق

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...