ברצוננו להודות לד&quot;ר עשיר רוג&#39;רס לקבלת סיוע טכני עם מנתח ספקטרומטריית מסה ודיונים מועיל, בני הזוג. רוב מוריץ, ג&#39;ף Ranish ו חמיד Mirzai לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי המרכז הלאומי לבריאות של אקסלנס.

תא צמיחה התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבה אחת של תאים BY4742Δarg4Δlys1 לילה 100 מ&quot;ל מדיה עשירה כדי OD 600 של זרע אז 1.0 לשתי התרבויות 1 ליטר של מדיום שמרים מינימלי (0.17% חנקן שמרים ללא בסיס אמוניום סולפט או חומצות אמינו, אמוניום סולפט 0.5%) המכיל מלא של חומצות אמינו, בתוספת L / 20 מ&quot;ג של ארגנין נורמלי isotopically או כבד (13 ג 6 15 N 4; Isotec) ו ליזין (13 ג 6 15 N 2; Isotec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים גדלו במשך 18 שעות, כדי OD 600 של 1.8. זה קריטי, כי התאים לעבור לפחות 9 דורות כדי להשיג שילוב מלא של איזוטופים שכותרתו. המדגם היה אור pelleted, שטפתי עם מים סטריליים, reseeded לתוך oleate המכיל בינוני (רגיל isotopically ארגינין וליזין, Oleate 0.2% (כימיקלים סיגמא) ו 0.5% Tween 40 (Sigma כימיקלים)) ועורר עוד 85 דקות. זה מניב אור isotopically, ביחס ארגינין ליזין, oleate-מגורה מדגם כבד isotopically גלוקוז מבוגר מדגם התייחסות. </li></ol> תמוגה התא, בידוד ההיפוך חלוקה של פפטידים <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול בקבוק צנטריפוגות. קציר דגימות על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות. הסר מדיה לשאוב נוזל עודף. לשקול גלולה ובקבוק (יהיו בדרך כלל התשואות בין 1-2 גרם) ואז להקפיא פלאש חנקן נוזלי. הוסף נפח שווה למשקל של גלולה חיץ &quot;טחינה&quot; של כדורי מוקפאת בחנקן נוזלי (בופר פוספט (PBS, Gibco), 10% גליצרול, מעכבי פרוטאז (מעכבי פרוטאז SigmaFAST טבליות, Sigma) ולעצור מעכבי phosphatase (Thermo Scientific )). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את כלי שחיקה של חנקן נוזלי. המתן עד חנקן נוזלי חדל רותחים. מעבירים את גלולה לכלי השיט שחיקה, עם מיסבים קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים בסל&quot;ד 600 עם מחזור 1 דקות 20 שניות עם היפוך כיוון במשך 3 דקות. Refreeze כלי שחיקה של חנקן נוזלי. חזור 4 פעמים יותר במשך 15 דקות זמן שחיקה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את grindate קפוא לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל קרח פלקון מקום יבש. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 10ml של 8M אוריאה, אמוניום ביקרבונט 0.1M, 0.1M טריס pH 8.6. הוסף 3 כרכים של למאגר אוריאה עד נפח של 1 grindate הקפוא (עבור 3mls דוגמה למאגר אוריאה להוסיף 1 גרם גלולה עם 1 מ&quot;ל של PBS חיץ). מיד sonicate את התערובת עם sonicator בדיקה קצה (2-10 פעימות השני). שמרו על קצה בתחתית הצינור כדי למנוע הקצפה של הפתרון. Grindate צריך מיד להיכנס פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את lysate ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינורות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך aliquot טרי טריס 0.5m [2-carboxyethyl] phosphine (TCEP). הוסף מדגם בשעה 1:100 ריכוז סופי 5mm. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקילציה של cysteines מופחת. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. הפוך aliquot טרי iodoacetamide 1M. שמור בחושך (אנחנו לעטוף את צינור בנייר כסף). הוסף בריכוז הסופי של 20mm. דגירה בחושך 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את iodoacetamide עם DTT 20mm ממלאי 1M בטמפרטורת החדר 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את החלבונים עם ברדפורד סטנדרטי או BCA assay (לא תיאר). קח דוגמה לניתוח על ידי SDS להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת שילוב של איזוטופים כבדים, שימוש 100 μl של lysate מופחת alkylated. לדלל 1:04 עם DH 2 O, sonicate ולהוסיף טריפסין על חלבון 50:1 כדי טריפסין. תקציר עבור מינימום של 4 שעות, מדגם יבש למטה במהירות VAC ו desalt אז עם עמודות Ultramicrospin C18 (קבוצת קן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור מימה עם μl 100 של אצטוניטריל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עם TFA 200 μl 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מדגם יבש TFA 200 μl 0.1%. עומס על עמוד. צנטריפוגה XG ב 200 ~ או את מהירות מינימלית הדרושה לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם TFA 200 μl 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם פעמיים עם אצטוניטריל 50 60% μl, TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם יבש במהירות VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם Resuspend בחומצה פורמית μl 20 0.1%. הפעלה 2 μl על ספקטרומטר מסה. בדוק שילוב של כבד isotopically ארגינין וליזין על ידי שינוי דלתון 10 ו -8 הספקטרום m / z בהתאמה. שילוב של חומצה אמינית כל צריך להיות בין 96-98%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות שוות ערך (מ&quot;ג של חלבונים) של דגימות כבד isotopically ואור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מדגם 01:04 מתנול עם 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טריפסין ב 1:200. דגירה לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק העיכול כי הלכה השלמת ידי SDS. הפעלה 2 ו - 4 μl של המדגם predigestion ו 8ד 16 μl של טריפסין הודעה לעכל. דמיינו ידי מכתים Coomassie כי עיכול תושלם. אם זה לא שלם, sonicate המדגם עם בקצרה קצה החללית sonicator ולעכל שוב עם טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש המדגם למטה במהירות VAC. כאשר מוסיפים יבש 200 μl של מסונן DH 2 O ו מערבולת עד גלולה נכנס הפתרון. מדגם יבש למטה במהירות VAC. Resuspend שוב עם DH 2 O. יבש מדגם שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בחומצה Trifluoracetic 0.1% (TFA; סיגמא). בדוק כי ה-pH הוא בסביבות 3 באמצעות רצועות pH. אם יש צורך להפוך לחומצה TFA עם 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את כל המשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt דגימות על עמודה ספטמבר-Pak ווטרס Vac מ&quot;ג 500 C18. אל תעמיס יותר מדי עמודות אלה. הסכום המקסימלי הוא 5 מ&quot;ג אבל עדיף להעמיס קצת פחות. מחלקים את המדגם בין עמודות מרובות במידת הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור מימה עם אצטוניטריל 5 מ&quot;ל ב -100%. צנטריפוגה XG ב 200 ~ או את מהירות מינימלית הדרושה לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן טור עם TFA 0.1% 5 מ&quot;ל. טען המדגם. איסוף זרימה לטעון שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם TFA 5 מ&quot;ל 0.1%. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם אצטוניטריל 2ml 60% TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם יבש למטה במהירות VAC. </li></ol></li></ol> ההיפוך חלוקה בידוד פפטיד של Phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים הם מופרדים על עמודה HILIC. אנו משתמשים TOSOH טפו-Gel אמיד-80 4.6 מ&quot;מ x 25 ס&quot;מ עמודה אנליטית עם עמודה השומר. קחי את הזמן שלך עם הצעד הזה, להפעיל את העמודה עבור 2 שעות 90% בטווח ולאחר מכן שני מילויים ריק לפני טעינת המדגם שלך. העומס המרבי על עמודה בגודל כזה נחשב סביב XX, אנחנו בדרך כלל לא להעמיס יותר מ 5 מ&quot;ג לרוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכך - 98% ACN/0.1% TFA מרכך ב - 2% ACN/0.1% TFA טען% 90 מעל 20 &quot;, 90% עד 85% מעל 5&quot;, 85% ל -60% מעל גיל 40 &quot;, 60% ל -0% במשך 5 &#39;, 0% עד 90% על 5 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצב הזרימה הוא 1ml/min ושברים נאספו ב 2 מרווחי דקות החל 85% עד 60% שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב שברים כדי לצמצם את מספר שברים עד 10. שברים מוגברת צפויה להניב כיסוי גדול יותר של phosphoproteome. </li></ol> העשרה של phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphopeptides מועשרים באמצעות PHOS בחירה ג&#39;ל ברזל זיקה. אנו aliquot שרף iMac שלנו כדי למנוע הקפאת חזר הפשרה. הפוך את 50 ה-MLS של חומצה אצטית 250 מ&quot;מ, 30% עומס פתרון ACN. תביאו את ה-pH ל -2.7 עם HCl. Resuspend כדורי ב μl 500 של פתרון העומס. בדוק pH, להתאים עם HCl או NaOH במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 Prewash μl של חרוזים iMac בעמודה המתאימה. אנו משתמשים עמודות ספין Molbiotec. הוסף 15 μl של slurry של 50% (ג&#39;ל לטעון פתרון) לשבר כל אחד, דגירה דגימות עבור 30 &quot;עם סיום סיבוב על הקצה. שמור את זרימת לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 3 פעמים עם פתרון לטעון פעם אחת עם 500 μl מסוננים DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים Elute עם 2-3 דק &#39;עם 400 μl של 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8.4) חיץ. העברה בקבוקון זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך לחומצה pH 3 עם חומצה פורמית μl 5 100%, הקפאה בחנקן נוזלי פלאש, מדגם יבשים למטה במהירות VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphopeptides Resuspend ב μl 200 TFA של 0.1% ו - C18 נקי כמתואר לעיל. יבש את דגימות eluted במהירות VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פפטידים ב 20 μl של חומצה פורמית 0.1%. שימוש 2 μl לכל ניתוח ספקטרומטר מסה או לפי הצורך. </li></ol> הערות במשך רוב פרוטוקול זה תהיה עבודה &quot;עיוור&quot;. תמוגה התא יכול להיות פיקוח על ידי סופג המערבי מבחני ברדפורד או BCA, ואת מערכת העיכול טריפסין ניתן להעריך בקלות. העמודה HILIC יהיה נתן שמץ דומה לזה, או נתפס על ידי אחרים [1, 2] בהתאם מכונת כרומטוגרפיה נוזלית המשמשת. דוגמאות מנוטרים על ידי ספקטרומטריית מסה, מבחן דגימות שלך במחשבים זולים כגון LCQs או MALDIs לפני שהולכים מנתח העלות הגבוהה על דיוק מסה גבוהה, מכונת ברזולוציה גבוהה. לבסוף, אם אתה ייבוש מטה מדגם עם חומצה בו, להשתמש בזכוכית.

<ol>
	<li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis.">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li><li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection.">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li><li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway.">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li><li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast.">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li><li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCX/IMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry.">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li><li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques.">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li><li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li><li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS/MS+and+titanium+oxide+precolumns.">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li><li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry.">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li><li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation.">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li><li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+isolation+of+distinct,+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome.">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li></ol>

שיטה זו תניב העשרה של phosphopeptides כי ניתן לנתח באופן כמותי. מספר פרמטרים ניתן לשנות בפרוטוקול זה, אבל ההיבט החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשמר זירחון שלך. הכנת תאים כימות ניתן להשיג במספר דרכים שונות, למשל אם אתה לא יכול תווית התאים שלך, תגי vivo כגון ICAT [3] או ITRAC [4] יכול ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isotec&trade; L-Arginine-13C6,15N4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>608033</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isotec&trade; L-Lysine-15N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>609021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GIBCO&#x2122; Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>70011044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>78420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch PM100 Ball Mill Grinder </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>20.540.0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>01.462.0148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultramicrospin C18 column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Nest Group</td>
<td>SUM SS10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT043395</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TOSOH BioSciences</td>
<td>13071</td>
<td>This is the HILIC chromatographic column.</td>
</tr>
<tr>
<td>Guard column 4.6 mm ID x1 cm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TOSOH BioSciences</td>
<td>19021</td>
<td>We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.</td>
</tr>
<tr>
<td>PHOS-Select&trade; Iron Affinity Gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P9740</td>
<td>This is the IMAC resin. Aliquot and store.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantitative phosphoproteomics in fatty acid stimulated saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה גירוי, עם oleate חומצת שומן, כבד isotopically ואור תאים ס cerevisiae. תאים הם הקרקע באמצעות הליך cryolysis במטחנת כדור הטחנה ואת grindate וכתוצאה מכך הביא לתוך פתרון על ידי solubilization אוריאה. הליך זה מאפשר תמוגה של התאים במצב פעיל מטבולית, שימור זירחון ומניעת ארגון מחדש של phosphoproteome במהלך תמוגה התא. בעקבות הירידה, אלקילציה, עיכול טריפסין של החלבונים, הן דגימות desalted על עמודות C18 ואת המורכבות מדגם מופחת על ידי חלוקה באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי (HILIC). עמודות HILIC מעדיפים לשמור על מולקולות הידרופיליות אשר הוא גם מתאים phosphoproteomics. פפטידים phosphorylated נוטים elute בהמשך הפרופיל chromatographic מאשר עמיתיהם הלא פוספורילציה. לאחר חלוקה, phosphopeptides מועשרים באמצעות כרומטוגרפיה מתכת משותקת, אשר מסתמכת על תשלום מבוסס זיקות להעשרת phosphopeptide. בתום הליך זה דגימות מוכנים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

10.0K Views.  Institute for Systems Biology. תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Video: Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every eukaryotic genome. This process is an important mechanism for generating diversity between and within organisms1-3. The human genome consists of approximately 40% repetitive sequence of retrotransposon origin, including a variety of LINEs and SINEs4. Exchange events between these repetitive elements can lead to genome rearrangements, including translocations, that can disrupt gene dosage and expression that can result in autoimmune and cardiovascular diseases5, as well as cancer in humans6-9.
Exchange between repetitive elements occurs in a variety of ways. Exchange between sequences that share perfect (or near-perfect) homology occurs by a process called homologous recombination (HR). By contrast, non-homologous end joining (NHEJ) uses little-or-no sequence homology for exchange10,11. The primary purpose of HR, in mitotic cells, is to repair double-strand breaks (DSBs) generated endogenously by aberrant DNA replication and oxidative lesions, or by exposure to ionizing radiation (IR), and other exogenous DNA damaging agents. 
In the assay described here, DSBs are simultaneously created bordering recombination substrates at two different chromosomal loci in diploid cells by a galactose-inducible HO-endonuclease (Figure 1). The repair of the broken chromosomes generates chromosomal translocations by single strand annealing (SSA), a process where homologous sequences adjacent to the chromosome ends are covalently joined subsequent to annealing. One of the substrates, his3-&Delta;3', contains a 3' truncated HIS3 allele and is located on one copy of chromosome XV at the native HIS3 locus. The second substrate, his3-&Delta;5', is located at the LEU2 locus on one copy of chromosome III, and contains a 5' truncated HIS3 allele. Both substrates are flanked by a HO endonuclease recognition site that can be targeted for incision by HO-endonuclease. HO endonuclease recognition sites native to the MAT locus, on both copies of chromosome III, have been deleted in all strains. This prevents interaction between the recombination substrates and other broken chromosome ends from interfering in the assay. The KAN-MX-marked galactose-inducible HO endonuclease expression cassette is inserted at the TRP1 locus on chromosome IV. The substrates share 311 bp or 60 bp of the HIS3 coding sequence that can be used by the HR machinery for repair by SSA. Cells that use these substrates to repair broken chromosomes by HR form an intact HIS3 allele and a tXV::III chromosomal translocation that can be selected for by the ability to grow on medium lacking histidine (Figure 2A). Translocation frequency by HR is calculated by dividing the number of histidine prototrophic colonies that arise on selective medium by the total number of viable cells that arise after plating appropriate dilutions onto non-selective medium (Figure 2B). A variety of DNA repair mutants have been used to study the genetic control of translocation formation by SSA using this system12-14.

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

The HO-stimulated translocation assay monitors single-strand annealing following the creation of DNA double-strand breaks at multiple loci in diploid Saccharomyces cerevisiae. This mechanism may model genome rearrangements in somatic cells of higher eukaryotes following exposure to high doses of ionizing radiation.

Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).