מחקר זה נתמך על ידי מענקים לGM046406 (DB) ועל ידי המכון הלאומי למדעי רפואה כללי מרכז לביולוגיה כמותית (GM071508). RSM מכיר במימון מNSF בוגר מחקר המלגה. MNM נתמך על ידי מלגת לואיס-סיגלר. ברצוננו להודות לחברים במעבדה בוטשטיין לדיונים מועילים ולשעבר חברי אלגרה פטי וניקולאי Slavov על תרומתם לפרויקט מחזור חילוף חומרים. אנו מודים לדניאל וZenklusen רוברט זינגר להשגתנו התחילה עם שיטת FISH.

איורים 1 ו -2 הם שרטוטים של הפרוצדורות הדגים וצנרת ניתוח תמונה המשמשת לכימות תמונות דגים. 1. פתרונות כדי להכין * פתרונות להלן הם לשימוש עם בדיקות זינגר. אם באמצעות בדיקות Stellaris, להחליף &quot;לפוראמיד 40%&quot; עם &quot;לפוראמיד 10%&quot; בשניהם חיץ הכלאה והצפה לשטוף. שינויים נוספים במאגר ההכלאה כאשר באמצעות בדיקות Stellaris הם (1) סולפט 1 גרם Dextran להוסיף ו( 2) לא כולל 10 מ&quot;ג ssDNA. חיץ B 8 מ&quot;ל 1 M KH 2 PO 4 41.5 מ&quot;ל 1M K 2 HPO 4 109.3 גרם סורביטול מאגר spheroplasting 890 ב &#39;מאגר μl VRC μl 100 10 μl 25,000 U / מיליליטר Lyticase 2 β-mercaptoethanol μl &lt;מאגר הכלאה&gt; חזק (נפח מ&quot;ל, סופי 10) 10 מ&quot;ג א &#39; tRNA coli 10 מ&quot;ג ssDNA * 100 מניות μl 200 מ&quot;מ VRC 40 μl של 50 מ&quot;ג / מיליליטר BSA מיליליטר 20X SSC 1 4 40% לפוראמיד מ&quot;ל * המים nuclease חינם (לנפח סופי 10 מ&quot;ל) 1 סולפט * Dextran גרם * מאגר ההכלאה נשמרות ב0.5 aliquots מ&quot;ל ב -20 ° C לנוחות. שטוף חוצץ (מ&quot;ל, נפח סופי 50) 5 מ&quot;ל 20X SSC % 20 מ&quot;ל 40 לפוראמיד * המים nuclease חינם (לנפח סופי 50 מ&quot;ל) תיוג הצפת 1.06 נתרן קרבונט גרם מים 100 מ&quot;ל DEPC ה-pH 9 2. בדיקה תיוג (בדיקות זינגר בלבד) אנו להשיג בדיקות אלה בסינתזה בתוך הבית באמצעות מנגנון סינתזת oligonucleotide ABI. Typicהברית, 4-5 ~ 50 נ&quot;ב oligonucleotides מסונתז שהם הומולוגיים לגן של עניין, החלפת thymidine אמין allyl במשך כמה thymidines מרווחים לפחות 8, רצוי 10 + נ&quot;ב זה מזה. בגלל רגישותם לאוזון, אנו עובדים במתקן ללא אוזון בעת ​​שימוש בצבעי CY. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ~ 5 בדיקות וresuspend במי μl 100 - ריכוזים לבדוק על Nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי כמה בדיקות / גנים, לשלב כולל של 10 oligonucleotides מיקרוגרם / גן (למשל, אם יש 5 / בדיקות גנטיות, אז רוצים 2 מיקרוגרם / חללית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעמודות QIAquick לטהר בדיקות על פי פרוטוקול ערכת הסרת נוקלאוטיד QIAquick. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 כרכי המאגר PN לסך נפח של בדיקות ותמהיל משולבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מדגם לעמודת QIAquick - אם נפח כולל הוא יותר מ 750 μl, ספין למטה פעמיים באמצעות מחצית מנפח בכל ספין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת לעמוד במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 דקות ב 6000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 750 PE המאגר μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת1 דקות ב 6000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך לזרום ועמודה מחדש ספין 1 דקות ב13,000 סל&quot;ד לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור QIAquick מקום בצינור microcentrifuge החדש וה-DNA elute עם 50 H 2 O μl - ודא H-pH O 2 הוא בתוך 7.0 ו -8.5 וממוקם ישירות על הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת לעמוד במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 דקות ב13,000 סל&quot;ד elute ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize DNA ב 45 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב10 חיץ תיוג μl ולהוסיף לצינור של צבע בלי לגעת בצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם חיץ תיוג μl 10 אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ומסובב את הצינור של צבע וה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את הצינורות בנייר אלומיניום ולשמור בחושך בRT O / N לתייג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול ערכת הסרת נוקלאוטיד QIAquick. להופיע עם שני הבדלים: - הוספה 200 חיץ PN μl לבדיקות ולשים את בדיקות שכותרתו דרך 2x עמודות. - בצע 3 שוטף עם החיץ PE כדי לשטוף את כל צבע פנוי לפני elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> After elution להשיג באמצעות ריכוז NanoDrop. יעילות התיוג היא בדרך כלל ~ 0.25 pmol / ng של גדילי דנ&quot;א יחיד. </li></ol> 3. הכנת coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מקום בשקופיות בפלזמה-להתקשט ואקום קאמרי <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">(http://www.plasmapreen.com/)</a> (הקרוב יותר למרכז טוב יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים תא ואקום במיקרוגל ולוודא שהוא אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו משאבה הראשונה לאחר מכן הפעל את הוואקום רק פעם אחת משאבה הוא התחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוגל, ולהפסיק 5 שניות לאחר שהפלזמה היא גלויה לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הוואקום ואז לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את תא ואקום ולהסיר coverslips עם מלקחיים (אלה שנפלו יש לנקות שוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום Coverslips צד ניקה ב12 גם צלחות. </li></ol> 4. נוהל קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול שמרים לOD 600 של כ 0.1-0.2 בתקשורת מינימאלית. 10 מ&quot;ל של תאים מניב מספיק עבורr ~ 10 הכלאות נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 37% פורמלדהיד נפח 1/10 באופן ישיר לתקשורת הצמיחה (10 מ&quot;ל של התרבות + 37% פורמלדהיד 1 מ&quot;ל) ולתת לשבת במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x עם B 1 מ&quot;ל קר כקרח הצפת בצינור microcentrifuge (יכול להסתובב ב13,000 סל&quot;ד דקות 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ spheroplasting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בדקו כל כמה תאים תחת מיקרוסקופ דקות עד שרוב התאים הם שחורים (כלומר, לא בשלב בהיר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x B עם המאגר הקר כקרח, ספינינג במהירות נמוכה (~ 3,500 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 70% EtOH, resuspend בעדינות ולהשאיר למשך הלילה ב 4 ° C (ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל ב -20 ° C). </li></ol> 5. נוהל הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ההכלאה: עד 100 μl של חיץ הכלאה, להוסיף 1-3 μl של חללית, ואז מערבולת ו צנטריפוגות. בדיקות זינגר להשתמש 8-10 כולל ng לכל סט בדיקה (כלומר לכל גן). יש לנו צילמו עד 3 גנים בו זמנית עם 3 אונטערשיידתווית בדיקה שונה שממפה קובעת. </li></ol> הקפד לחמם את פתרון ההכלאה לטמפרטורת חדר לפני פתיחתו. לבדיקות Stellaris, מומלץ להתחיל 4 תגובות הכלאה נפרדות על ידי הוספת μl 1 כל אחד מ1:10, 1:20, 1:50 ו1:100 דילולים של בדיקות עובדים כדי לראות איזה מהם הוא אופטימלי. דילולים עבודה של בדיקות Stellaris ערוכים חיץ הכלאה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (את כל הצעדים הבאים; 3,500 סל&quot;ד; 5 דקות) את התאים הקבועים (למשל 200 μl) ולשאוב ממנו את האתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend עדינות בחיץ 1 מיליליטר שטיפה המכיל את אותו אחוז לפוראמיד כחיץ ההכלאה. בואו לעמוד במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם וחיץ לשטוף לשאוב, ואז מוסיף פתרון הכלאה. דגירה בחושך עם רעד עדין, O / N ב 37 ° C. </li></ol> הערה: ההליך הבא הוא עבור יישום תאים / הדמיה על coverslips. עבור washing / תאי הדמיה בצלחות 96-כן, כולל פתרון חלופי תגובתי חמצן מיני נבלות לראות <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, או מראש, נקי (ראה הליך) ולטפל בתלושים לכסות עם 150 0.01% פולי-L-ליזין μl למשך 5 דקות. לשאוב, לתת להתייבש, לשטוף 3x עם DH 2 O ולתת להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, להוסיף 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף לדוגמה, resuspend בעדינות, צנטריפוגות ולשאוב, אז resuspend ב 1 מ&quot;ל נוסף של חיץ לשטוף ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 2X SSC + 0.1% דקות טריטון X-100 ב RT 15 על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח הרכבה בינונית ממקפיא כדי לאפשר לו לבוא לRT לפני ההרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1X SSC בדקות RT 15 על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל DAPI לתוך PBS (0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סופי) ותאי resuspend ב 150 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מקום אל ניקה / פולי-lys-גידתלושי טד לכסות בצלחת 12 היטב, לפחות 30 דקות באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור פתרון (אולי אתה מניח אותו על פיסת כיסוי חילוף כגיבוי) ולשטוף 3x עם 1 מיליליטר 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 3 μl של להאריך הרכבה בינונית זהב לשקופית (Invitrogen P36934). לעשות את זה אחת בכל פעם, אם יש לך תלושי לכסות מרובים כדי למנוע התייבשות של הרכבה בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אתנול ~ 0.5 מ&quot;ל לcoverslip בצלחת 12 היטב, להסיר להחליק את המכסה והאוויר היבש בעת החזקה עם פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לכסות להחליק תא בצד למטה על הרכבה בינונית ולתת להקשיח כמה שעות או O / N בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הקצוות עם לק ולהמשיך להדמיה. </li></ol> 6. הדמיה של תאים עם סקירה כללית מיקרוסקופ הפוכה אולימפוס IX-81 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת תמונה אנו מנצלים תוכנה (אינטליגנטי-imaging.com) Slidebook ו,, מטרת שמן 1.45 NA TIRFM 100X. לGFP סדרתי, DAPI, Cy3, Cy3.5 וCy5 הדמיה: מערכות סינון Chroma (ראה חומרים כימיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במסנן DAPIכדי למצוא ולמקד את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את זה כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח Z-מחסנית של תמונות סביב נקודת ההתייחסות שבו המרחק הכולל הוא 5 מיקרומטר עם גודל 0.2 מיקרומטר (25 מטוסים). חזור על פעולה עבור כל אחד מערוצי צבע (קבועה בכל בדיקה, כלומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא כמו TIFF 16 ביט לניתוח תמונה. </li></ol> 7. סקירת ניתוח תמונה (בדיקות זינגר) להלן אנו מספקים קווי המתאר של שיטות חישוביות אנו משתמשים לניתוח תמונות דגים בMATLAB. פונקציות MATLAB הרלוונטיות שמשו הם בסוגריים בצד ימין. האלגוריתמים והספים מכוונים כעת לנתונים מבדיקות בסגנון זינגר. באמצעות בדיקות בסגנון Stellaris ידרוש קצת הסתגלות, במיוחד לסינון השלב האחרון (7.8). זיהוי תא 15 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נפרדים מרקע באמצעות עולמי על סף DAPI תמונות 16 [graythresh]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הגרעינים באמצעות פונקצית מקסימום מורחבת [imextendedmax]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מגזר באמצעות גרעינים כזרעים לאלגוריתם פרשת מים [קו פרשת מים]. </li></ol> מצא את נקודות בכל אחד מערוצי הקרינה <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שינוי tophat לנרמל את הרקע ולשפר את יחס אות לרעש [bwmorph]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את מקסימום כדי לזהות את השכבה בפוקוס (במטוס-z) על כל מקום [imregionalmax]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן כתמים פוטנציאליים תוך שימוש במודל מתאים ליניארי לגרדיאנט רדיאלי. </li></ol> עוצמת כתם מדוד ואותות בדיקה בודדות לעומת מרובים סינון <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fit פרופיל Gaussian 2D למקום בשכבה בפוקוס זוהתה בעבר ובעוצמת אומדן 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את הנקודות תורפה בשימוש בסף (המבוסס על היסטוגרמה). לבדיקות מסוג הזמר הזה הוא חשוב, אבל הוא פחות מכך לבדיקות Stellaris. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור נקודות בכל אחד מתאים. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

נכון להיום, דגים כבר שיטת תפוקה נמוכה בעיקר. השימוש בCy3, Cy3.5, וCy5 צבעים מגביל את מספר גנים אחד יכול לחקור בתאים בודדים עד שלוש בכל פעם. כמה בדיקות נוספות שפותחו (Stellaris), אך במספר הבדיקות להבחין עדיין ברוב שבע. כדי לעקוף מגבלה זו, אסטרטגיות תיוג קומבינטורית באמצעות fluorophores מרובים שמשו כדי ליצור ברקודים למיני mRNA שונים 19,20. לאחרונה, לובק וקאי משמשים Barcoding האופטי ולכמת רפאים 32 מינים שונים בו זמנית עם דגים בתאי שמרים רווקים בן 19. מגבלה אחת של גישה קומבינטורית האחרונה זו היא שהיא דורשת שימוש במיקרוסקופ סופר רזולוציה. הניתוח הדרוש כדי להבחין בין בדיקות המינימרקטים הוא גם די מורכב. מצאנו כי Cy3 וCy3.5 עדיף על Cy5 לניסויי דגים. אחת המגבלות של הצבע Cy5 הוא הרגישות שלולphotobleaching. עם זאת, Stellaris פיתחה לאחרונה Cy5 ריאנטים המפורסמים כעמיד יותר בפני photobleaching, ועשוי להקל על הבעיה טכנית הזאת. כמו כן, ראוי לציין כי דגים היא שיטה יקרה ליישום והבדיקות שזינגר והן Stellaris בדרך כלל עולות $ 700 - $ 1000 לכל סט בדיקה, אם כי מחירים עבור בדיקות זמינות מסחרי צריכים להקטין בעתיד. חוסך של חומרים כימיים ותיוג יעיל מביא בדיקות זינגר עד לטווח נמוך יותר במחיר. אחד האתגרים הטכניים העיקריים היא ההפרדה של נקודות בודדות לעומת בדיקה מרובות, אשר דורשת יישום של אלגוריתמים מתוחכמים הקובעים את המקום. זה יכול לקחת בדיקה ידנית נרחבת לכוון פרמטרים ניתוח תמונה למערכי ניסוי ספציפיים. מתווה של הצינור החישובית שלנו עם פונקציות MATLAB רלוונטיות היא אמורה בסעיף 7 לפרוטוקול. בעיה זו היא להקל במידה מסוימת על ידי בדיקות Stellaris שבו יש רק<html> תווית אחת לבדיקה. לפיכך דורש colocalization של בדיקות מרובות כדי לראות את אות. כי דגים מחייבים תיקון תאים, זה לא להקל על תאים בודדים מעקב לאורך זמן. בעבר, השתמשנו בנתוני תמונת מצב דגים כדי לשחזר את הדינמיקה של ביטוי גנים בשמרי אוכלוסיות אופניים מטבולית בודדות 6. רכיבה על אופניים מטבולי הוא ציין בתרבויות טרום מורעבות, רציפות, ומאופיין בתנודות קולקטיביות אוכלוסייה רחבה בצריכת חמצן. תנודות אלו קשורים עם תנודות הגנום של תמלילים המתרחשים למחצית מכל הגנים השמרים בשלבים של צריכת חמצן שונים. אנחנו ביקש לקבוע אם רכיבה על אופניים מטבולי היו קיימת בתרבויות שמרים הרציפות unsynchronized. אם קיים, תמלילים, כי הם אנטי קורלציה באוכלוסיות סינכרוני צריכים גם להיות אנטי מתואמים בunsynchronized תאים בודדים, ולהיפך לתעתיקי קורלציה. אף אוזן גרון &quot;&gt; כדי לשחזר את הדינמיקה של ייצור ה-mRNA בזמן, את נתוני תמונת המצב הנצפים חייבים להיות לעומת מה שמצפה ממודל של ההתנהגות הבסיסית. ישנן מגבלות תיאורטיות לכאשר כאלה&quot; צלמו &quot;נתוני ביטוי גנים יכול לשמש כדי לקבוע ניתן להבחין בדינמיקת ביטוי גנים המשמשת כבסיס ואילו סוגים של דגמים 21. לנתוני מחזור חילוף חומרים, ולא ישירות מראה נוכחות של תנודות זמניות, מדידות סטטיסטיות יושמו על מנת לבסס כי אכן תא תכנית תנודתית אוטונומית בקנה אחד עם microarray בתפזורת מדידות.

באמצעות שימוש בטכניקות מדידה בכמות גדולה, שלא ניתן לassay מספר התעתיקים או פעילות תעתיק בתוך תאים בודדים 1. באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים המונעים על ידי יזמים בעלי עניין ככתבים של ביטוי גנים יכולים לטפל בבעיה זו במידה מסוימת, אך הזמן הנדרש לחלבוני ניאון להתקפל מטשטש דינמיקה מוקדמת. חלבוני ניאון חיים ארוכים גם לא יכולים לדווח על חיי mRNA. שיטת הדגים יכולה לשמש כדי mRNA assay במהלך מחזור החיים המלא שלו, מהתחלת שעתוק בגרעין להבשלה וריקבון שלאחר מכן בתאים בודדים, עם רזולוציה של מולקולה בודדת. המקורי בניסויים באתר המאפשר הדמיה חומצות גרעין המשמשות בדיקות RNA radiolabeled לחקור רצפי דנ&quot;א. אלה כללו הדמיה דנ&quot;א ריבוזומלי בשחלות של צפרדע Xenopus laevis 2 וה-DNA בלווין ברקמת עכבר 3. הניאון ראשון באתרו experiment משמש מולקולת RNA מסומנת בfluorophore לחקור רצפי דנ&quot;א מסוימים 4. היישום הראשון של בדיקות ניאון המאפשרים הדמיה RNA באתרו היה ההדמיה של ביטוי גנים אקטין בתרבית רקמת שריר עוף 5. לאחרונה, בשמרי ניצנים, דגים נעשו שימוש כדי לחקור את התנודות בשעתוק במהלך מחזור חילוף החומרים השמרים 6, הדעיכה של mRNAs במהלך התקדמות במחזור תא 7, ולוקליזציה המרחבי של תעתיקי mRNA במהלך מיטוזה 8. דגים כבר בשימוש בשמרים כדי להראות שתנודות מתואמות בגנים constitutively עיבד, המהווים יותר ממחצית מכל הגנים השמרים, נובעות מייזום שעתוק מתואם 9. במינים שאינם שמרים, דגים כבר משמשים לזיהוי סמנים בתאי גזע במעי העכבר 10 ולקבוע כי penetrance שלמה של גורלות סלולריים יכולה לנבוע מתנודות אקראיות בביטוי גנים געוברי elegans 11. שיטת הדגים המתוארות כאן פועלת על ידי ההכלאה שכותרתו צבע, בדיקות דנ&quot;א חד גדילי mRNA להודעות. תאים הם צילמו וmRNAs נספרות באמצעות אלגוריתם זיהוי מקום. יכולות להיות שנוצרו בדיקות יחידה התקועות עם סינתיסייזר ולאחר מכן ה-DNA שכותרתו (המכונה כאן בדיקות זינגר) או הורה מסחרי כמו בדיקות שכותרתו מראש (בדיקות Stellaris) 12,13. הבדל עיקרי בין בדיקות זינגר וStellaris הוא כי בדיקות זינגר הן ארוכות יותר (~ 50 נ&quot;ב) וכותרתו הן רב ואילו בדיקות Stellaris הן קצרות (~ 20 נ&quot;ב) עם תווית אחת בלבד לכל בדיקה, כפי שתוארה על ידי ראג&#39; ואח&#39; 14. בנוסף, גישת Stellaris שימושים רבות יותר לבדיקות גנטית מזה של זינגר (~ 30 לעומת 5 בדיקות בגן, בהתאמה). להלן אנו מספקים פרוטוקול שמתאר את השימוש בכל אחד מסוגי הבדיקה. בסעיף 2, אנו מספקים פרוטוקול לתיוג בדיקות המכילות thymidine האמין allyl wה-i סיי צבע שנבחר. סקירה של צעדי החישוב הנדרשים כדי לזהות כתמים בודדים mRNA היא אמורה בסעיף 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

הקרינה הכלאה באתרו (FISH) השיטה מאפשרת לאדם לזהות את חומצות גרעין בסביבת הסלולר המקומית. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בדגים כדי לכמת את מספר mRNAs בתאי שמרים בודדים. ניתן לגדל תאים בכל מצב של עניין ולאחר מכן תיקנו ועשו חדיר. כתוצאה מכך, deoxyoligonucleotides יחידה תקוע מרובים מצומדות לצבעי ניאון משמש לתייג ולדמיין mRNAs. הקרינה עקיפה מוגבלת ממולקולות ה-mRNA יחידה היא לכמת באמצעות אלגוריתם ספוט זיהוי כדי לזהות ולספור את מספר mRNAs לכל תא. בעוד שיטות הכימות הסטנדרטיות יותר של כתמים צפוניים, RT-PCR וmicroarrays ביטוי גנים לספק מידע על mRNAs הממוצעת באוכלוסייה בתפזורת, דגים מאפשרים גם הספירה והלוקליזציה של mRNAs אלה בתאים בודדים ברזולוציה מולקולה בודדת.

איור 3 מציג היסטוגרמות טיפוסיים מחושבים מתמונות דגים ומשמשים כדי לקבוע את מספר mRNAs המצויים בתאים בודדים. יתרון חשוב של מיקרוסקופיה מבוסס כימות RNA הוא שאדם יכול להשיג מידע על הלוקליזציה של תמלילים. לדוגמה, השתמשנו בדגים כדי לזהות mRNAs בתאים בודדים עם אלל מושרה CBF1 (איור 4). כי מולקולות mRNA רבות נמצאות באתר של שעתוק, אנו מסוגלים לזהות את נוכחותו ואת המיקום של אתרי שעתוק בתוך הגרעין. על ידי ניצול צבעים שונים כדי mRNAs התווית של גנים שונים, אפשר לכמת מיני mRNA מרובים באותם תאים. כדי להמחיש זאת, תאי שמרים הודגרו בנוכחות α-הפקטור וסורביטול. FUS1 שעתוק (Quasar670 צבע, אדום) הנגרם על ידי α-גורם. שעתוק STL1 (Quasar 570 צבע, ירוק) הוא מושרה על ידי עליות בosmolarity תאי ( <stronG&gt; איור 5). איור 4 הוא דוגמה של דג עם בדיקות זינגר. איור 5 הוא דוגמה של דג עם בדיקות Stellaris. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של דגי הליך ניסיוני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של צינור ניתוח תמונה. הנקודות הסופיות נקבעות בדמות הימנית ביותר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> איור 3. היסטוגרמה של עוצמות מקום עבור גן מסוים באמצעות בדיקות זינגר </strong&gt;. עוצמות בדיקה מחושבות מבפנים (אדום) ו( הכחולים) של תאים חיצוניים. כתמים בעצימות נמוכים הם או רעש או בדיקות יחידה. הודעות ה-mRNA אמיתיות מסומנות עם בדיקות מרובות. בעת שימוש בבדיקות Stellaris, בדיקות יחידה הן פחות לזיהוי וכך הספים והסינון חייבים להיות בהתאם. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> איור 4. נציג תוצאות של הליך דגי זמרת. בניסוי זה, שעתוק CBF1 מופעל עם אמרגן מושרה 18. הגרעינים הם מוכתמים כחולים עם DAPI. MRNAs CBF1 מתויגות עם בדיקות Cy3 שכותרת. חצים לבנים להדגיש את נוכחותו של CBF1 אתרי שעתוק בגרעין. תעתיקי mRNA יחיד גלויים בציטופלסמה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> איור 5. נציג תוצאות של הליך דגי Stellaris. תאי שמרי מאטה בו זמנית נחשפו ל -30 α-גורם ng / ml 0.75 מ &#39;וסורביטול למשך 10 דקות ובו זמנית נבדקו עבור FUS1 (Quasar 670, אדום) וSTL1 (Quasar 570, ירוק) תעתיקים. בתיבה המסומנת, אנחנו יכולים לראות רק תא אחד מגיב לפרומון (אתר תחילת FUS1, אדום) ועוד בעיקר מגיבים לסורביטול (אתר תחילת STL1, ירוק).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע פלואורסצנטי<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים) לספירת mRNAs בתאים בודדים ברזולוציה של מולקולה בודדת.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K Views.  Princeton University. פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע פלואורסצנטי באתר הכלאה (דגים) לספירת mRNAs בתאים בודדים ברזולוציה של מולקולה בודדת.

Video: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.