העבודה במעבדה של המחבר ממומנת על ידי מכוני המחקר הקנדי הבריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר ואת אוניברסיטת קונקורדיה.

בנייה של זנים דיפלואידי פרוטוקול לייצור diploids ידי הזדווגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנים הראשוני צריך להיות הכה על YPD בינוני, או סלקטיבי במידת הצורך, כדי לייצר מושבות אחת. שני זנים הפלואידים צריך להיות סוג של הזדווגות ההפוך (כלומר, מאטה ו MATα). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאה חיסון סטרילי לקחת חלק קטן במושבה מאחד שני זנים הפלואידים. על צלחת פס חדש YPD את הלולאה פעם אחת בקו ישר על פני הצלחת. סמן את כיוון פס עם חץ בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו עבור זן השני בצלחת YPD אותו. הפעם פס בניצב אל המושבה הראשונה, חציית פס הראשון עם השני. סמן את כיוון פס השני וציין את האזור שבו פס second חוצה את הראשון. אזור זה יהיה שם diploids יופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת YPD ב 30 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replica צלחת צלחת YPD על גבי מדיה סלקטיבית כי יהיה סלקטיבי היתר גידול שזה עתה קמו diploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת אם אפשר, או חלק קטן של פס דיפלואידי ו פס על המדיום סלקטיבית אותו כדי ליצור מושבות אחת. </li></ol> נביגה ועיכול asci פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות אחת מהצלחת לעיל ולעשות קטן (1cm x 1cm) כתמים על נביגה (SPO) צלחות לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים sporulate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נביגה ניתן לבדוק על ידי הסתכלות על התאים מפני תיקון כל במיקרוסקופ אור. תאים מקום בשקופית מיקרוסקופ μl 5-10 של מים, במקום coverslip על גבי אגל, ולחפש בנוכחות asci. אם asci לא נמצאים בקלות ואז להחזיר בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש נביגה יעיל אחד התיקונים, להכין צינור סטרילי חרוטי עם 15 מ&quot;ל של מיץ 100μL הטטרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תאים למעלה מ תיקון זה נביגה עם לולאה חיסון סטרילי 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומניחים מיץ הטטרדה. מערבולת בעדינות את הלולאה על מנת לאפשר לתאים ליפול הלולאה ומערבבים עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו במיץ הטטרדה (המכיל zymolyase) עבור 4-10mins (תלוי בריכוז ופעילות של zymolyase והמתח עצמה). זה מאפשר עיכול של התא הקיר המקיף את ascospores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי. תגובת ניתן לעצור על ידי הוספת 1mL של קרים כקרח סטרילי DH 2 O. אפשר התאים להסתפק 5mins. הסר 1mL מ supernatant ואז לערבב קלות ביד ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5μL של תאים מתעכל משלב 5 ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לולאה סטרילי חיסון 3mm להפיץ מאוד בעדינות את טיפות 1-3 פעמים בקו בעוד בקושי ביצירת קשר עם אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר (אם צעד 7 מושמט, זה כאשר מערכת העיכול של התא הקיר החיצוני יהיה מופחת או להפסיק). המשך המיקרוסקופ לנתיחה. </li></ol> Dissection של Asci פרוטוקול ראוי לציין, כי פרוטוקול הבאים מתוארת עבור מיקרוסקופ זינגר MSM מערכת המיקרומניפולציה 200. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה בשינויים קלים אם באמצעות micromanipulator ידני כגון micromanipulator MR Zeiss. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב החיפוש. איתור asci. רצוי לבחור asci אשר נמצאים באזורים בהם התאים מפוזרים היטב. הימנע שטחים עם אשכולות התא. ארבעת ascospores מ asci עדיין צריך להיות קשור אחד לשני. שני ascospores עשוי להיות מעט גדול יותר משני האחרים. הימנע לקטוף asci שבו ascospore רופף ולא מחובר לשאר ascospores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי נאד עם המחט. לאט לאט מביאים את המחט את הצלחת. כאשר צל של microneedle הוא ראה, בשורה הזאת עם נאד כדי להיות נטל. שוב הגישה את המחט עד קו המתאר השחור של מעגל (קצה המחט) נתפסת. מגע הטטרדה עם המעגל הזה ולאחר מכן במהירות למשוך את המחט משם. ודא כל ארבעת ascospores מתוך נאד דבקו המחט וכי אין תאים נוספים נאספו על microneedle כי אינם חלק נאד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את microneedle הרחק מן הצלחת וללכת המטריצה ​​(עבור נאד הראשונה, ללכתעמדת A1). שימו לב למיקום שבו כל נאד היא עברה. מניחים את נאד על ידי נגיעה צלחת עם microneedle ו מתרחק עד כל ארבעת ascospores ירדה microneedle. לחיצה עדינה של הזרוע מחט או את הפלטפורמה מחזיק את צלחת YPD הוא לעתים קרובות שימושי בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3-5 ומקום asci לעבר עמדות ברציפות על המטריצה ​​עד המספר הרצוי של asci כבר הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל נאד כל לשבור את ארבעה תאים לגזרים על ידי מתגרה עם המחט, הקשה על פלטפורמה בעדינות או שילוב של שניהם. תרים את התאים לעזוב אחד מאחורי במיקום חדש המטריצה ​​עד שכל ascospore ב נאד כל מופרד בשורות של ארבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת YPD באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים כדי לבחון את דפוס הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replica צלחת התאים גזור עד בינוני סלקטיבי במידת הצורך. </li></ol> רילוקיישן של Zygotes פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את שני זנים הפלואידים עם סוגים הזיווג ההפוך על המדיום המתאים כדי להשיג מושבות אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלה Mate שני זנים כמתואר לעיל ולאפשר לגדול מ 4 עד 6 שעות (או לילה במקרה הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק zygotes תחת מיקרוסקופ אור. Zygotes יופיעו המשקולת בצורת תאים עם או בלי ניצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תאים עם לולאה חיסון 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומקום בעדינות 100μL של סטרילית DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5μL ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לולאה חיסון 3mm להפיץ את טיפות בקו בעדינות רבה תוך בקושי ביצירת קשר עם אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר. המשך המיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב החיפוש. אתר זיגוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי זיגוטה עם המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום zygotes בנפרד על המטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר zygotes לגדול במשך כמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת Replica zygotes על המדיום סלקטיבית המתאימה. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> איור 1: זיווג של שני זנים הפלואידים סוגי ההזדווגות מול יוצרת זן דיפלואידי. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> איור 2: (א) צלחת YPD עם תוצאות thre של הזיווג בין זן טמפרטורה רגיש (עם auxotrophy leu2 א) ו זן סוג בר (LEU2). תאים מתעכל פרושים באזור inoculum בצד שמאל איפה צמיחה עבה בין שני קווים שחורים נתפסת. Asci כי כבר גזור לגדול מחולקת באופן שווה במטריצה ​​בצד ימין. (ב) צלחת ב (א) היה משוכפל לצלחת הנשירה SD-לאוצין. הערה הצמיחה 02:02 עבור הסמן LEU2 המעידים על ascospore תוקף היה גזור. (ג) צלחת ב (א) היה משוכפל על צלחת YPD וטופחו על 37 ° C. שים לב כי הצמיחה 2:02 נוסף מאמת כי ascospore היה גזור.

<ol>
	<li>Sherman, F., Hicks, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+and+Dissection+of+Asci.">Micromanipulation and Dissection of Asci.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 21-37 (1991).</li></ol>

דיסקציה שמרים הוא כלי שימושי כדי לבחור זנים חדשים עם סמנים הרצוי. בעת קביעת דפוס הצמיחה התיאורטי של ארבעה ascospores חשוב להסתכל גנוטיפ של התא הווגטטיבי. אם הפלסמיד הוא ההווה, צריך לדעת אם הוא עותק יחיד, נמוך או גבוה כמו זה ישפיע אשר ascospore (ים) לקבל את הפלסמיד ואת ישפיע התחזי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Singer MSM System 200</td>
<td>Microscope</td>
<td>Singer Instruments</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-sorbitol</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOR508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zymolyase 100T</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seikagaku Corporation</td>
<td>120493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YEX401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PEP 403</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YNB406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bio-tryptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOD002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>POA 301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>AGR003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ADS201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-uracil</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>URA 241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>HIS 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-arginine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Amresco</td>
<td>0877-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-methionine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>MET 222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tyrosine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TYR 333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ISO 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-valine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>VAL 201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LYS 101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-phenylalanine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PHA 302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU 202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-threonine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>THR002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LEU 222</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of saccharomyces cerevisiae asci

שמרים היא מערכת מודל ממושמע מאוד המשמש מחקר רבים בתהליכים תאיים שונים. המתח מעבדה משותפת<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; קיים הפלואידים או מצב דיפלואידי. היכולת לשלב שני אללים haploids ואת היכולת להנהיג שינויים בגנום מחייבת ייצור של asci לנתיחה. ייצור Asci מתאי הפלואידים מתחיל החיזור של שני זני שמרים הפלואידים עם סוגים ההזדווגות תואם לייצר זן דיפלואידי. ניתן להשיג זאת במספר דרכים או על מדיום מוצק או נוזלי. זהו יתרון לבחור עבור diploids במדיום זה סלקטיבי מקדם צמיחה שלהם לעומת כל אחד הזנים הפלואידים. Diploids מותר אז sporulate על מדיום תזונתי דל להקים asci, חבילה של ארבעה תאים הפלואידים בת הנובע רבייה meiotic של דיפלואידי. תערובת של התאים הצמחיים, asci מטופל אז עם zymolyase את האנזים לעכל משם את שק קרום המקיף את ascospores של asci. שימוש המיקרומניפולציה עם microneedle תחת מיקרוסקופ לנתיחה אחד יכול להרים asci הפרט נפרד להעביר את ארבעת ascopores. Asci גזור גדלים במשך כמה ימים נבדקו סמנים או אללים של עניין על ידי ציפוי העתק על גבי מדיה סלקטיבית המתאימה.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci at JoVE.com

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

המיקרומניפולציה בתאי שמרים דרוש ניתוח גנטי meiotic או לבחור zygotes דיפלואידי. Micromanipulations אלה מתבצעות באמצעות microneedle של מיקרוסקופ לנתיחה. Microneedle משמש להעביר תאים נשלטת על ידי micromanipulator אשר זמינים עם דרגות שונות של אוטומציה.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

18.4K Views.  Concordia University. המיקרומניפולציה בתאי שמרים דרוש ניתוח גנטי meiotic או לבחור zygotes דיפלואידי. Micromanipulations אלה מתבצעות באמצעות microneedle של מיקרוסקופ לנתיחה. Microneedle משמש להעביר תאים נשלטת על ידי micromanipulator אשר זמינים עם דרגות שונות של אוטומציה.

Video: Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR פיקוח חיזור טיטרציה של הקו-הפקטורים של<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...