המחברים מבקשים להודות לYabin וו עבור culturing הרקמות המוצגות באיור 2, התמונה צולמה על ידי ברט ואן Overbeeke. העבודה נתמכת כלכלית על ידי SenterNovem, המענק 42022 ISO.

1. תרבות של תאי Murine היצמדות מוליד או C2C12 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים בהתאם לפרוטוקול שפורסם תחילה על ידי שפר ועמיתיו 10, ומאוחר יותר בעיבוד של קולינס ואח&#39;. בונן 11 ואח&#39; 12. ולאחסן אותם בחנקן נוזלי. זה דורש עכברים, למשל C57Bl / 6. שיטות חלופיות המשמשות במעבדות אחרות, למשל שיטה שפורסמה בכתב העת של ניסויים דמיינו ידי Li Y et al. 13. לחומרים כימיים והציוד אתה התייחסת לטבלה בעמוד 7 ו 8. משרירים מעכבר אחד אתה בדרך כלל תקבל מספיק תאים כדי cryopreserve כ 20 בקבוקונים בחנקן נוזלי. בשלב הבא, אנחנו מתחילים את הפרוטוקול להפשיר את התאים מאחסון החנקן הנוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התאים מבקבוקון 1 ל25 סנטימטרים 2 Matrigel (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בקבוק תרבית רקמה מצופה ולהוסיף מדיום גידול (GM) בהיקף של (335 מ&quot;ל DMEM מתקדם, בובין העוברי 100 מ&quot;לדואר סרום (FBS), 50 המ&quot;ל HS, 5 המ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מיליליטר L-glutamin, 5 מיליליטר תמצית עוף עובר (CEE)). </li></ol> הערה: מעייל ל2 שעות בטמפרטורת חדר ולהסיר Matrigel ידי שאיפה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת תרבות התאים כ 01:03 כל 3 ימים. פירושו של הדבר: ביום 3: תאי מעבר מאחד 25 סנטימטרים 2 עד 2 סנטימטר בקבוק 75, ביום 6: תאי מעבר מ 2 בקבוק אחד 75 סנטימטרים לשתי צלוחיות 150 סנטימטר (2 עם 30 דקות preplating בצלוחיות ללא ציפוי). ביום 2 בקבוק 150 9 העברה 1 סנטימטר עד 2 בקבוק 1 משולש 150 סנטימטר, או אם אינו זמין לשלושה 150 סנטימטר 2 צלוחיות (במידת צורך preplate שוב תלוי בפנוטיפ של תאים). ביום 12 בתאים מוכנים לזריעה למבנה שרירים. </li></ol> הערות: - לכל 150 סנטימטרים משולשים 2 מספר התאים יהיה כ 4.5 x 10 6 תאים. - השתמש באמצעותls מבידודים שונים לערבב אותם כדי להשיג אוכלוסייה מעורבת של תאים בשלב של זריעה. הערה: אם תבחר שלא לעבוד עם תאים ראשוניים, C2C12 myoblasts הוא אלטרנטיבה טובה. 2. הנדסת רקמות שריר שלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דבק סיליקון על ידי הערבוב &quot;אלסטומר&quot; עם &quot;סוכן הריפוי&quot; (10:01). חותך + / - מגזרים מרובעים 5 מ&quot;מ של סקוטש בצד משולש אחד (בית דמוי צורה; איור 1). דבק סקוטש לתוך הבארות של צלחת תרבות 6-היטב בשטח של כ 12 מ&quot;מ בין הריבועים. </li></ol> הערות: - השתמש רק בצד הרך של סקוטש ולפנות מעלה הצד הזה. - ודא כי גגות פנים זה לזה. - רק לכסות סקוטש עם סיליקון דבק, אינו מתפשט ברחבי דבק היטב. - לגירוי חשמלי מאוחר יותר היא רלוונטית כדי ליישר את המבנים בכיוון האנכי של pl הטובאכלתי (לאורך ציר זמן). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר לייבוש למשך הלילה בתנור ואקום, לא מחומם, בעיקר כדי להסיר בועות אוויר. לעקר ידי הוספת EtOH 70% לבארות והדגירה במשך 15 דקות. לשטוף 3x עם PBS ולשים תחת UV במשך 15 דקות. הסר את כל PBS מהבארות וסקוטש והמקום בחממה עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר פתרון Matrigel במקרר ולהכין את פתרון קולגן לריכוז הרצוי זמן קצר לפני ביצוע מבני 3D. דלל את הקולגן המניות עם חומצה אצטית 0.02% סטרילי (ריכוז סופי 3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li></ol> הערה: להשאיר הכל על קרח. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize התאים, resuspend ב GM וספירה. לצאת מתאים בצינור צנטריפוגה בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות הרצויה של פתרון מניות קולגן למספרים של מבנים שברצונך להפוך לצינור (לפי טבלה 1), להוסיף NaOH 0.5m לפתרון קולגן זה עד אור ורוד קולוR הוא מצביע על רמת חומציות של 7.5. מערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולמנוע היווצרות בועה. ואז להוסיף Matrigel ומערבב בעדינות אך ביסודיות. לבסוף, מוסיף לתערובת GM קולגן / Matrigel (לכמויות המתאימות ראה טבלה 1). </li></ol> הערות: - לבצע כל צעד על קרח! Matrigel וקולגן יהיו בקלות ג&#39;ל בטמפרטורה הולכת וגוברת. - לשים לב שהצבע אכן הוא ורוד! עלייה בחומציות גם לגרום gelation המהיר. - ריכוז סופי של קולגן: 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הסכום הרצוי של תאים ב1000 סל&quot;ד למשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. </li></ol> הערה: - בהתאם לפעילות של התאים במספר תאים לכל בנייה צריך להיות מותאם. בדרך כלל, מספר התאים נמצא בין 750.000 ו1250000 תאים לכל מבנה. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בחלק מתערובת ג&#39;ל לresuspend התא הגלולולהעביר את התאים לתוך התערובת שנותרה ומערבב היטב, אך ללא החדרת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את גם צלחות חוממו מראש מתוך החממה ופיפטה 0.35 -0.4 מ&quot;ל של תערובת התא ג&#39;ל לסקוטש הראשון. ואז, מתחיל פיפטה את התערובת מהמרכז בין האתרים המצורפים ולהאריך לסקוטש. לבסוף, שימוש יתר ג&#39;ל כדי למלא את הפער בין שני עוגנים ופיפטה סקוטש סביב פיסות סקוטש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק היטב לאחר דקות 5-10 אם הג&#39;לי הוא מוצק מספיק כדי להיות מועבר, כלומר בעדינות לנצל את הכלים ולבדוק חזותיים אם ג&#39;ל הוא נוקשה. אם כן, הנח את הכלים בזהירות באינקובטור. בדרך כלל, הם יכולים להיות הרים אחרי עשר דקות. ואז, אחרי שעתי 1-2, עדינות כיסוי כל ג&#39;ל עם 4 מ&quot;ל של GM החם. </li></ol> הערה:-אל תעשו תנועות נמרצות בעת טיפול בצלחות. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף GM ידי בידול בינוני (מדיום גידולללא תמצית עוברים אפרוח) לאחר 24 שעות, ולהחליף במדיום טרי כל 2-3 ימים. ביום 7 היית צריך להשיג סיבי שריר בכיוון בשל, כפי שניתן להעריך עם ההכתמה לפיתוח תלמי צלב בסיבי השריר התמזגו. </li></ol> 3. גירוי חשמלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את האלקטרודות מצלחת ionoptix (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד) לפני השימוש באתנול 70% ולאחר מכן יבש תחת UV בקבינט בטיחות. הנח את הצלחת עם אלקטרודות לצלחת התרבות עם המבנים ומכסים עם מכסה מצלחת התרבות וההעברה לחממה. חבר Ionoptix C-הקוצב עם הכבלים המתאימים. </li></ol> הערה: אלקטרודות מונחות במקביל לצד מבנה השריר (איור 2). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פרוטוקול הגירוי כצפוי. </li></ol> הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 4 V / סנטימטר,פולסים 6ms בתדירות של 2Hz. שינוי התרבות בינונית בכל שעות 24 בזמן הגירוי.

<ol>
	<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meet+the+new+meat:+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li><li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro.">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li><li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells.">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells:+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle.">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells.">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+by+electrical+stimulation:+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells.">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li><li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoregulation+of+vascularization+in+aligned+tissue+engineered+muscle;+a+role+for+VEGF.">Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway.">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li><li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+function,+self-renewal,+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche.">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li><li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche:+optimizing+proliferation+and+differentiation.">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li><li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues.">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).</li><li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol:+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li><li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model.">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li><li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC.">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , (2013).</li><li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts.">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li></ol>

המחברים אין לי מה לחשוף.

הנדסת רקמות שריר יש פוטנציאל גדול לשימוש כמודל מחלה, לסריקת תרופות וברפואת רגנרטיבית לייצור בשר. עם זאת, הדרישות ליישומים אלה משתנות. אנחנו בחרנו לעבוד עם שילוב של קולגן וmatrigel, כי קולגן מאפשר יישור תאים וכי תאי אב ההיצמדות דורשים נוכחות של חלבונים שמקורם בממברנה מרתף...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> גורם Matrigel צמיחה מופחתת </td><td> Beckton ודיקינסון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (רמת סוכר גבוה) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> המתקדם DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> סוס סרום </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> גריינר </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45-0.22 מיקרומטר מזרק מסנן * </td><td> Whatmann (לייכר וScheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> פלסטיק תרבות </td><td> גריינר </td><td></td><td> כולל צלוחיות תרבות וטפטפות </td></tr><tr><td> תמצית עובר אפרוח </td><td> ארצות הברית ביולוגית </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> פסטר פיפטה * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> פסטר pipettes, עם התכווצות, עם כותנת L, פתוח טיפ: 230 מ&quot;מ בקוטר קצה 0,9 - 1,1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פסטר פיפטה * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> פסטר pipettes, עם התכווצות, עם כותנת L, פתוח טיפ: 230 מ&quot;מ בקוטר קצה 1,4 - 1,6 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פסטר פיפטה </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase סוגי* </td><td> סיגמא </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא מיקרומטר 40 * </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> מחט 19G </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלסטומר </td><td> Dow Corning תאגיד </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> אשפרה סוכן </td><td> Dow Corning תאגיד </td><td></td><td> Silastic MDX 4-4210 # </td></tr><tr><td> סקוטש </td><td> חנות רגילה </td><td></td><td> אתה יכול לקנות את זה בחנות רגילה, יש להשתמש בצד הרך בלבד </td></tr><tr><td> קולגן סוג I, זנב חולדה </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> הפייסר תרבות EP-C-Pace </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מנות התרבות 6-כן לגירוי חשמלי </td><td> Beckton דיקינסון-פלקון </td><td> BD פלקון # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודות צלחת תרבות C-Dish </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * דרוש לבידוד של תאים (נקודה 1.1) # יחד בערכה 1 </td></tr></tbody></table>

engineering skeletal muscle tissues from murine myoblast progenitor cells and application of electrical stimulation

רקמות שריר מהונדס יכולות לשמש למספר מטרות שונות, הכוללת את הייצור של רקמות לשימוש כמודל מחלה במבחנה, למשל ללמוד כיבי לחץ, ולרפואת רגנרטיבית כחלופת בשר 1. מבני השרירים הראשונים שדווחו 3D נעשו לפני שנים רבות וחלוץ בתחום הם Vandenburgh ועמיתי 2,3. שיפורים שנעשה בהנדסת רקמת שריר הם לא רק תוצאה מהעלייה העצומה בידע של גורמים ביוכימיים, תאי גזע ותאי אב, אבל הם במבוססים בעיקר על תובנה שנרכשו על ידי חוקרים כי גורמים פיסיים משחקים תפקיד חיוני בשליטה על התנהגות תא ו רקמת פיתוח. שריר מהונדס מדינה-of-the-art בונה כיום מורכב ממבנים הידרוג תא מאוכלסים. במעבדה שלנו אלה בדרך כלל מורכבים מתאי Murine היצמדות progenitor, מבודדים מרירי גפיים אחוריים Murine או קו תא היצמדות עכברי C2C12, mixed בתערובת של קולגן / Matrigel ומצופה בין שתי נקודתי עיגון, מחק את רצועות השריר. תאים אחרים עשויים להיחשב גם כן, שורות תאים חלופיות כגון כגון L6 myoblasts חולדה 4, תאי שריר הילוד נגזרים progenitor 5, תאים שמקורם ברקמות שריר בוגרים ממינים אחרים, כגון אדם או 6 תאי גזע pluripotent מושרים אפילו (תאי iPS) 7 . contractility הסלולרי גורם ליישור של התאים לאורך הציר הארוך של מבנה 8,9 וההתמיינות של תאי אב השריר לאחר כשבוע של התרבות. יתר על כן, היישום של גירוי חשמלי יכול לשפר את התהליך של התמיינות במידה מסוימת 8. בגלל גודלו המוגבל (8 X 2 X 0.5 מ&quot;מ) רקמה המלאה ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה confocal לפקח כדאיות למשל, בידול ויישור תא. בהתאם ליישום הספציפי בדרישות לעבודות ההנדסהרקמת שריר אדומה תשתנה; שימוש דוגמה לרפואת רגנרטיבית דורש גמלון גודל רקמות וכלי הדם, ואילו לשמש כחלופת תרגום בשר למינים אחרים הוא הכרחי.

המוצר הסופי יהיה בונת שריר, שהוזכרה באיור 3. גודל הרקמה יהיה כ 8 מ&quot;מ ארוך, 2 מ&quot;מימ רוחב ו 0.5 מ&quot;מ עובי. גירוי חשמלי במהלך הבידול יהיה לשנות את הביטוי של שרשרת הכבדה isoforms השרירן, אך אינו משפר את תהליך הבידול מאוד כמו הנגרם על ידי מדיום ההתמיינות 8, אבל גירוי חש...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation at JoVE.com

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.8K Views.  Eindhoven University of Technology, The Netherlands. רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

Video: Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג&#39;ל התאים המכילים

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living components. Due to their inherent advantages, biorobots are gaining interest as alternatives to traditional fully artificial robots. Various studies have focused on harnessing the power of biological actuators, but only recently studies have quantitatively characterized the performance of biorobots and studied their geometry to enhance functionality and efficiency. Here, we demonstrate the development of a self-stabilizing swimming biorobot that can maintain its pitch, depth, and roll without external intervention. The design and fabrication of the PDMS scaffold for the biological actuator and biorobot followed by the functionalization with fibronectin is described in this first part. In the second part of this two-part article, we detail the incorporation of cardiomyocytes and characterize the biological actuator and biorobot function. Both incorporate a base and tail (cantilever) which produce fin-based propulsion. The tail is constructed with soft lithography techniques using PDMS and laser engraving. After incorporating the tail with the device base, it is functionalized with a cell adhesive protein and seeded confluently with cardiomyocytes. The base of the biological actuator consists of a solid PDMS block with a central glass bead (acts as a weight). The base of the biorobot consists of two composite PDMS materials, Ni-PDMS and microballoon-PDMS (MB-PDMS). The nickel powder (in Ni-PDMS) allows magnetic control of the biorobot during cells seeding and stability during locomotion. Microballoons (in MB-PDMS) decrease the density of MB-PDMS, and enable the biorobot to float and swim steadily. The use of these two materials with different mass densities, enabled precise control over the weight distribution to ensure a positive restoration force at any angle of the biorobot. This technique produces a magnetically controlled self-stabilizing swimming biorobot.

In this two-part study, a biological actuator was developed using highly flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cantilevers and living muscle cells (cardiomyocytes), and characterized. The biological actuator was incorporated with a base made of modified PDMS materials to build a self-stabilizing, swimming biorobot.

תא שריר לב מבוסס מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. These devices, called biorobots, are powered solely by the force generated from the contractile activity of the living component and, due to their many inherent advantages, could be an alternative to conventional fully artificial robots. Here, we describe the methods to seed and characterize a biological actuator and a biorobot that was designed, fabricated, and functionalized in the first part of this two-part article. Fabricated biological actuator and biorobot devices composed of a polydimethylsiloxane (PDMS) base and a thin film cantilever were functionalized for cell attachment with fibronectin. Following functionalization, neonatal rat cardiomyocytes were seeded onto the PDMS cantilever arm at a high density, resulting in a confluent cell sheet. The devices were imaged every day and the movement of the cantilever arms was analyzed. On the second day after seeding, we observed the bending of the cantilever arms due to the forces exerted by the cells during spontaneous contractions. Upon quantitative analysis of the cantilever bending, a gradual increase in the surface stress exerted by the cells as they matured over time was observed. Likewise, we observed movement of the biorobot due to the actuation of the PDMS cantilever arm, which acted as a fin. Upon quantification of the swimming profiles of the devices, various propulsion modes were observed, which were influenced by the resting angle of the fin. The direction of motion and the beating frequency were also determined by the resting angle of the fin, and a maximum swim velocity of 142 &#181;m/s was observed. In this manuscript, we describe the procedure for populating the fabricated devices with cardiomyocytes, as well as for the assessment of the biological actuator and biorobot activity.

In this study, a biological actuator and a self-stabilizing, swimming biorobot with functionalized elastomeric cantilever arms are seeded with cardiomyocytes, cultured, and characterized for their biochemical and biomechanical properties over time.

שריר הלב מבוססי תא מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...