המחברים מבקשים להודות לסנג&#39;יב Gambhir על המתנה של גן כתב fluc/mrfp/sr39tk. עבודה זו מומנה על ידי רשת לתאי הגזע (SCN) של קנדה, וקרן מסעו של ג&#39;סי.

1. תחזוקה והתקדמות של C2C12 Myoblasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת C2C12 myoblasts בבקבוק 2 סנטימטר 75 ולשמור על תאים בסרום של גלוקוז הגבוה Dulbecco השינוי של הנשר (HG-DMEM) בתוספת סרום שור עוברי (FBS) לריכוז סופי של 10%. אל תאפשרו לתאים להפוך לconfluent בכל עת כמו זה יהיה לרוקן את אוכלוסיית myoblastic. בינוני צריכים להיות שונה בכל יום אחרת הערה:. בינונית תמיד חם עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר myoblasts הפך כ 80% מחובר, תאי מעבר לבקבוק חדש. לשאוב מדיום התרבות. שטוף תאים עם פתרון 4-5 מ&quot;ל הנקס מאוזן מלח (HBSS) כדי להסיר את כל העקבות של תרבות בינונית, המכיל סרום טריפסין-עיכוב. בקצרה לשטוף את שכבת התא עם 0.25 (w / v) פתרון טריפסין-EDTA לנתק את myoblasts החסיד מבקבוק% 2-3 מ&quot;ל. לשאוב טריפסין ובקבוקון המקום באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך incuba זהtion, להכין בקבוק חדש עם 9 מ&quot;ל של מדיום FBS HG-DMEM/10%. לאחר trypsinization, להוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום מוחלט לתאים וזמני פיפטה 4-5 להבטיח אוסף של כל התאים בטווח הבינוני. הוסף 1 מ&quot;ל של השעית תא לבקבוק החדש ומדגיר CO 5% 2 ב 37 ° C. </li></ol> 2. Transfection התא C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאים הגיעו 50% confluency, transfect פי הוראות היצרן מInvitrogen. בקצרה, לשלב 90 ריאגנט 2000 μl Lipofectamine עם 4.5 מ&quot;ל בינוני OPTI-ממ. בצינור אחר, לשלב 36 דנ&quot;א גן כתב CMV-trifusion מיקרוגרם עם 4.5 המ&quot;ל OPTI-ממ. פליק כל צינור לשלב ולחכות 5 דקות. שלב את התוכן של שני הצינורות, מערבב בעדינות והדגירה בטמפרטורת חדר למשך שלושים דקות בדיוק. הערה: בקבוק השני צריך גם להגדיר לתאי untransfected שיקבלו Lipofectamine וOPTI-ממ רק כדי לשמש שליטה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מC2C12 תאים ולהוסיף 15.5מ&quot;ל של מדיום FBS טרי HG-DMEM/10%. הוסף בינוני transfection להביא נפח כולל עד 20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התר לתאי transfect לילה עבור לפחות 20 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב בינוני transfection ולהוסיף 10 המ&quot;ל HG-DMEM/10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. ללכוד הוא שדה מואר ותמונות פלואורסצנציה אדומות (באמצעות קוביית מסנן TRITC; mrfp לשעבר /: 584/607 ננומטר). לספור את מספר התאים המבטאים-RFP שנצפו תחת פלואורסצנטי מחולק במספר הכולל של תאים שנצפו בשדה בהיר עבור שדות מרובים של נוף לייצר יעילות transfection. </li></ol> 3. הערכת Assay הנייד שרידות / MTT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני transfection, 1x10 5 תאים C2C12 צלחת לכל אחד גם בצלחת 24 גם אחד. תאים צריכים להיות מצופים ב500 כרכי μl בHG-DMEM/10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, myoblasts transfect הלילה כפי שתואר לעיל. פעל לפי הצעות יצרן לtransfection reagenכרכי t לצלחת 24 היטב. דגירת קבוצה של בארות עם Lipofectamine בלבד (ללא DNA) כביקורת. צפו בתאים תחת פלואורסצנטי כדי להבטיח שtransfection התקין התרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני transfection וmyoblasts אינקובטורים עם 5 מ&quot;ג / המ&quot;ל thiazolyl הכחול tetrazolium רומיד (MTT) בHG-DMEM/10% FBS. הוסף D-luciferin לשמונה מבארות transfected, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות. Solubilize גבישי formazan כחולים על ידי הוספת 180 μl isopropanol לכל באר. נער על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות מכל משקע, פתרון פיפטה בצלחת 96 היטב ולקרוא בספיגה 575 ננומטר. </li></ol> 4. הכנת Myoblasts להשתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, לשטוף myoblasts עם HBSS, וtrypsinize תאים כפי שמתואר ב1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תאים ב4 מ&quot;ל של מדיום שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש hemocytometer, ספירת תאים לייצר כרכים המכילים 10 6 myoblasts. פיפטה כרךUme לתוך 1.5 המ&quot;ל microtubes סטריליים. עם יעילות transfection של ~ 10%, ערכים אלה מצביעים על כך שהתאים 100.000 לוציפראז מבטא-ניתנים לאיתור בסורק GE ExploreOptix לאחר השתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג נפח הזרקה סופית של 15 μl, המכיל 10 6 C2C12 תאים. במידת צורך, סרכזת microtubes ב2000 סל&quot;ד במשך דקה אחת. בזהירות לשאוב supernatant עם פיפטה. Re-להשעות תאים ב15 μl של HG-DMEM FBS החסר. </li></ol> 5. השתלת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר עם 2%% isoflurane / 2 O 2. למרוט שיער מאזור האיבר האחורי הגבה. לשמור על הרדמה בשיעור של 1.5%% isoflurane / 2 O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבטיח C2C12 myoblasts מושעה היטב. עם העכבר בתנוחת שכיבה, להאריך את האיבר האחורי ולהשתמש במזרק אינסולין להזריק תאים ישירות לתוך הראש לרוחב של שריר הגסטרוקנמיוס בזווית ° 30. הזרק myoblasts transfected לגפה הימנית האחורית וint myoblasts untransfectedo איבר הנגדי (משמאל) האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקת פליטת אור בסיסית: מהירות העברת עכבר לבמה בסורק האופטי, נחת העכבר בתנוחת שכיבה. לחבר את קו ההרדמה. כדי להבטיח את העכבר נשאר מורדם, אדם שני צריך להיות נוכח כדי לחבר את קו ההרדמה ואילו במקומות האחרים בחיים של הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות להאריך את האיבר האחורי כך אזור ההזרקה גלוי. גפיים אחוריים במקום קלטת עם דבק עדין כגון קלטת רפואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את החדר ולוודא שאין אור יכול לגשת לחלק פנימי של הסורק, שכן דבר יגדיל את אות הרקע זוהתה. הסורק צריך להיות מוגדר לפרמטרים שנכללו בהוראות היצרן שלך עבור הדמית פליטת אור. באופן ספציפי, להבטיח &quot;לא ליזר&quot; נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) באזור המרוט וסריקת התחלה. </li></ol> 6. הזרקה של תשתית Fluc, D-luciferin, לעכבר MDX &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד העכבר הוא מורדם intraperitoneally להזריק 150 מ&quot;ג / ק&quot;ג של מצע הגחלילית לוציפראז, D-luciferin (מפתרון מניית מ&quot;ל 40 מ&quot;ג /, מורכב על פי הוראות יצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר עכבר ולאפשר תקופת ספיגה 15 דקות לפני הכנת עכבר לסריקה הבאה. </li></ol> 7. BLI ליעד MPCs לוק מבטא-בעקבות שתל לתוך מודלי עכבר של DMD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הקליטה, להרדים עכבר שוב, כפי שתואר ב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר חזרה לסורק האופטי ולבצע סריקת פליטת אור אחר, באותו אופן כמו סריקה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות תקופת ספיגת דקות 20 אמורה לספק עוצמת אות מקסימלי, סריקה לאחר מכן ניתן לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת רכישה של תמונה, להקריב את העכבר בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי בעלי החיים המוסדיים ועדת האתיקה שלך והמועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC). מבודד את שרירי גפיים אחוריים ואת המקום מיידn 10% פורמלין כדי לתקן לembedment פרפין. בצע צביעת אימונוהיסטוכימיה ללוציפראז לאשר הזרקה לשריר של myoblasts. </li></ol>

<ol>
	<li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> Lancet. 359, 687-695 (2002).</li><li>Blake, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+genetics+of+dystrophin+and+dystrophin-related+proteins+in+muscle.">Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle.</a> Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).</li><li>Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells.">Muscle stem cells.</a> J. Pathol. 197, 457-467 (2002).</li><li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+that+participate+in+regeneration+of+skeletal+muscle.">Cells that participate in regeneration of skeletal muscle.</a> Gene Ther. 9, 752-753 (2002).</li><li>Moss, F. P., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+as+the+source+of+nuclei+in+muscles+of+growing+rats.">Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats.</a> Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).</li><li>Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autoradiographic+study+of+satellite+cell+differentiation+into+regenerating+myotubes+following+transplantation+of+muscles+in+young+rats.">An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats.</a> Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).</li><li>Hoffman, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dystrophin+in+muscle-biopsy+specimens+from+patients+with+Duchenne's+or+Becker's+muscular+dystrophy.">Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy.</a> N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).</li><li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects.">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects.">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+lights.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse:+a+point+mutation.">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li><li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, 294 (2001).</li><li>Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+in+hind+limb+skeletal+muscle+of+the+mdx+mouse.">Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).</li></ol>

סופרים אין לי מה לחשוף.

במחקר זה, שתארנו הדמיה, גישה מולקולרית מהירה ואמינה לגן כתב הלא פולשני myoblasts היעד / MPCs לאחר השתלה. בעוד מחקר זה מדגים את הלוקליזציה לטווח קצר של MPCs המושתל באמצעות bioluminescense הדמיה (BLI), אופן שבו תאים ממוקדים יכול, למעשה, להיות מיושם בקלות להערכת אורך של engraftment תא, באמצעות השתלה של תאים שמבטאים יציבות גן הכתב. לשם כך, הקבוצה שלנו נוצרה קווי עכבר מהונדסים כי נמל גן הכתב האחיד. רק תאים המבטאים את גן הכתב להתחמצן D-luciferin לייצר פוטונים להדמיה באמצעות BLI. מאז חמצון של D-luciferin תלוי בביטוי גנים, מדוברת בטכנולוגיה רבה עצמה שבה להלא פולשני תאים מושתלים קיימא תמונה. רקמת שריר שנקטפה מעכברים מהונדסים אלה ותאי לווין (SCS) בודדו באמצעות FACS אכן יכולה להיות targeteד לאחר השתלה לעכברי MDX. בנוסף, נוכל לעקוב אחר סטטוס ההתמיינות שלהם באמצעות השימוש במקדם שרירים ספציפיים, מגביר עוד יותר את התועלת והחשיבות של טכנולוגיות הדמיה מולקולריות, כמו שהוצג במסמך זה, בתחום מחקר DMD (כתב יד שהוגשה). בנוסף למהירות שלה והעלות נמוכה, BLI אינו רעיל, מה שהופך אותו לבחירה אטרקטיבית עבור הדמיה תכופה של בעלי חיים קטנים. תכונה זו, כמו גם סגולית הגבוהה שלה, תהיה יקרה בזיקוק טיפולים חלופיים ובהיצמדות למודלים למחלות טרום קליניים של ניוון שרירים דושן לפני קידום המחקרים קליניים החלימו-המעורבים טכנולוגיות כגון PET.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasts </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הבינוני של Dulbecco השינוי של הנשר </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 12800-017 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 12483020 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 25200-72 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח מאוזנת הנקס </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H6648 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> ניקון אקליפס TE2000-5 </td><td> ניקון מכשירים בע&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenolight D-luciferin </td><td> PerkinElmer </td><td> 122796 </td><td> 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS </td></tr></tbody></table>

molecular imaging to target transplanted muscle progenitor cells

ניוון שרירים דושנו (DMD) הוא מחל תוקפת גנטית חמורה המשפיעה על 1 ב 3500 בנים, ומתאפיין בניוון מתקדם שרירי 1, 2. בחולים, את היכולת של תאי שריר לווין תושבים (SCS) להתחדש myofibers הפגוע הופכת יותר ויותר יעילה 4. לכן, השתלה של תאי שריר (progenitor MPCs) / myoblasts מנבדקים בריאים היא גישה טיפולית מבטיחה לDMD. מגבלה עיקרית לשימוש בטיפול בתאי גזע, לעומת זאת, היא מחסור בטכנולוגיות הדמיה אמינות לניטור ארוך טווח של תאים מושתלים, ולהערכה האפקטיבית שלו. כאן, אנו מתארים גישה לא פולשנית, בזמן אמת כדי להעריך את ההצלחה של השתלה והיצמדות. שיטה זו מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכב של גנים (הגחלילית לוציפראז [fluc], חלבון פלואורסצנטי monomeric האדום [mrfp] וsr39 קינאז תימידין [sr39tk]) expression ניתן הדמיה בשיטות שונות הדמיה 9, 10. מגוון של שיטות הדמיה, כולל טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT), דימות תהודה מגנטיות (MRI), דימות אופטי, ותדירות גבוהה 3D-אולטרסאונד זמין כעת, כל אחד עם יתרונותיו ומגבלות ייחודיים 11. פליטת אור הדמית מחקרים (BLI), למשל, יש את היתרון של להיות עלות נמוכה יחסית ותפוקה גבוהה. זה מסיבה זו, במחקר זה, אנו עושים שימוש ברצף גחלילית לוציפראז (fluc) כתב הגן הכלול בתוך גן ההיתוך והדמית פליטת אור (BLI) ללוקליזציה לטווח קצר של C2C12 myoblasts קיימא בעקבות השתלה לעכבר מודל של DMD (ניוון שרירים על כרומוזום X [MDX] עכבר) 12-14. חשוב לציין, BLI מספק לנו אמצעים לבחון את הקינטיקה של MPCs כותרת פוסט השתלה, ויהיה שימושי כדי לעקוב אחר תאים שוב ושוב על tIME וההגירה הבאה. גישת גן כתבנו נוסף מאפשרת לנו למזג שיטות הדמיה מרובות בחי נושא יחיד; קבל טומוגרפית הטבע, ברזולוציה מרחבית מצוינת ויכולת בהיקף של עד חיות ובני אדם 10,11 גדולות, PET יהווה את הבסיס למחקר עתידי שאנחנו מציע עשויה להקל תרגום מהיר של שיטות שפותחו בתאים למודלים פרה וליישומים קליניים.

על 50-60% confluency, C2C12 myoblasts היה transfected זמנית עם גן כתב ההיתוך הנ&quot;ל לבנות מורכב מגחלילית לוציפראז [fluc], monomeric אדום ניאון חלבון [mrfp] וsr39 תימידין קינאז [sr39tk] (איור 1 א). יעילות transfection חושבה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (האיורים 1B, C), תוך שימוש ברצף mrfp בכתב שלנו לבנות. שרידות תא לא הושפע על ידי תיוג עם מצע BLI, D-luciferin (1D איור). בעקבות transfection, כ 100.000 myoblasts mrfp מבטא-הושתלו לתוך שריר לתוך שריר הגסטרוקנמיוס של עכברי MDX (נקבע בעבר, כתב יד שהוגש); 100.000 תאי untransfected הושתלו דומה לאיבר האחורי הנגדי כביקורת. השתלת תאים באופן מיידי הבאה, עכברים הוזרק intraperitoneally (IP) עם 150 מ&quot;ג / ק&quot;ג D-lucifeרין. לאחר תקופת ספיגה של ~ 20 דקות, עכברים צלמו בסורק אופטי חיה קטנה (קופסה שחורה GE ExplorOptix כי הוא מצויד לפליטת אור פלואורסצנטי וחי). כפי שהוכיח בעבר, היא במבחנה וספיגה של D-luciferin לאחר השתלה (כתב יד שהוגשה) היה ספציפי לmyoblasts fluc מבטא-, ללא פליטת אור לזיהוי בתאי untransfected (איור 2). אימונוהיסטוכימיה אשרה השתלה תוך שרירית של myoblasts (איור 3) <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50119/50119fig1.jpg" /> איור 1 סכמטי של CMV-trifusion כתב מבנה ();. Brightfield / תמונות פלואורסצנציה של C2C12 myoblasts transfected עם כתב פלסמיד trifusion (ב &#39;, ג&#39;); assay MTT להעריך שרידות תא C2C12 בעקבות תיוג עם מצע BLI, D-lucifer<html> ב( ד &#39;). <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50119/50119fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50119/50119fig2.jpg" /> איור 2. הדמית פליטת אור (BLI). אזור של עניין (ROI) נמשכת להקיף את אזור האיבר האחורי קטף בי myoblasts מוזרק (). פליטת האור אינה מזוהית במהלך סריקה ברקע (B). בגיל 23 דקות לאחר הזרקה של D-luciferin, איתות ברורה מזוהית מאיברו הימני האחורי בי myoblasts וציפראז-לבטא מוזרק. אין פליטת אור מתגלה באיבר האחורי הנגדי הוזרק myoblasts untransfected (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50119/50119fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> upload/50119/50119fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. IHC באמצעות נוגדן בלוציפראז גחלילית מאשר השתלה תוך שרירית של C2C12 תאי transfected.

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells at JoVE.com

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש ב<em&gt; Fluc</em&gt; רצף גן הכתב למקד את התאים באמצעות הדמית פליטת אור.

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

molecular-imaging-to-target-transplanted-muscle-progenitor-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K Views.  Lawson Health Research Institute. אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש ב Fluc רצף גן הכתב למקד את התאים באמצעות הדמית פליטת אור.

Video: Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo kinetics of transplanted cells. A non-invasive method to repetitively monitor transplanted stem cells in vivo would allow investigators to directly monitor stem cell transplants and identify successful or unsuccessful engraftment outcomes.
A wide range of stem cells continues to be investigated for countless applications. This protocol focuses on 3 different stem cell populations: human embryonic kidney 293 (HEK293) cells, human mesenchymal stem cells (hMSC) and induced pluripotent stem (iPS) cells. HEK 293 cells are derived from human embryonic kidney cells grown in culture with sheared adenovirus 5 DNA. These cells are widely used in research because they are easily cultured, grow quickly and are easily transfected. hMSCs are found in adult marrow. These cells can be replicated as undifferentiated cells while maintaining multipotency or the potential to differentiate into a limited number of cell fates. hMSCs can differentiate to lineages of mesenchymal tissues, including osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, tendon, muscle, and marrow stroma. iPS cells are genetically reprogrammed adult cells that have been modified to express genes and factors similar to defining properties of embryonic stem cells. These cells are pluripotent meaning they have the capacity to differentiate into all cell lineages 1. Both hMSCs and iPS cells have demonstrated tissue regenerative capacity in-vivo.
Magnetic resonance (MR) imaging together with the use of superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticle cell labels have proven effective for in vivo tracking of stem cells due to the near microscopic anatomical resolution, a longer blood half-life that permits longitudinal imaging and the high sensitivity for cell detection provided by MR imaging of SPIO nanoparticles 2-4. In addition, MR imaging with the use of SPIOs is clinically translatable. SPIOs are composed of an iron oxide core with a dextran, carboxydextran or starch surface coat that serves to contain the bioreactive iron core from plasma components. These agents create local magnetic field inhomogeneities that lead to a decreased signal on T2-weighted MR images 5. Unfortunately, SPIOs are no longer being manufactured. Second generation, ultrasmall SPIOs (USPIO), however, offer a viable alternative. Ferumoxytol (FerahemeTM) is one USPIO composed of a non-stoichiometric magnetite core surrounded by a polyglucose sorbitol carboxymethylether coat. The colloidal, particle size of ferumoxytol is 17-30 nm as determined by light scattering. The molecular weight is 750 kDa, and the relaxivity constant at 2T MRI field is 58.609 mM-1 sec-1 strength4. Ferumoxytol was recently FDA-approved as an iron supplement for treatment of iron deficiency in patients with renal failure 6. Our group has applied this agent in an &ldquo;off label&rdquo; use for cell labeling applications. Our technique demonstrates efficient labeling of stem cells with ferumoxytol that leads to significant MR signal effects of labeled cells on MR images. This technique may be applied for non-invasive monitoring of stem cell therapies in pre-clinical and clinical settings.

We describe a technique for labeling and tracking stem cells with FDA-approved, superparamagnetic iron oxide (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). This cellular imaging technique that utilizes magnetic resonance (MR) imaging for visualization, is readily accessible for long-term monitoring and diagnosis of successful or unsuccessful stem cell engraftments in patients.

תיוג בתאי גזע עם Ferumoxytol, ה-FDA אוקסיד Nanoparticle ברזל

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo ...

The Use of Thermal Infra-Red Imaging to Detect Delayed Onset Muscle Soreness

Delayed onset muscle soreness (DOMS), also known as exercise induced muscle damage (EIMD), is commonly experienced in individuals who have been physically inactive for prolonged periods of time, and begin with an unexpected bout of exercise1-4, but can also occur in athletes who exercise beyond their normal limits of training5. The symptoms associated with this painful phenomenon can range from slight muscle tenderness, to severe debilitating pain1,3,5. The intensity of these symptoms and the related discomfort increases within the first 24 hours following the termination of the exercise, and peaks between 24 to 72 hours post exercise1,3. For this reason, DOMS is one of the most common recurrent forms of sports injury that can affect an individual&#x2019;s performance, and become intimidating for many1,4.
For the last 3 decades, the DOMS phenomenon has gained a considerable amount of interest amongst researchers and specialists in exercise physiology, sports, and rehabilitation fields6. There has been a variety of published studies investigating this painful occurrence in regards to its underlying mechanisms, treatment interventions, and preventive strategies1-5,7-12. However, it is evident from the literature that DOMS is not an easy pathology to quantify, as there is a wide amount of variability between the measurement tools and methods used to quantify this condition6. It is obvious that no agreement has been made on one best evaluation measure for DOMS, which makes it difficult to verify whether a specific intervention really helps in decreasing the symptoms associated with this type of soreness or not. Thus, DOMS can be seen as somewhat ambiguous, because many studies depend on measuring soreness using a visual analog scale (VAS)10,13-15, which is a subjective rather than an objective measure. Even though needle biopsies of the muscle, and blood levels of myofibre proteins might be considered a gold standard to some6, large variations in some of these blood proteins have been documented 6,16, in addition to the high risks sometimes associated with invasive techniques. 
Therefore, in the current investigation, we tested a thermal infra-red (IR) imaging technique of the skin above the exercised muscle to detect the associated muscle soreness. Infra-red thermography has been used, and found to be successful in detecting different types of diseases and infections since the 1950&#x2019;s17. But surprisingly, near to nothing has been done on DOMS and changes in skin temperature. The main purpose of this investigation was to examine changes in DOMS using this safe and non-invasive technique.

The purpose of this investigation was to assess whether using an infra-red thermal camera is a valid tool for detecting and quantifying the muscle soreness after exercising.

השימוש הדמיה תרמית אינפרא אדום לזהות כאבים שרירים התחלה מושהית

Delayed onset muscle soreness (DOMS), also known as exercise induced muscle damage (EIMD), is commonly experienced in individuals who have been physically ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

דימות תהודה מגנטית כמותי של מחלת שריר שלד

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

Contractility המידות של האדם הרחם שריר חלק לפיתוח התרופה עזרה

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

צימוד נוירו-וסקולריים שרירי השלד, קיבולת חמצוני, ופועלים Microvascular עם 'אחד עצור חנות' ספקטרוסקופיית אינפרא אדום

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...