עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מעניקה NS047726, NS072027, וAR052646.

השיטות במחקר זה בוצעו בהתאם אתי עם בית הספר לאוניברסיטת נורת&#39;ווסטרן פיינברג לרפואה מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) אישרו הנחיות. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. 1. נוהל ניסיון בElectroporation vivo של מכופף digitorum רוויס (FDB) השריר Bundle בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים עיצוב לביטוי בvivo באמצעות אמרגן הידוע להביע בתאי יונקים (למשל, ציטומגלווירוס, CMV) או בשרירים (לדוגמא, שריר קריאטין קינאז, MCK) 6,7. פלסמידים גדולים יותר עשויים לבטא ברמות נמוכות יותר. אמרגן CMV כבר נעשה שימוש נרחב 6,7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פלסמידים מא coli באמצעות תנאי תשלום רעלן פנימי לפי הוראות יצרן. ממיסים את פלסמיד במאגר סטרילי, רעלן פנימי חינם TE ב2-5 פלסמיד / μl מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל וaliquot פלסמיד לconcentration של 20 מיקרוגרם של ה- DNA בμl 10 של רעלן פנימי סטרילי (מיקרוגרם / μl 2) TE החופשי חיץ להזרקה לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. הכן aliquot אחד לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות של hyaluronidase ל1X עם פוספט סטרילי שנאגרו מלוח ללא סידן ומגנזיום (PBS - / -) נותן ריכוז סופי של 8 יחידות. Aliquot 10 μl של hyaluronidase המדולל להזרקה לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות isoflurane 2.5% עד מסומם ואינו מגיב לזנב או צביטת הבוהן. מניחים את החיה במצב שכיבה על כרית חימום או שולחן חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שודד של העכבר עם יישום לסירוגין של לשפשף יוד povidone ואלכוהול שלוש פעמים תוך שימוש בטכניקת הכנה שמקורם מאתר המחט ומקרינה כלפי חוץ. טכניקה זו שומרת על אתר המחט במצב ספטית, מזעור מבוא הפתוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שודד הדרכים של העכבר דואר עם 10 μl של פתרון hyaluronidase 1x (2 מ&quot;ג / מיליליטר = 8 יחידות) בין העור והשרירים באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי. Hyaluronidase מעכל רכיבים של מטריקס להתיר כניסה יעילה יותר של פלסמיד לmyofibers. הזן בבסיס העקב ולקדם את המחט לכיוון הבהונות. לאט לאט לשחרר את הנוזל כמחט חזר בו. אתר ההזרקה מתחת לעור ירחיב ולהתחיל להפוך ורוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6 ו -1.7 ברגל הנגדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את ההרדמה ומניח את העכבר בחזרה בכלוב. אפשר העכבר כדי להתאושש באופן מלא מהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נהלי עיקור הרדמה ורגל, צעדים 1.5 ו -1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את ה- DNA פלסמיד המדולל לשודד הדרכים באותו אופן כפי שhyaluronidase. ודא שעוצמת הקול המרבית היא 20 μl או פחות. לביטוי פלסמיד הכפול להזריק 20 מיקרוגרם של כל פלסמיד עם נפח מרבי של 20 &amp;# 181; L או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הזרקת פלסמיד על שודד הנגדי או להשתמש ברגל הנגדית לזריקות שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הרגל שהייתה בתחילה מוזרקת, להרים את העור מהשרירים והדגישו עם מלקחיים עדינים ומניח את מחט G אחד 27 דרך הכדורים של עור ליד הבהונות בעמדת בניצב לקו לרפא הבוהן של כף הרגל. קח מחט G 27 סטרילי שני ולמקם אותו בצורה אופקית דרך העור בעקב. מחטי מקום במקביל לכל פרט 1 סנטימטר אחר ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במהדק תנין, אלקטרודות מהדק למחטים המקבילות לוודא המחטים לא ליצור קשר עם אחד אחרת. השימוש בפלסטלינה יכולה להבטיח את מהדק במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודות לממריץ חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate השרירים על ידי הפעלת 20 פעימות, 20 אלפית שניים בזמן / כל אחד, ברץ 1, ב 100 V / סנטימטר. הבהונות עשויות עווית עם גירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הגירוי ברגל הנגדית במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הסר מחטים. נגב את השודד עם לשפשף יוד povidone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את ההרדמה. החזר את העכבר לכלוב ההתאוששות ופעילות צג. אם ההליך בוצע כצפוי, את החיה צריכה להחזיר ניידות נורמלית בתוך 30 דקות ולהפגין אין הבדל ברמת ניידות או פעילות ממראש הזרקת התנהגות. לפיכך, לא משככי כאבים לאחר הליך נדרשים. על ההתאוששות, להחזיר את בעלי החיים לביבר. הערה: ביטוי חלבון יכול להיות assayed מוקדם ככל 48 שעות לאחר electroporation. עם זאת, על מנת לאפשר התאוששות מלאה יותר לאחר electroporation, אנחנו מעדיפים בידוד ומחקר של myofibers 7-14 ימים לאחר electroporation 10. ביטוי יכול להיות assayed כל עוד 4 שבועות לאחר electroporation. </li></ol> 2. נוהל ניסיון לבידוד של מכופף digitorum רוויס הסיבים (FDB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> collagenase הפשרה. לכל חבילה FDB להכין שתי בארות בצלחת תרבית רקמת 12 גם. באחד גם להוסיף 1 מ &#39;l הנשרים מדיה מחומם מראש השתנה Dulbecco בתוספת סרום שור אלבומין (DMEM + BSA) ובשני טוב להוסיף 1 מיליליטר של טרום חמם Ringers פתרון. בנוסף, להוסיף טרי 10 מיליליטר של תמיסת Ringers 1x למ&quot;מ 35 Sylgard צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי החיים באמצעות CO 2 או משאיפת גז הרדמה, ואחריו נקע בצוואר הרחם או בשיטה אחרת, כדי להבטיח את המוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרגליים האחוריות מעל מפרק הקרסול באמצעות סכין גילוח נקי ולצלול בפתרון Ringers 1x במ&quot;מ 35 Sylgard צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין רגל אחת הדוק, בלעדי פונה כלפי מעלה, על צלחת Sylgard עם 30 מחטי G דרך כל 5 הטיפים בוהן ובקרסול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בקרסול, לגזור את העור כלפי מעלה בצד של כף הרגל לאורך קו השיער לכיוון הבהונות, נזהר שלא ניק השרירים מתחת לעור. חזור על פעולה בצד השני של רגל השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את העור בבסיס הקרסול עם מלקחיים עדינים, לחתוך את העור פני העקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיחת העורדש עם מלקחיים, המספריים מצביעים לכיוון העור כדי לא ניק השריר. לגזור רקמת חיבור הבסיסית, ביעילות הסרת העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את חבילת שריר FDB לחתוך את הגיד הגדול בעקב לשחרר את הגיד מהעצם. מחזיק גיד עם מלקחיים, לנתח את צרור FDB מהגיד הלבן הגדול הסרת כל רקמת חיבור שצורפה לFDB עם מספריים בזהירות. אם נעשה כראוי החבילה תהיה בקלות להרים את של גידי הבסיס חושפים גידים לבנים בוהקים מובילים לספרות בודדת. חותך את FDB בגידים ליד הבהונות לשחרר את החבילה מהרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל חבילת השרירים בDMEM + BSA המכיל גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה ברגל הנגדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל שרירי FDB מבודדים, להוסיף של collagenase 100 μl לכל DMEM + BSA ושרירים המכיל גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההצלחה של electroporation במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לפני העיכול. אם properl עשהy, כלפי מעלה של 90% יעילות transfection יכול להיות מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בC חממת humidified, 37 מעלות ב -10% CO 2 לכ 1 שעה. זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לדגם מחלה ורקע והרבה collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, בזהירות להעביר את צרור FDB לפתרון Ringers רק המכיל גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate צרור FDB בהיטב עם פתרון Ringers בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. חותך את הקצה של קצה פיפטה בסכין גילוח נקי כך שהחבילה יכולה בקלות לעבור את קצה פיפטה. בעדינות triturate השריר (~ 15 פעמים) מאפשר החבילה לעבור למעלה ולמטה במקביל לקצה. סיבים שלמים ייפלו לתוך צלצולי הפתרון. כאשר סיבים לא בקלות ליפול החבילה, למקם את השרירים גב לפתרון collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט הסיבים המבודדים על הצלחת ~ 500 μl לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לשריר כדי לעכל בבאר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.15ל2.17 עד החבילה יורדת בגודל וברוב הסיבים הם ניתקו מהחבילה (בדרך כלל בסך הכל 2-3 פעמים). ברגע שניתק את השריר עובר בקלות דרך קצה פיפטה 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו סיבים לצרף הצלחת למינימום של 15 דקות. פתרון Ringers טרי ניתן להוסיף לצלחת לדלל collagenase שייר או השתנה בהתאם לאילוצי זמן. הערה: סיבים מוכנים כעת להדמיה. </li></ol> 3. נוהל ניסיון להדמיה של נזק ממברנה מושרה לייזר באמצעות מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבים טען מייד לפני הדמיה עם 300 μl של 2.5 מיקרומטר FM 1-43 של צבע 4-64 FM בפתרון אצבעות. בדרך כלל, סיבי תמונה 15 דקות לשעה 2 לאחר בידוד. עם זאת, ניתן הדמיה עד להודעה סיבי בידוד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת זכוכית התחתונה במיקרוסקופ confocal מצויד בליזר UV ואובייקטיבי 60X / 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר סיבים. ודא הסיבים מחובר היטבלמנה על ידי הקשה על בסיס מיקרוסקופ. תכלול סיבים שניזוקו בתהליך הניתוק. סיבים פגומים עשויים להכיל שלפוחיות קרום, רמות גבוהות של ספיגת צבע FM, סלסול או לכופף בעוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום לניזק קרום בסיבים, מקם את sarcolemma במרכז חלון ההדמיה עם שדה ברור של גרעינים. להתמקד בsarcolemma באמצעות ערוץ הצבע FM כך שsarcolemma הוא חד ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שיער צלב ROI על sarcolemma ניצול ערוץ FM 4-64. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את נקודת פיקסל 1 בעצמה של 80% במשך 3 שניות (~ 350 x 350 ננומטר אזור ננומטר). צבע FM ייכנס לתא באתר של פציעה. כוח והזמן יכולים להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את האזור של עלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של הסיבים לפני הנזק, בעת הפגיעה, כל הודעה נזק-2 שניות, ולאחר מכן כל 10 שניות עד 5 דקות. תזמון יכול להיות מותאם בהתאם לצורך. ניתן להמיר תמונות בודדות לסרטי זמן לשגות בתמונת ג &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים3.3 דרך 3.7 על עד 3 סיבים לכל צלחת. </li></ol>

<ol>
	<li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+differentiated+state.">Plasticity of the differentiated state.</a> Science. 230, 758-766 (1985).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Richler, C., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+cultivation+and+differentiation+capacities+of+myogenic+cell+lines.">The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines.</a> Dev Biol. 23, 1-22 (1970).</li><li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells.">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet muscle. 1, 34 (2011).</li><li>DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation.">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp: JoVE. , (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).</li><li>Kerr, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin+stabilizes+stress-induced+Ca2++signaling+in+the+transverse+tubule+membrane.">Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).</li><li>Anderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micropeptide+encoded+by+a+putative+long+noncoding+RNA+regulates+muscle+performance.">A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance.</a> Cell. 160, 595-606 (2015).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+blebbing+as+an+assessment+of+functional+rescue+of+dysferlin-deficient+human+myotubes+via+nonsense+suppression.">Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression.</a> J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2.">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion.">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים.

השימוש בelectroporation ללמוד חלבונים מתויגים fluorescently in vivo הוא אידיאלי לחקר שרירים בהיעדר המודלים שורת התאים המתאימים שנאמנות לשכפל את כל מבנה התא של שריר. פרוטוקול זה מתאר את הניצול של electroporation ומיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה כדי לספק הדמיה מפורטת של לוקליזציה החלב...

myofibers בודדת תאים גדולים, מאורגנים מאוד syncytial. ישנם כמה מודלים תא-תרבות לשריר; עם זאת, יש לי דגמים אלה כמגבלה העיקרית שלהם שהם אינם מבחינים באופן מלא בmyofibers הבוגר. לדוגמא, שורות תאי C2C12 וL6 נגזרות מעכברים וחולדות, בהתאמה 1-4. בתנאים של רעב סרום, התאים &quot;כמו היצמדות למנגנון-&quot; מונונוקלארים להפסיק הפצה, לעבור נסיגת מחזור תא, ולהיכנס לתכנית myogenic להרכיב תאי multinucleated עם sarcomeres, מכונה myotubes. עם תנאי תרבות ממושכים, myotubes עשוי להפגין תכונות התכווצות ו&quot; פרפור &quot;בתרבות. גם עכשיו הוקמו שורות תאים אנושיות 5. בנוסף לשורות תאים הונצחו אלה, יכול להיות מבודד myoblasts mononuclear משרירים ובתנאים דומים של רעב הסרום יהווה myotubes. שורות תאים אלה ותרבויות והיצמדות למנגנון עיקריות הן מאוד להשתמשפול כי הם יכולים להיות transfected עם פלסמידים או transduced עם וירוסים ומשמשים ללמוד תהליכים ביולוגיים של תא בסיסי. עם זאת, תאים אלה, גם כאשר נגרמו ליצירת myotubes, חסרים רבים מהמאפיינים הבולטים של ארגון שריר בוגר. באופן ספציפי, myotubes הם הרבה יותר קטן מאשר myofibers הבוגר הבודד וחסר צורה הנורמלית של myofibers. ביקורתי, myotubes חסר הרוחבי tubules (טי), הרשת הקרומית הנדרשת לשחרור Ca 2 + יעיל לאורך myoplasm. שיטה חלופית ולהיצמדות למנגנון ראשונית או שורות תאי myogenic כרוכה באמצעות myofibers הבוגר. Transgenesis יכול להיות מועסק על מנת להקים ביטוי של חלבונים מתויגים, אך שיטה זו היא זמן רב ויקרה. Electroporation vivo של שריר עכבר התפתחה שיטה מועדפת למהירות ואמינות 6-10. שיטות לelectroporation in vivo והבידוד יעיל של חה myofibersיש כבר מותאם לשריר brevis digitorum המכופף עכבר (FDB) 6. ניתן להשלים בקלות השיטות והם פולשנית לגרום בביטוי vivo מפלסמידים. גישה זו בשילוב עם שיטות עכשיו הדמיה ברזולוציה גבוהה הכוללים הדמיה לאחר שיבוש לייזר של 6,7 sarcolemma. השילוב של צבעים וביטוי של חלבונים שכותרתו fluorescently ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים תא בmyofibers הבוגר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td>Dissection Media 
			Dilution: 50ml +100g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Fiber Digestion 
			Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877229</td>
			<td>Fiber Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiber Digestion and Imaging 
			Dilution: 146 mM NaCl 
			5 mM&#160;&#160; KCl 
			2 mM&#160;&#160; CaCl2 
			1 mM&#160;&#160; MCl2 
			10mM HEPES 
			pH7.4 in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Pipettes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-C-R</td>
			<td>Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>94-120-71</td>
			<td>Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide 30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305128</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (-/-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4913</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500260</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Dissection media 
			Dilution: 100mg / 50ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08772B</td>
			<td>Dissection- used to hold sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator&#160;</td>
			<td>Grass</td>
			<td>s88x</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>270-356</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triadine</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-220</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide 27G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305136</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>SIU-V</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Injection 
			Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40&#181;l 5x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329420</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom Microwell dish</td>
			<td>MaTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-13320</td>
			<td>Microscopy 
			Dilution: Final 2.5 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-35356</td>
			<td>Microscopy 
			Dilution: Final 2.5 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid Purification</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electroporation, isolation and imaging of myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

Electroporation הוא טכניקה פולשנית שיעילות מציגה פלסמיד דנ&quot;א המטוהר לחבילת שריר (איור 1 א) brevis digitorum המכופף (FDB). שבעה ימים לאחר transfection fluorescently חלבון מתויג היא דמיין בmyofibers המבודד (איור 1). אז סיבים מבודדים הם מצופים ומוכנים להדמיה על מיקרוס...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers at JoVE.com

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

dna-electroporation-isolation-and-imaging-of-myofibers

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  Northwestern University. This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure. 

Video: DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation של mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

הפגנות חומרת הסביבה מופחתת כובד של טכנולוגיה cytometer זרימה וCompanion Microfluidic אב טיפוס מוקטנת ערבוב

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של הדנ"א הגנומי של זנבות עכבר