מחקר זה מומן על ידי מכונים הלאומי לבריאות מענקים R01HL105826 וK02HL114749 (ד&quot;ר Sadayappan), ומלגות לאיגוד לב אמריקאי במערב התיכון; 11PRE7240022 (מר Barefield) ו13POST14720024 (ד&quot;ר Govindan). המחברים תודה להכיר בסיועו של ד&quot;ר ג&#39;ימי פייג&#39;, ג&#39;יל Clampit וד&quot;ר ג&#39;ון הדסון, MSD, לתמיכה הטכנית ובספרות מצוינת שלהם בפיתוח assay.

1. Assay cMyBP-C Uniplex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני הניסוי, מעיל הצלחת הסטנדרטית החשופה 96, גם MSD עם נוגדן ללכוד. לcMyBP-C, יש להשתמש בנפח של 30 μl עכבר נוגדן אנטי cMyBP-C חד שבטי (ג&#39;לטין חינם) בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מדולל בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז גם הוא הידרופובי, פיפטה הפתרון לפינה התחתונה של הבאר, ואז להקיש על הצדדים של הצלחת להתפשט על פני כל הפתרון טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת מכוסה באוטם צלחת וטופחו O / N ב 4 ° C בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן ללכוד על ידי הקשה על פני פתרון כיור ולאחר מכן על ערימה של מגבות נייר. הלא ספציפי מחייב את הצלחת חסומה על ידי הוספת 150 μl של 5% (w / v) חוסם פתרון (BSA בדרגה גבוהה) ב PBS היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת ודגירה עבור שעה 1 ב RT תוך רועד ב 700 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב החסימה, להכין את הסטנדרטים ויםamples. להפוך את הסדרה הסטנדרטית על ידי דילול רקומביננטי בר חלבון cMyBP-C (חומצות אמינו 1-271) לריכוז התחלתי של 2,000 ng / ml ב1% (w / v) חוסם / PBS. אז לדלל סדרתי בפקטור של 5% ב1 (w / v) חוסם / PBS. סה&quot;כ 7 תקנים + ריקה 1 (1% (w / v) חוסם / PBS לבד) היו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון החסימה ולשטוף את צלחת 3x עם 150 0.05% (V / V) Tween-20/PBS μl. בכל פעם, להסיר את הפתרון לשטוף על ידי היפוך לצלחת מעל כיור. לאחר השלב לשטוף השלישי, במרץ קפיצי הצלחת מעל כיור וללטף את הצלחת במרץ על שכבה של מגבות נייר עד שהוא יבש לחלוטין. זהו צעד חיוני, כמו כרכי דגירה הם קטנים, וכל שנותר פתרון לשטוף באופן משמעותי יהיה לדלל את הדגירה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 25 של סטנדרטים ודגימות לתוך הבארות. חותם את הצלחת ולדגור על RT, בעוד רועד בסל&quot;ד 700 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון זיהוי הנוגדן ב1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בחוסם% 1 / PBS. מ&quot;קstom עשה נוגדן cMyBP-C (epitope חומצות אמינו 2 - 14) עם תיוג MSD sulfo-TAG משמש כנוגדן לזיהוי. ערכות זמינות לתיוג sulfo-TAG, מה שהופך את הליך פשוט יחסית לתייג את כל נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לשטוף כמתואר בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של פתרון נוגדן איתור היטב כל אחד, לאטום את הצלחת, ולדגור על RT במשך שעה 1 בצלחת שייקר נקבעה על 700 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת הדגירה, לרוץ הדגמת הצלחת של MSD (צלחת עם נורות LED), כדי להבטיח תפקוד תקין של Imager המגזר והתוכנה (ראה סעיף מגיב). כמו כן, לדלל את הקריאה החיץ, הניתן על ידי MSD, על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של חיץ קריאת 4x למים מזוקקים 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לשטוף כמתואר בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של קריאת חיץ היטב כל אחד על ידי שימוש בפיפטה רבה. הקפד להימנע מבועות אוויר (pipetting ההפוכה היא שיטה מתאימה). לאחר תוספת של הקריאה החיץ, לסרוק את הצלחת במגזר באופן מיידיImager. </li></ol> 2. 3-Plex cMyBP-C, CK-MB, וcTnI Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96 גם צלחת 3-Plex וdiluent פתרונות מותר לאזן לRT לפני השימוש. צלחת זה מראש מצופה בנוגדנים ללכידים cMyBP-C, CK-MB, וcTnI ידי MSD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של 1% (w / v) חוסם / PBS היטב כל אחד. הקש הצדדים של הצלחת על מנת לוודא כי כולו מכוסה היטב על ידי פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם אוטם צלחת, מניח את הצלחת על צלחת שייקר, ולנער בסל&quot;ד 700 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, סדרת דילול של כייל בודדים מוכנה. כי לכל אחד יש גם שלושה נוגדנים ללכוד שלוש כייל צריכים להיות מעורב ובדילול סדרתי לפני השימוש. לדלל רקומביננטי cMyBP-C, CK-MB (MSD), וcTnI (MSD) יחד ב1% (w / v) חוסם / PBS כדי ליצור מדגם אחד עם 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml-CK מגה בייט, ו25 ng / ml cTnI (מדגם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח סופי של לפחות 100 μl מוכן לכל תקן. אללהשלים את הסדרה הסטנדרטית, סדרתי לדלל הדגימות הן בפקטור של 5. השתמש 25 μl של מדגם ב100 1% (w / v) חוסם μl / PBS כדי ליצור מדגם ב &#39;ואז להשתמש μl 25 של המדגם B ב100 1% (w / v) חוסם μl / PBS כדי ליצור מדגם C , וכן הלאה. דגימות סרום אדם מ -16 נבדקים עם MI ו -16 נבדקי ביקורת שמשו כדי למדוד את רמות cTnI cMyBP-C, CK-MB, ו. דגימות אלה היו מדוללים ב2x 1% (w / v) חוסם / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של סטנדרטים ודגימות מדוללים ל25 μl הנוכחי כבר בבארות של צלחת 3-Plex. חשוב לכלול גם ריק (diluent בלבד). כדי לבסס את הטכניקה, דגימות נטענות בtriplicates הטכני. אחרת, כפילויות מספיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת שוב (ניתן לעשות שימוש חוזר אוטם צלחת) ולדגור על שייקר צלחת (700 סל&quot;ד) על RT במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שהוא סיים דגירה, פתרון נוגדן זיהוי מוכן. Diluent משמש הוא 1% (w / v) חוסם PBS. כל thrנוגדני איתור EE sulfo-מתויגים דילול יחד לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד. נוגדני איתור מסופקים בדרך כלל בריכוז מניות 50x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 96 גם צלחת מלאה, יש צורך ב2,700 μl של תמיסה מדוללת כוללת (עם pipetting כללה שגיאה). הוסף 54 μl של כל נוגדן לזיהוי 2,538 1% (w / v) חוסם μl / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, להסיר פתרונות נמרצות על ידי מצליף את הצלחת מעל כיור. לשטוף 3x הבארות עם 150 μl של 0.05% Tween-20 ב-PBS. הוסף 25 μl של פתרון נוגדן זיהוי לכל אחד גם באמצעות פיפטה רבה, ואת הצדדים של הצלחת הם טפח על מנת להבטיח שכולו מכוסים היטב על ידי פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת ודגירה במשך שעה 1 בזמן רועד ב 700 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת הדגירה, לרוץ הדגמת הצלחת של MSD (צלחת עם נורות LED), כדי להבטיח תפקוד תקין של Imager המגזר והתוכנה. גם לדלל את הקריאה החיץ, הניתן על ידי MSD, על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של 4x לקריאהחיץ למים מזוקקים 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לשטוף מתוארים בשלב 2.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של קריאת חיץ היטב כל אחד באמצעות פיפטה רבה. הימנעות בועות אוויר היא קריטית (pipetting ההפוכה היא שיטה מתאימה). לאחר תוספת של הקריאה החיץ, לסרוק את הצלחת בImager המגזר באופן מיידי. </li></ol>

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

בקשת פטנט מלאה תלויה ועומדת (בקשת מס &#39;סידורי 13/464, 466, פאב מס&#39; A1 ארה&quot;ב 2012 / 0,282,618 ותאריך. 05/04/12) כדי לקבוע את גורמי הסיכון הקשורים לפירוק ושחרור cMyBP-C לתוך נוזל גוף אדם ולכמת את רמת cMyBP-C בנוזלים בגוף אנושי.

במחקר זה, אנו מציגים את הישימות של immunoassay זמנית לגילוי של סמנים ביולוגיים בסרום לב מרובים מחולים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני ELISA המסורתי. ראשית, ECL בערכת assay משמש במקום זיהוי colorimetric. בECL, אות חשמלי מגרה את הייצור המקומי של הנכס נמדד (אור), ובכך שחרר את סוגר אירוע הגיר?...

המדידה של כמויות נמוכות של חלבון בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון סרום, היא בעלת חשיבות קלינית גוברת לניהול מטופל, כמו גם מדע בסיסי. לדוגמה, עלייה ברמות בסרום של סמנים ביולוגיים לב, כמו טרופונין I, בהגדרה קלינית היא בקנה אחד עם אוטם שריר הלב (MI) 1. כדי לזהות חלבונים בדגימות סרום, assay immunosorbent אנזים צמוד הסטנדרטי (ELISA) הוא הטכניקה משמשת לרוב כיש לו רגישות גבוהה ומאפשר לכימות מוחלטת של אנליטי. עם זאת, ELISAs המסורתי דורש כמות גדולה יחסית של מדגם (בדרך כלל 100 μl), יש לי אות רקע גבוהה בחלק מהנוזלים ביולוגיים, והם מוגבלים למדידת אחת בלבד אנליטי לELISA 2. לאחרונה, טכניקת immunoassay חדשה הוצגה שעוקפת רבים מחסרונות אלה. assay שונה זו, שפותח על ידי MSD, משתמש electrochemiluminescence (ECL) לזיהוי אות, אשר מאפשר רקע נמוך מאוד ורגישות מוגברת, מה שמאפשר שימוש בכרכי מדגם קטן. Electrochemiluminescence מבוסס על כתב מולקולת רותניום (השני) trisbipyridal, אשר מצורף לנוגדנים לזיהוי. מולקולת הכתב הזה פולט אור ב620 ננומטר על הגירוי החשמלי של החלק התחתון של צלחת 96 היטב שיש אלקטרודות פחם המשולבות בהם 3. כמו כן, על ידי שימוש בציפוי נקודה, יכולים להיות מצופים נוגדנים ללכוד מרובים לתוך אחד טוב (עד 10 על 96 גם צלחת), המאפשרים כימות בו זמני של חלבונים שונים במדגם יחיד 4. טכניקה זו לאחרונה נעשתה שימוש כדי למדוד את פרופילי ציטוקינים מעודדי דלקת בסרום 5,6. הצלחות זמנית מMSD להשוות בחיוב פלטפורמות זמנית assay אחרים 7. שימוש MSD כפלטפורמה העיקרית assay, אנחנו עוד פיתחה מנהג עשה צלחת 3-Plex שגבו זמנית לכמת את הרמה של לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C), MB קריאטין קינאז-(CK-MB), ולב טרופונין I (cTnI), והתוצאות הושוו עם זיהוי monoplex של cMyBP-C. CK-MB וcTnI הם סמנים ביולוגיים מבוססים היטב לאמ&quot;ן. עם זאת, יכולים להיגרם עליות של סמנים ביולוגיים אלה על ידי פתולוגיות אחרות מאשר אוטם לבבי, כגון דלקת שריר הלב או אי ספיקת כליות 8. זה טוען לתוספת של סמנים ביולוגיים נוספים כדי להגדיל את הספציפיות של אבחון אמ&quot;ן. הראנו לאחרונה כי cMyBP-C היא גם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לMI 9. cMyBP-C הוא חלבון קשור חוט עבה שבא לידי ביטוי בלב, 10-12 אך לא בשלד או חלקה שרירים. לפיכך, הרמה המוגברת של cMyBP-C במערכת הדם היא אינדיקטור מסוים לנזק בלב 13. במחקר זה, השווינו איתור uniplex של cMyBP-C עם שימוש assay 3-Plex מותאם אישית כדי למדוד את רמות סרום שלcMyBP-C, CK-MB, וcTnI בסרום של חולים עם אוטם לבבי. בעתיד, טכניקת חתימה זו עשויה לשמש כדי לאבחן MI בחולים עם הצגת כאבים בחזה בחדר המיון. מוסד ביקורת הלוח (IRB) של האוניברסיטה לויולה שיקגו אישרה את המחקר לשימוש בדגימות אדם deidentified ושימוש בimmunoassay (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

סמנים ביולוגיים הופכים להיות יותר ויותר חשובים בקבלת החלטות קלינית, כמו גם מדע בסיסי. אבחון אוטם שריר הלב (MI) הוא מונע במידה רבה על ידי גילוי לב חלבונים ספציפיים בסרום או הפלזמה של חולים כמדד לפגיעה בשריר לב. לאחר שהראה לאחרונה כי לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C) ניתן לזהות בסרום לאחר אוטם לבבי, יש לנו הצענו אותו כסמן ביולוגי פוטנציאל לאמ&quot;ן. סמנים ביולוגיים מזוהים בדרך כלל על ידי מבחני immunosorbent אנזים צמודי כריך מסורתי. עם זאת, טכניקה זו דורשת נפח דגימה גדול, יש לו טווח דינמי קטן, ויכולה למדוד רק חלבון בכל פעם. כאן אנו מראים immunoassay זמנית שבניתנים למדידה בשלושה חלבוני לב בו זמנית עם רגישות גבוהה. מדידת cMyBP-C יחד בuniplex או עם MB קריאטין קינאז וטרופונין לבי הראה רגישות דומה. טכניקה זו משתמשת בקנה מידת Meso דיסקברי(MSD) שיטת ריבוב בצלחת 96 היטב בשילוב עם electrochemiluminescence לצורך זיהוי. אמנם רק בנפחי מדגם קטנים נדרשים, רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול מושגות. שימוש בטכניקה זו, מדדנו I רמות בדגימות סרום מ -16 נבדקים עם MI cMyBP-C, מגה קריאטין קינאז, ולב טרופונין והשווה את התוצאות עם 16 נבדקי ביקורת. היינו מסוגל לזהות את כל שלושת הסמנים בדגימות הללו ומצאנו את כל שלושת סמנים להיות מוגבר לאחר אוטם לבבי. טכניקה זו היא, אם כן, מתאימה לגילוי של סמנים ביולוגיים רגיש לב בדגימות סרום.

את עקרונות היסוד ואת זרימת העבודה של assay 3-Plex מוצגים באיור 1, ואת זרימת העבודה הכוללת מתוארת בטבלה 1. מבחני Uniplex לעבוד יחד באותו עיקרון אלא שכל התחתית היטב מצופה בנוגדן ללכוד אחד. זיהוי אות נעשה על ידי ECL שבו אות חשמלי מוחל על תחתית הבאר. זה, בתורו, יוזם י?...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

a-sensitive-specific-quantitation-method-for-determination-serum

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Views.  Loyola University Chicago. סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

Video: A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...