This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).

.1 מים / שמן / מים זוגי אמולסיה Microsphere ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להכין 2% ו0.5% w / v פתרונות של אלכוהול פוליוויניל (PVA) במים ללא יונים. מערבבים את הפתרונות על 50 מעלות צלזיוס עד ברור, זה עלול לקחת כמה שעות. הכן פתרון של 2% v / v איזופרופיל אלכוהול במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה מימית של חלבון הידרופילי רצוי. הטבלה שלהלן מספקת ניסוחים ירושלים. </li></ol><img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> טבלת 1:. פתרונות חלבון דוגמא פתרונות החלבון הבאים כבר במארז בהצלחה וelectrospun שימוש בפרוטוקול זה. ניתן להשתמש בפתרוני חלבון הידרופילי אחרים לפי צורך. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 40 מ&quot;ל של פתרון PVA 0.5% לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל ומניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל לפזר 300 מ&quot;ג של 65:35פולי (חומצה לקטית גליקולית שיתוף) (PLGA) ב 3 מ&quot;ל של dichloromethane. מיקסר מערבולת ניתן להשתמש כדי להאיץ את פירוק PLGA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 200 μl של פתרון חלבון ו4 μl של 2% פתרון PVA. יוצקים את תערובת החלבונים לתוך תמיסת PLGA (צעד 1.4). הפתרונות יישארו בעיקר נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך כוס של מי קרח. באמצעות sonicator שרביט ב ~ 10 ווטס (RMS), להתסיס את הפתרון לכמה שניות (5-10) ועד תחליב לבן וקרם אחיד נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התחליב לתוך צינור 50 מ&quot;ל מכיל 0.5% PVA (שלב 1.3). מערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 20 שניות. הפתרון יהיה לפתח עכירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התחליב לכוס 200 מ&quot;ל ומניחים על צלחת ומערבבים ב350 סל&quot;ד למשך 2 דקות. הוסף 50 מ&quot;ל של 2% באלכוהול רפואי לכוס בצלחת ומערבבים. אפשר התערובת להמשיך ערבוב מינימאלי של שעה 1 כדי לאפשר DCM להתאדות וPLGA להקשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה tהוא microsphere פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב425 XG במשך 3 דקות. Microspheres יאסוף בחלק התחתון של הצינור ומופיע לבן. מוציא בזהירות את supernatant מהצינור, מעל microspheres, ולאחסן בבקבוק 500 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את microspheres עם מים ללא יונים על ידי מילוי הצינור שלושה רבעים מלאים וטלטלת אותה כדי להפיץ את microspheres בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.10 &amp; 1.11 ארבעה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות השטיפה הסופית, להסיר את supernatant שוב ומניחים בבקבוק 500 מ&quot;ל עם דוגמאות האחרות. להקפיא את microspheres שנאסף בצינור צנטריפוגות, אז Lyophilize לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את microspheres תחת מיקרוסקופ אור או עם מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. Microspheres לא גדול יותר 60 מיקרומטר הוא לelectrospinning היעיל. אם microspheres הם גדול מדי, פעמים sonicating או vortexing יותר עשויות להידרש בשלב 1.6 או 1.7. </li> &lt;li&gt; חנות microspheres המיובש במקפיא -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: השתמש assay חלבון, לפי הוראות יצרן, כדי לבדוק את כמות החלבון בבקבוק 500 מ&quot;ל מצעד 1.10 30. זה משמש לחישוב אחוזים של חלבון במארז בmicrospheres, על ידי הפחתת הכמות בפתרון ממה שהיה בשימוש בתהליך הייצור. </li></ol> הערה: כדי להמחיש את מיקום החלבון בmicrosphere להוסיף Rhodamine 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל לפתרון PLGA 31 ובלתמצת חלבון מצומדות FITC איור 1 מציג דוגמא.. .2 Electrospinning עם מיקרוסכמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פתרון electrospinning, ליצור פתרון 0.5% w / v של photoinitiator, במים ללא יונים על ידי ההמסה על 37 מעלות צלזיוס. תהליך זה יכול להימשך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 2% w / v methacrylated חומצה היאלורונית (מהא) (ראה Burdick et al. לסינתזה) 29, 3%w / v 900 פולי KD (אתילן אוקסיד) (PEO) ו0.05% w / פתרון יוזם התמונה v במים ללא יונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמות הנכונה של מהא וPEO לעצמה הרצויה. לדוגמא, 10 מ&quot;ל של electrospinning פתרון דורש 200 מ&quot;ג של מהא ו300 מ&quot;ג של PEO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את PEO במים ללא יונים ב90% מהנפח הסופי הרצוי (9 מ&quot;ל לדוגמא זו). זה עלול לקחת כמה שעות, צלחת מחוממת ומערבבים או אמבט מים ב 37 C ° ניתן להשתמש כדי להאיץ את התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להוסיף מהא ולהשתמש במיקסר מערבולת לעורר הפתרון עד בהיר. זה ייקח רק כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להוסיף את פתרון יוזם תמונה 0.5% למלא את שאר 10% הנפח (מ&quot;ל 1 לדוגמא זו). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת microspheres בריכוז הרצוי עד 400 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מערבבים את הפתרון על מיקסר מערבולת עד microspheres מפוזר באופן שווה בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון למזרק ולצרף bl 18 מד 6 אינץמחט קצה UNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק במשאבת מזרק ולהגדיר אותו לוותר ב1.2 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת שכבה של נייר אלומיניום על צלחת האוסף או mandrel. זה מאפשר לעד קל נקי ואחסון של הפיגום המוגמר. Mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים. צלחת שטוחה או mandrel הנייח תגרום לסיבים מסודרים באופן אקראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את חוט הקרקע מכוח מקור מתח גבוה למנגנון הגבייה. חבר את התקע החיובי למחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את פני השטח משאבת מזרק וגבייה, כך שיש 15 סנטימטר בין קצה המחט ומשטח אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל שאיבת הפולימר, כאשר הפתרון נראה לעין בסוף המזרק, להפעיל את מקור המתח ולהגדיר את המתח ל24 ק זהירות:. ברגע שהמתח מופעל לא לגעת בשום חלק מתכתי של המערכת. תשלום יכול גם לקפוץ למרחקים קצרים מחלקים חשמליים לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפתרון עד דעובי פיגום esired מושגת. כשיושלם לכבות מקור מתח ומשאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רדיד עם פיגום מצורף. פיגומים שהושלמו מכילים חלבון מאוחסנים ב-20 ° C מקפיא. </li></ol> .3 חלבון את הפעילות הביולוגית של הבדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבית תאים. הוסף 10% v / v בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין / v v, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין V / V לבינוני של הנשר השתנה Dulbecco. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית בחר שמתאים לחלוטין לצלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 methacrylate propyl (Trimethoxysilyl) לטיפול בcoverslips כפי שתואר על ידי היצרן. Methacrylation משפר דבקות פיגום לcoverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף coverslips methacrylated לאזור האוסף של electrospinner עם קלטת דו צדדית נשלפת לפני electrospinning. ספינינג על coverslips מקל טיפול וצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin לעובי רצוי כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חרה electrospinning להסיר בזהירות coverslips מmandrel. מניחים את הפיגום coverslips המצופה לתוך תא חנקן ברור ולהבטיח כי כל החמצן מטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר והפיגום תחת 2 ננומטר 365 אור 10 mW / cm במשך 15 דקות. לאחר crosslinking מקום לצלחת גם בגודל המתאים. ודא שצד הפיגום פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי מקום מתחת לפנס קוטל חיידקים ל30 דקות לעקר. אם פיברונקטין הרצוי או חלבון אחר משמש כציפוי כדי לשפר את הידבקות תא. עקוב אחר ההוראות של היצרן לפיגומי מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הגבי שורש הגרעינים (DRG) כפי שתוארו בעבר על ידי הולנבק 32. DRG אחד יהיה צורך לכל coverslip פיגום מכוסה נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 100-200 μl של תקשורת על כל פיגום בצלחת גם. בזהירות להניח DRG אחד על כל פיגום בטיפת התקשורת. לפיגום עבה ייתכן שתהיה צורך יותר בתקשורת; DRG צריך להיות שקוע באופן מלא ולא floaטינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפיגום וDRG על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לתא לדבוק בפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את התקשורת לרמה המתאימה להיטב ומניח בחזרה לתוך החממה. המשך דוגרים במשך 4-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה להסיר בזהירות את התקשורת מכל טוב ולשטוף בעדינות פעם עם PBS. תקן תאים ל30 דקות באמצעות 4% w / paraformaldehyde v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם באמצעות כתם נוגדן לneurofilament. זה יאפשר הדמיה של התוצאה neurite לכימות. גם DAPI יכול לשמש לצפייה בגרעינים של התאים. פרוטוקול דוגמא מכתים תואר על ידי Sundararaghavan ועמיתים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת גם על הבמה של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את מסת התאים באמצעות הגדרות מסננת ועירור לDAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא הוא לעבור את המסנן לFITC לדמיין neurites המורחבת. Uלשיר פונקצית התפר במיקרוסקופ לאסוף ולשלב תמונות רבות ככל נחוץ כדי לראות את המבנה כולו. חזור על פעולה עבור DAPI, FITC ושדה בהיר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+in+neural+tissue+engineering.">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li><li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering:+strategies+for+repair+and+regeneration.">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li><li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats.">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li><li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves.">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li><li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds.">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li><li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair.">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li><li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair.">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li><li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).</li><li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+nerve+guides:+materials,+fabrication,+growth+factors,+and+cell+delivery.">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li><li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li><li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczy&#324;ska, I., J&#281;drzejowska-Szypu&#322;ka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review.">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li><li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications:+perspectives+and+challenges.">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth.">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li><li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches.">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro.">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li><li>Casta&#241;o, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration.">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li><li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers.">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li><li>Han, D., Gouma, P. -. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix.">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li><li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering.">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li><li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering.">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li><li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits.">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture.">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior.">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li><li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery:+current+technologies+and+selected+biomedical+applications.">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li><li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications.">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>P&#233;an, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles.">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li><li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells.">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li><li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).</li><li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres.">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li><li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen.">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li><li>Madduri, S., di Summa, P., Papalo&#239;zos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats.">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor.">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li><li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration.">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications.">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+proteins+in+poly(L-lactide-co-caprolactone)+fibers+by+emulsion+electrospinning.">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li><li>Wang, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration.">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li><li>Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly(lactic+acid-caprolactone)/nerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning.">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מחקרים רבים הראו שיכולים להיות מופנה תאי עצב על ידי רמזים טופוגרפיים (יישור סיבים) ואותות כימיים (גורמי גדילה) 1,2,10,11,35. Electrospinning הוא שיטה קלילה כדי ליצור סיבים מיושרים. גורמי גדילה לעודד צמיחת עצב אלא כדי לכלול אותם לתוך תעלות עצבים (NC), נדרשת שיטה לשחרור מושהה. כד?...

אחד האתגרים המתמשכים בהנדסת רקמות עצבית הוא יצירת צינור עצבי (NC) המחקה את המטריצה ​​סלולרית נוספת, שבו עצבים לגדול באופן טבעי. מחקרים הראו כי תאים מגיבים למספר גורמים בסביבה שלהם, כולל מכאני, טופוגרפי, דבק ואותות כימיים 1-3. אחד האתגרים העיקריים בתחום זה הוא קביעת השילוב המתאים של אותות ובודת מערכת שיכול לשמור על רמזים לתקופה ממושכת כדי לתמוך בצמיחת תא 4. נוירונים היקפיים ידועים מעדיפים מצע רך, יופנה על ידי סיבים מיושרים, ומגיב לגורם גדילה העצבית (NGF) 5-7. NCS שיכול לספק רמזים כימיים לשבועות הוכח לספק התאוששות תפקודית משופרת קרוב יותר לזה של allografts, תקן הזהב הנוכחי לתיקון עצב 8,9. שונות חומרים ושיטות ייצור יכול לשמש לייצור מכאני וטופוגרפיאל מקלות 10-13. רמזים מכאניים הם גלום בחומר שנבחר, מה שהופך את הבחירה של החומר המתאים ליישום הקריטי 1,13. שיטות ייצור כדי לשלוט רמזים טופוגרפיים כוללים הפרדה פאזות, הרכבה עצמית וelectrospinning 1,13. גם עבור יישומי microscale, מיקרופלואידיקה, photopatterning, תחריט, מדיח מלח, או קצף גז יכול לשמש 14-17. Electrospinning התפתח כדרך הפופולרית ביותר למהנדס מצעים סיביים לתרבית רקמה בשל גמישות וקלות הייצור 13,18-23. nanofibers electrospun מיוצר על ידי יישום מתח גבוה לפתרון פולימר גורם לו להדוף את עצמו ולמתוח על פני פער קצר לפרוק 24. פיגום מיושר ניתן ליצור על ידי איסוף הסיבים על mandrel מסתובבת מקורקע ופיגומים הבלתי מזדהים נאספים על צלחת נייחת 25. איתות הידבקות יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי שנינות פיגום הסיבייםפיברונקטין h או להטות פפטיד הידבקות, כגון RGD, לHA לפני electrospinning 26. אותות כימיים, כגון גורמי גדילה, הם הכי קשים לשמור לאורך תקופות ממושכות, כי הם זקוקים למקור לשחרור מבוקר. מערכות רבות כבר ניסינו להוסיף שחרור מבוקר לרשתות סיבי electrospun עם רמות שונות של הצלחה. שיטות אלה כוללות electrospinning תערובת, electrospinning תחליב, electrospinning פגז הליבה והצמיד חלבון 27. בנוסף, electrospinning נעשה באופן מסורתי בממס נדיף, אשר יכול לפגוע בכדאיות של החלבון 28, לכן שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבון יש לקחת בחשבון. גישה זו מציינת במפורש בשילוב אותות מכאניים, טופוגרפיים, כימי ודבק כדי ליצור פיגום מתכונן לצמיחת עצבים היקפית. מכניקת פיגום נשלטת דווקא על ידי סינתזהmethacrylated חומצה היאלורונית (HA). אתרי methacrylation משמשים לצרף crosslinkers תגובתי תמונה. חומר crosslinked הוא כבר לא מסיסים במים ומתפרק באופן בלעדי על ידי אנזימים 29. הסכום של crosslinking משנה את קצב הפירוק, מכניקה ומאפיינים פיזיים אחרים של החומר. באמצעות HA עם 30 methacrylation%, שבו יש מודול מתיחה של ~ 500 אבא, יוצר מצע רך שקרוב למכניקת הילידים של רקמה עצבית, והוא העדיף בדרך כלל על ידי נוירונים 26,29. Electrospinning על mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים לאות טופוגרפית. באמצעות electrospinning יחד עם microspheres מספק אותות כימיים בתוך הפיגום לאורך תקופות ממושכות. כדי לתמוך בmicrospheres צמיחת neurite מכיל NGF המשמשים ליצירת האות הכימית. שלא כמו רוב חומרי electrospun HA הוא מסיס במים ולכן NGF אינו נתקל ממסים קשים במהלך ייצור. כדי להוסיף אות דבק, SCAffold מצופה פיברונקטין. המערכת הושלמה מכילה את כל ארבעת סוגים של אותות שתוארו לעיל: סיבים רכים (מכאניים) מיושרים (טופוגרפיים) עם NGF שחרור microspheres (כימי) מצופה בפיברונקטין (דבק). ייצור ובדיקה של מערכת זו מתוארת בפרוטוקול זה. התהליך מתחיל בייצור של microspheres עם זוגי אמולסיה מים-ב- שמן מים. התחליב הוא התייצב עם חומרים פעילי שטח, פוליוויניל אלכוהול (PVA). שלב המים הפנימי מכיל את החלבון. כפי שהוא הוסיף לשלב שמן, המכילים את חומר מעטפת PLGA מומס בdichloromethane (DCM), פעילי השטח יוצר מחסום בין שלבי הגנה על החלבון מDCM. אמולסיה זו היא יותר מאשר מפוזרת בשלב מים אחר המכיל PVA כדי ליצור את המשטח החיצוני של microspheres. התחליב היציב הוא עורר לאפשר DCM להתאדות. לאחר השטיפה וlyophilizing אתה נשאר עם המשך microspheres היבשaining החלבון. לאחר microspheres הושלם הם מוכנים להיות electrospun לפיגומים. ראשית, עליך להכין את פתרון electrospinning. הצמיגות של הפתרון היא קריטית להיווצרות סיבים נכונה. פתרונות של HA הטהור אינם עומדים בדרישה זו; PEO נוסף כפולימר מנשא כדי לאפשר electrospinning. Microspheres מתווספים לפתרון וelectrospun וכתוצאה מפיגום סיבי עם microspheres מופץ ברחבי. ברגע שהייצור הוא מלא, החלבון צריך להיבדק כדי לוודא את כדאיותה. כדי לעשות זאת, ניתן להשתמש בו תא ראשוני המגיב לNGF. פרוטוקול זה משתמש הגבי שורש הגרעינים (DRG) מעוברי עופות ישנים 8-10 יום. חבילות התא הם זורעים על גבי פיגומים המכילים microspheres מלא NGF או אלה כי הם ריקים. אם NGF הוא עדיין בת קיימא אתה צריך לראות צמיחת neurite משופרת על הפיגומים המכילים NGF. אם NGF הוא כבר לא בת קיימא זה יהיהלא לקדם neurites להרחיב ואמורה להופיע דומה לשליטה. ההליך המדויק שתואר במסמך זה מתמקד בתמיכה עצבית, לעומת זאת, עם שינויים פשוטים לחומר, שיטת electrospinning, וחלבוני המערכת יכולה להיות מותאמת לסוגים שונים של תאים ורקמות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DAPI</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:139px;">D1306</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Irgacure 2959</td>
			<td style="width:208px;">BASF</td>
			<td style="width:139px;">24650-42-8</td>
			<td style="width:291px;">Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PEO 900 kDa</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:139px;">189456</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
			<td style="width:208px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:139px;">23591-100</td>
			<td style="width:291px;">Prepare stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:208px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:139px;">KDS100</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Power Source</td>
			<td style="width:208px;">Gamma High Voltage</td>
			<td style="width:139px;">ES30P-5W</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Motor</td>
			<td style="width:208px;">Triem Electric Motors, Inc</td>
			<td style="width:139px;">0132022-15</td>
			<td style="width:291px;">Must attach to a custom built mandrel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tachometer</td>
			<td style="width:208px;">Network Tool Warehouse</td>
			<td style="width:139px;">ESI-330</td>
			<td style="width:291px;">Use to monitor mandrel speed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
			<td style="width:208px;">EXFO</td>
			<td style="width:139px;">S1000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Needles</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-825-16H</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Coverslips</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-545-81</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Polyvinyl Alcohol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Isoporopyl Alcohol</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">I9030-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP9703-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">BSA-FITC</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">080M7400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">&#946;-Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td style="width:208px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:139px;">1156-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:139px;">1001554270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">34856-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Coomassie (Bradford) Protein Assay</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">1856209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:139px;">1001558456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:139px;">12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FBS</td>
			<td style="width:208px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:139px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PBS</td>
			<td style="width:208px;">Hyclone</td>
			<td style="width:139px;">SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Pen-Strep</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:208px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:139px;">A11313&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrospinning growth factor releasing microspheres into fibrous scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Microspheres 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר עם אנקפסולציה חלבון מעל 85% הופקו באופן עקבי וelectrospun לפיגומים. גודל נקבע על ידי הדמיה דגימות של microspheres משלוש מנות ייצור נפרדות. התמונות שבו נתפסו על מיקרוסקופ אופטי ואורכים שבו נמדד באמצעות תוכנת מעבדה מסחרית. איור 1 מציגה היסטוגרמה...

Watch this Scientific Journal Video about Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds at JoVE.com

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Views.  Wayne State University. This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Video: Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

יסודות Electrospinning: פתרון אופטימיזציה פרמטרים Apparatus

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...