Este trabalho foi financiado por um americano Fellowship Heart Association Predoctoral para JLI e National Institutes of Heath conceder R01AR056624.

A. Único Polymer Electrospinning <ol><li> Antes de preparar a solução de eletrofiação, faça uma solução 0,5% em peso do fotoiniciador, IRGACURE 2959 (I2959), em água deionizada, dissolvendo a 37 ° C por vários dias. Este passo não é necessário se um polímero fotorreativas não está sendo usado. </li><li> Combine ácido hialurônico methacrylated (MEHA, ver Burdick et al. Para a síntese), poli (óxido de etileno) (PEO, 900 kDa), e I2959 em água deionizada para preparar uma solução com uma concentração final de 2% em peso MEHA, 3% em peso PEO, e 0,05% em peso I2959. Use um vórtice para misturar a solução até que fique claro. O tipo de polímero e concentração, bem como o solvente usado pode ser modificado nesta etapa, dependendo das propriedades desejadas andaime. </li><li> Transferir a solução para uma seringa e anexar uma calibre 18, seis polegadas de comprimento, agulha de ponta cega até o fim. </li><li> Bomba de programa de uma seringa para ejetar a uma taxa de 1,2 mL / hr. Inserir a seringa ea agulha para o dispositivo. </li><li> Anexar a liderança fundamentada de uma fonte de alta tensão para o aparelho de coleta. Para coletar aleatoriamente distribuídos fibras usar uma placa de metal lisa, ou usar um mandril girando a ~ 10 m / s para coletar fibras alinhadas. Anexar a liderança com carga positiva para a agulha. Veja a Figura 1 para um esquema do aparelho eletrofiação. </li><li> Ajustar a agulha ou dispositivo de recolha, de modo que há uma distância de 15 cm entre os dois. </li><li> Iniciar o fluxo da bomba de seringa. Quando o fluido é visualizada na ponta da agulha, ligue a fonte de alimentação e definir a tensão de 22 kV. </li><li> Após a coleta é completo (a partir de vários minutos para filmes finos, com até 24 horas para um mais grosso tapete), remova o andaime do aparelho de coleta e armazená-lo sob vácuo durante a noite para garantir a remoção completa do solvente. </li><li> Visualizar a morfologia da fibra através de microscopia eletrônica de varredura (MEV), representante de um andaime é mostrado na Figura 1 para ambas as estruturas alinhadas e não-alinhados. </li></ol> Nota: O caudal da amostra, a distância para o dispositivo de recolha e de tensão dependem da combinação de polímero e solvente e devem ser otimizados para cada sistema, normalmente por meio da observação da morfologia andaime com SEM. B. Photocrosslinking e Photopatterning <ol><li> Cortar amostras 5 milímetros X 5mm do tapete andaime. </li><li> Prepare-se para crosslinking, colocando cada um andaime em uma folha de lâmina de vidro coberta, colocando a fotomáscara diretamente no cadafalso, cobrindo com uma lâmina de vidro limpa e clipping ambas as extremidades com grampos da pasta. Nota: quatro amostras pode ser feito de uma só vez, e uma transparência sem um padrão pode ser usado para crosslinking se um padrão não é desejada. </li><li> Purge andaime montado em uma câmara de nitrogênio. É importante manter a construir livre de oxigênio, que pode inibir a reticulação. </li><li> Configuração local andaime na câmara de nitrogênio em ~ 10 mW / cm 2 luz de 365 nm com um adaptador de colimação por 5 minutos. Ver esquema na Figura 2. </li><li> Retire cada scaffold e coloque em um prato de 12 poços. </li><li> Adicionar 2 mL de água deionizada em cada poço, a placa de parafilme para evitar a evaporação da água e coloque a 37 ° C por 24 horas. Troque a água três vezes. </li><li> Visualize formação de poros em microscópio de luz (ver exemplo na Figura 2). Os andaimes estão agora prontos para uso. </li></ol> Nota: Photocrosslinking não é necessário para muitos tipos de polímeros, no entanto photopatterning só pode ser usado com polímeros fotorreativas. C. Dupla Polymer Electrospinning com Fluorescente Visualization Fiber <ol><li> Prepare uma solução 5% em peso de PEO (200 kDa) em etanol 90%. Mexa a 700 rpm a 50 ° C por pelo menos 2 horas antes da eletrofiação. </li><li> Transferir a solução PEO a uma seringa e adicionar DAPI para uma concentração final de 10 concentração mg / mL na solução eletrofiação. Enrole a seringa na folha de alumínio para proteger da luz. </li><li> Prepare a mesma solução descrita na etapa A2, com exceção também adicionar methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamina B (MeRho, 683,24 g / mol) para uma concentração final de 25 mM na solução eletrofiação. Enrole a seringa na folha de alumínio para proteger da luz. </li><li> Com cuidado, use fita adesiva para garantir lamínulas de vidro methacrylated (ver Khademhosseini et al.) Para a superfície do mandril. Nota: as fibras ficarão amarrados em lamínulas de vidro methacrylated. </li><li> Conecte uma extremidade de um pedaço 5 mm de comprimento de tubo de silicone com anexos luer lock para uma das seringas e anexar a outra extremidade a uma agulha. Inserir a seringa na bomba de seringa e colocar a agulha através do orifício na fazendeiro. Repita com a outra seringa e fazendeiro no lado oposto do mandril. Os lavradores traduzir o llength do mandril e são usados ​​para garantir uma distribuição igual dos dois polímeros no andaime resultante. Ver esquema na Figura 3. </li><li> Ajustar os parâmetros descritos na secção A forma adequada de acordo com a Tabela 1. Garantir que as pontas de agulha são centradas no mandril. Tabela 1. Dupla Polymer Parâmetros Electrospinning <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Seringa </td><td> Fazendeiro a ponta da agulha (cm) </td><td> Dica agulha para Mandril (cm) </td><td> Vazão (mL / hr) </td><td> Tensão aplicada (kV) </td></tr><tr><td> MEHA </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1,2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li> Depois que tudo estiver alinhado corretamente, desligue as luzes e ligar o mandril e as bombas de seringa. Remova o papel alumínio do seringas. Quando o fluido é visível nas pontas de ambas as agulhas, simultaneamente ligar as fontes de alimentação e conecte os fazendeiros. </li><li> Quando a coleta for concluída, desligue a fontes de alimentação e desconecte o mandril e lavradores. Remova cuidadosamente as lamelas e fita usando uma lâmina de barbear. </li><li> Visualize as fibras utilizando um microscópio de fluorescência equipado com filtros para rodamina e DAPI. Veja o exemplo na Figura 3. Nota: fibras fluorescentes são mais claros para ver quando electrospun por curtos períodos de tempo (&lt;3 minutos), no entanto, este processo pode ser prorrogado por uma quantidade ilimitada de tempo para criar construções mais espesso, especialmente sem o uso do lamínulas de vidro . </li></ol> Células Seeding D. em Andaimes <ol><li> Coloque cada lamela com electrospun polímero anexado em um indivíduo bem de uma placa de tamanho adequado também. Nota: interações celulares com as fibras são facilmente visíveis por eletrofiação em lamínulas de vidro methacrylated. Além disso, MeRho pode ser novamente utilizado para a visualização de fibra. </li><li> Incubar os andaimes em PBS durante a noite para garantir a remoção completa do solvente e qualquer lixiviável possíveis subprodutos. </li><li> Remover o PBS dos poços. </li><li> Para esterilizar os andaimes, colocá-los sob uma lâmpada germicida de uma capela de fluxo laminar por 30 minutos. Se um andaime completo está sendo semeada, flip do andaime e coloque sob uma lâmpada germicida por mais 30 minutos. </li><li> Realizar cultura de células padrão e preparar uma suspensão de células concentradas na densidade de célula desejada (por exemplo, 6.000 células cm -2). Por exemplo, usar um 100 mL de suspensão celular por um 22 mm X 22 mm lamela. Lugar na incubadora por 1 hora. </li><li> Adicionar a quantidade adequada de meios de cultura de células em cada poço. Coloque o andaimes de volta para a incubadora. </li><li> Mancha as células usando um kit comercialmente disponível Live / Dead. Nota: outros tipos de coloração de células, tais como DAPI (núcleos celulares) e phalloidin fluorescente etiquetado (fibras de actina estresse) pode ser aplicado para visualizar as células. </li><li> Visualize as células e fibras usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros para TRITC e FITC. Veja o exemplo na Figura 4. </li></ol> Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquemático ilustrando a configuração do dispositivo para não-alinhados formação andaime (superior) e formação alinhada andaime (parte inferior). Exemplo, imagens de microscopia eletrônica de varredura de cada tipo de andaime são mostrados. Barra de escala = 5m. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquemática do método de padronização. Padrões são formadas pela colocação de um fotomáscara entre a fonte de luz e andaimes durante photocrosslinking e depois lavar polímero não reagiu. Fotomáscara e SEM imagem de andaimes após a formação dos poros e liofilização. Barra de escala = 100 mm. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3 Esquema da configuração electrospinning multi-polímero e parâmetros de processamento necessários, bem como uma imagem representativa fluorescentes de uma mistura de duas populações de fibra (exemplo: vermelho e azul MEHA PEO). Qual foram simultaneamente electrospun para formar um andaime multi-polímero . Barra de escala = 100 mm. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">clique aqui</a> para ver um maior version da figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4" /> Figura 4. Um exemplo de imagem coloração Live / Dead of células-tronco mesenquimais e suas interações com as fibras electrospun. Barra de escala = 100 mm. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 4.

<ol>
	<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications.">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li><li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment.">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li><li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+on+the+Straight+and+Narrow:+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration.">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li><li>Sill, T. J., Von Recum, H. a. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , (2009).</li></ol>

Eletrofiação foi usado para preparar andaimes fibroso a partir de polímeros. Photocrosslinkable andaimes à base de ácido hialurônico foram usadas como um exemplo ilustrativo, onde a exposição à luz é necessário para a reticulação. Com o uso de macromers reativa, como MEHA, canais que já demonstrou melhor distribuição celular foram incorporados ao andaimes com o uso de uma máscara durante photocrosslinking andaimes para formar macro e micro-porosa. Além disso, dois polímeros distintos foram simultaneam...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DAPI</td>
<td> Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 200 kDa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>17503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 900 kDa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>189456</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591-100</td>
<td>Prepare stock solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead Stain Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>Equipment</td>
<td>KD Scientific</td>
<td>KDS100</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Power Source</td>
<td>Equipment</td>
<td>Gamma High Voltage</td>
<td>ES30P-5W</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Motor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triem Electric Motors, Inc</td>
<td>0132022-15</td>
<td>Must attach to a custom built mandrel</td>
</tr>
<tr>
<td>Tachometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Network Tool Warehouse</td>
<td>ESI-330</td>
<td>Use to monitor mandrel speed</td>
</tr>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51135K151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Female Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K293</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Male Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14-825-16H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Corning</td>
<td>2875-22</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture

Como o campo da engenharia de tecidos evolui, há uma enorme demanda para a produção de materiais mais adequados e técnicas de processamento, a fim de atender aos requisitos (por exemplo, mecânica e vascularização) de órgãos e tecidos mais intrincados. Eletrofiação é uma técnica popular para criar andaimes fibroso que imitam a arquitetura ea escala de tamanho da matriz extracelular nativa. Estes andaimes fibroso também são úteis como substratos de cultura de células já que as fibras podem ser usadas para orientar o comportamento celular, incluindo a diferenciação de células-tronco (ver extensas revisões por Mauck<em&gt; Et al.</em&gt; E Sill<em&gt; Et al.</em&gt; Para mais informações). Neste artigo, descrevemos o processo geral de eletrofiação polímeros e como um exemplo, um ácido hialurônico electrospin reativos capazes de reticulação com exposição à luz (ver Ifkovits<em&gt; Et al.</em&gt; Para uma revisão sobre os materiais photocrosslinkable). Também introduzimos capacidades de processamento, tais como: photopatterning e multi-polímero de formação de andaime. Photopatterning pode ser usado para criar andaimes com canais e multi-escala de porosidade para aumentar a infiltração celular e distribuição do tecido. Multi-polímero de andaimes são úteis para ajustar melhor as propriedades (mecânica e degradação) de um andaime, incluindo a porosidade sob medida para infiltração celular. Além disso, estas técnicas podem ser estendidas para incluir uma grande variedade de polímeros e macromers reativa para criar andaimes complexos que fornecem as pistas necessárias para o desenvolvimento de construções de tecido bem sucedida de engenharia.

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Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

O processo de eletrofiação polímeros para engenharia de tecidos e de cultura de células é abordada neste artigo. Especificamente, o electrospinning de macromers fotorreativas com capacidades de processamento adicional de photopatterning e multi-polímero eletrofiação é descrito.

Eletrofiação Andaimes Polymer fibrosos para Engenharia de Tecidos e Cultura de Células

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

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Biology

21.4K visualizações.  University of Pennsylvania. O processo de eletrofiação polímeros para engenharia de tecidos e de cultura de células é abordada neste artigo. Especificamente, o electrospinning de macromers fotorreativas com capacidades de processamento adicional de photopatterning e multi-polímero eletrofiação é descrito.