המחברים רוצים להכיר לעזור יסולא בפז של: ד&quot;ר ניל הראשונה Kourtney וילקינסון עבור עריכת כתב היד, ד&quot;ר לוסי Senter, ד&quot;ר Brigit Willeford ומייק Basett לסיוע בטיפול הדרכה חיה במתקן ALAC MSU העכבר מוכר; ד&quot;ר דוויין וייז עבור עזרתו עם מיקרוסקופיה לכידת תמונה: סזאר מונרוי, חנה Swoope, ובובי Huddleston על עזרתם עם ייצור וידאו MSU. מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר המוסדיים ואת המחלקה למדעי הביולוגיה על מיסיסיפי סטייט.

חלק 1: laparotomy עכבר בהריון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש נקע בצוואר הרחם, להרדים עכבר בהריון C57BL6J נקבה ב 10.5-11.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הבטן עם סבון מיקרוביאלית, ולאחר מכן, לגלח אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גילוח, לשטוף את הבטן עם מלוחים פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לייבש את הבטן עם גזה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העכבר עם שדה סטרילית חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך הגחון באמצעות מלקחיים ומספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולהסיר את הרחם כולו מתוך חלל הבטן. עוברי עכבר יוצג בתוך הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרחם לתוך צלחת פטרי מלא D-PBS, ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי מלקחיים, להסיר את השלייה ורקמות נוספות העוברית של העובר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לתוך צלחת פטרי טרי מלא D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אורך של עוברי עכברים. מצאנו כי בגדלים שונים בהתאם לגיל העובר. לדוגמה 8.5 DPC נמדד בקצב ממוצע של 6 מ&quot;מ, נמדד 10.5 DPC בקצב ממוצע של 11mm, ו - 12.5 DPC נמדד ממוצע של 16 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להסיר את זנבותיהם להפקת DNA. </li></ol> חלק 2: Dissection רידג&#39; האשכים תחת stereomicroscope ואת מקור אור שוט Fostec <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר סינון בצלחת פטרי. ואז, במקום העובר העכבר על גבי נייר הסינון לייבש את העובר ואת לשתק לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך רוחבי של העובר העכבר מעל המקור של חבל הטבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת stereomicroscope, באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי מחט סטרילית מתגרה בסדר, להסיר את המעיים והכבד כל כך את מערכת השתן גלוי. הכליות ממוקמות רוחבית בחלל הבטן, ואת שלפוחית ​​השתן ממוקמת המדיאלי ואת הזנב בהשוואה הכליות. העובר יכול להיות מזוהה כזכר כי רכסי האשכים נמצאים משני צדי השלפוחית. אצל האשה, הרכסים האשכים מחוברים בחוזקה עד הסוף לרוחב הזנב של הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולפים את רכס האשכים על ידי הזזה מחט מאחורי זה. רכס האשכים מוסר על ידי חיתוך משם הרקמות התומכות בה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רכסי האשכים כדי בצלחת פטרי חדש מלא טרי D-PBS. מיקרוסקופית, רכס האשכים הגברי צריך להיות חשוף, גדולים בצורת אליפסה. לעומת זאת, רכס האשכים הנשי צריך להיות הבחינו, יש צורה מאורכת ולהיות קטן ביחס הרכס האשכים הגברי. </li></ol> חלק 3: עיכול רידג&#39; האשכים תחת stereomicroscope: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection כלית בינים: אשך נפרדת מן כלית בינים לבין רכס באמצעות מחט דק וחד. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להסיר את כלית בינים מן הרכס האשכים כי זה רקמות סומטיות כי יהיה לגדול יותר בתהליך הגזירה PGC. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול רידג&#39; האשכים: איסוף רכסים האשכים נקי ירידה 0.5ul של טרי D-PBS. הוסף 20 מ&quot;ל של פתרון collagenase / Dispase (ריכוז סופי ב 1mg/ml). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים צריך להיות מעובד בנפרד. כל העובר צריך לבד נפרד שכותרתו שלה צלחת פטרי. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האשכים רידג&#39; ממינסינג: חותכים את רכס האשכים לחתיכות קטנות באמצעות מחט סטרילית מלקחיים בסדר סטרילי מס &#39;4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה: צלחות פטרי מועברים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה יכול להשתנות בין רקמות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetting: לאחר 15 דקות, הרקמה יכולה להיות מנותקת על ידי pipetting. שימוש pipettes משך נימי זכוכית בקטרים ​​בין 40 -100 מ&quot;מ לשבור את השברים על ידי pipetting למעלה ולמטה. זה יהיה בצורת גושים קטנים. העברת גושי כדי 0.5ml של ירידה מראש D-PBS חימם עבור לשטוף סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, העברת גושי לצינורות Eppendorf. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל מעל לחשוף את רקמות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תעשו ההשעיה תא בודד. זה חשוב להקמת המושבה. אם זו השעיה תא בודד, PGCs נוטים לבדל ולנדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך זה לא צריך להיות יותר מ 20 דקות, או תאים שלך תאבד את הכדאיות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 2000 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר centrifuging, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור בתוך 0.5 מ&quot;ל של לדפוק את שיושלם מדיה (Pre-התחמם ב 37 מעלות צלזיוס). </li></ol> חלק 4: התרבות תאים שן ז&#39;רמינל &quot;אתה צריך לבצע את הצעדים הבאים מהר כדי לשמר את הכדאיות של PGCs עבור בידוד הגזירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני התהליך הזה אתה צריך להכין מומת mitotically-MEF CF1 מזין שכבת בעקבות פרוטוקול מ ג&#39;אנג ג&#39;יי et al 2008. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 20 מנות עבור pregna onent נקבה העכבר (6-8 עוברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEFs מאבדים את היכולת להיות שכבה מזין (לקדם את הצמיחה ולמנוע בידול) אחרי 5-6 קטעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש MEFs יותר מ -48 שעות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני PGCs ציפוי, המדיום MEF יש להסיר לאט מהשכבה מזין MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להוסיף 0.5 מ&quot;ל / היטב מראש חימם בינוני בנוקאאוט שיושלם על שכבת מזין MEF. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEF התקשורת מכיל בסרום שור העובר כי גורם הבידול של PGCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני נוק יש להשלים עם גורמי גדילה ספציפיים מצלצלים מיד לפני השימוש, כדי להבטיח את פעילותו של הגורם לגדול. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הפצה סימטרי, PGCs צלחת מעל שכבת מזין MEF. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלקים האלה הם קרובים מדי, הם נוטים לצבור ולעשות במושבות צפופות לצרף גרוע או להתחיל מבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות התרבות חייבת להיות תווית עם שם עובריים קו ז&#39;רמינל התא, מספר קטע, ותאריך. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, להעביר את הכלים לתוך תרבות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאים כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, להסיר 250 מ&quot;ל של מדיה העליון של התרבות להימנע מטריד מצורף של המושבה. ואז, להוסיף 250 מ&quot;ל של טרי עקום החוצה התקשורת השלים (מחומם מראש על 37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלב 7, לחכות עוד 48 שעות, ולאחר מכן, להסיר לחלוטין את כל התקשורת ולהחליפו בתוספת התקשורת עקום החוצה טרי (מחומם מראש על 37 ° C). האם זה כל 2 ימים 8-10 ימים עד ליצור מושבות PGC. </li></ol> חלק 5: תאים עובריים ז&#39;רמינל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 ימים של בידוד PGC, מושבות תאים עובריים נבטי נוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים עובריים נבטי נשמרים חי על ידי קטעים ידנית כל 8-10 ימים. הם ממשיכים להוות מורפולוגיה מובחן ולהביע סמנים pluripotency כגון alkalyne phosphatase, אוקטובר-4, SSEA-1, ו - SOX-2 </li></ol> הערות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים / aseptic חיוניים בחדר התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הגזירה ותרבות, PGCs מעובדים ממשלה מחלקה מטהר ביו בטיחות השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubations נמצאים humidified 37 ° C ו 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל התקשורת ואת ריאגנטים מסוננים לפני השימוש במסנן 0.2 אממ, המאוחסן ב 4 ° C, מראש התחמם ב 37 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלבים לנתיחה, עוברים כל ורקמות חייב להישמר על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות כל מגיב הם לחטא עם אתנול לפני הצבת בארון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכפפות, חלוק, וכובעים אחות הם חובה. </li></ul> מסקנה סיפקנו וידאו המראה כיצד לבודד, להפיק, ואת התרבות תאים עובריים נבטי מ רכסים האשכים של 10.5-11.5 עוברים DPC העכבר. הבידוד לשחזור התרבות לטווח ארוך של שורות תאים עובריים נבטי מספק בסיס חיוני למחקר של ההתפתחות העוברית המוקדמת, נבטי דפוסים גנטיים epigenetic, היווצרות בלוטת המין, ההשפעות הסביבתיות של האיברים הסמוכים במהלך תהליך התפתחותי של gametogenesis של עוברי זכר ונקבה, וקביעת מסלולים שמוביל לסרטן פוריות. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="איור 1" />

<ol>
	<li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).</li><li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells.">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li><li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+12:+Mouse+Primordial+Germ+Cells:+isolation+and+in+vitro+culture.">Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture.</a> Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).</li><li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis.">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li><li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification.">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li><li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+MEFs+to+Matrigel+I:+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs.">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li></ol>

מחקר זה נערך לאחר בדיקה וטיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) אישור פרוטוקול העכבר שלנו # 08030 (תפקיד החמצן מגיב Species-ROS בפיתוח קו נבט היווצרות הגידול: החזקת וגידול פרוטוקול) בשעה מיסיסיפי סטייט.

מלקחיים מס &#39;14 ו -15, 35 מ&quot;מ אזמל, מספריים לנתיחה, שדות כירורגית, סבון מיקרוביאלית, תמיסת מלח 0.9%, גזה, קצף מיכל קרח, סכין גילוח, 35 מ&quot;מ אזמל, מלקחיים קנס מס&#39; 4 ו - 5, מחט מתגרה בסדר לטפל, לסנן גיליונות נייר, ומשכה pipettes זכוכית.<br /<br /&gt; ציוד: stereomicroscope לנתח, אור מקור שוט Fostec, מיקרוסקופ הפוכה, micropipette 10 ו 200ul, צנטריפוגות, הקבינט ביו בטיחות.

isolation and derivation of mouse embryonic germinal cells

היכולת של תאים עובריים נבטי (למשל) כדי להתמיין לתאי נבטי קדמוני (PGCs) ומאוחר יותר לתוך הגמטות במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 בימים שלאחר coitum (DPC) עוברי עכברים. פיתוח רכסים האשכים מעוברים העכבר (C57BL6J) היו מנותקים על ידי הפרעה מכנית עם collagenase, אז מצופה שכבה העובר עכבר מזין פיברובלסטים (MEF-CF1) כי היה בעבר מומת mitotically בנוכחות התקשורת בנוקאאוט עם mitomycin C שיושלם עם מעכבי לוקמיה פקטור (LIF), פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF), וכן גורם לתאי גזע (SCF). שימוש בשיטות אלה אופטימיזציה עבור זיהוי ובידוד PCG, והקמת התנאים תרבות היתרי תרבויות ארוך טווח של תאים EG במשך יותר מ 40 ימים. הקווים עובריים נבטי הראו פנוטיפ הביטוי עובריים של סמנים בשימוש משותף של המדינה pluripotent. בידוד הגזירה של תאים נבטי בתרבות לספק כלי להבין את התפתחותם במבחנה מציעים את ההזדמנות כדי לפקח על נזק מצטבר ברמות גנטיים epigenetic לאחר חשיפה סטרס חמצוני.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells at JoVE.com

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

isolation-and-derivation-of-mouse-embryonic-germinal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  Mississippi State University. היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

Video: Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation and cell fate specification using aggregates of mouse embryonic stem cells (mESCs) in suspension culture. Small numbers of mESCs are aggregated in basal medium for 48 hr in non-tissue-culture-treated, U-bottomed 96-well plates, after which they are competent to respond to experimental signals. Following treatment, these aggregates begin to show signs of polarized gene expression and gradually alter their morphology from a spherical mass of cells to an elongated, well organized structure in the absence of external asymmetry cues. These structures are not only able to display markers of the three germ layers, but actively display gastrulation-like movements, evidenced by a directional dislodgement of individual cells from the aggregate, which crucially occurs at one region of the elongated structure. This protocol provides a detailed method for the reproducible formation of these aggregates, their stimulation with signals such as Wnt/&#946;-Catenin activation and BMP inhibition and their analysis by single time-point or time-lapse fluorescent microscopy. In addition, we describe modifications to current whole-mount mouse embryo staining procedures for immunocytochemical analysis of specific markers within fixed aggregates. The changes in morphology, gene expression and length of the aggregates can be quantitatively measured, providing information on how signals can alter axial fates. It is envisaged that this system can be applied both to the study of early developmental events such as axial development and organization, and more broadly, the processes of self-organization and cellular decision-making. It may also provide a suitable niche for the generation of cell types present in the embryo that are unobtainable from conventional adherent culture such as spinal cord and motor neurones.

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em&gt; במבחנה</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Developmental Biology

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכבר ברזולוציה של תא בודד

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

מחבר זרקור: בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

בידוד וגנוטיפ של עובר עכבר גסטרולציה לריצוף תא בודד

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Author Spotlight: צינור לניתוח עוברים מוטנטיים ספציפיים לשושלת ברזולוציה של תא בודד

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז'רמינל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה