אנו מודים יונתן לוקאס לסיוע טכני שלו עם תרבית תאים מזין, Servei Estabulari de la UAB עבור טיפול בבעלי חיים, מרטין Domènec עבור הקלטת הוידאו. עבודה זו היא נתמכה על ידי y Ministerio דה Economia Competitividad AGL2014-52408-R ו- Generalitat דה קטלוניה 2014 SGR-524. MVC הוא המוטב של מלגת PIF-UAB.

השימוש של בעלי החיים המתוארים בסעיפים שלהלן אושרה על ידי ועדת האתיקה על חיות והמחקר האנושי של ברצלונה דה Autònoma Universitat ועל ידי Departament d &#39; פסקה חקלאיות וציוד, Ramaderia, אני Alimentació של Generalitat דה קטלוניה (פרוטוקול #8741).
 1. מזין תאים איון ואחסון הערה: העורלה האנושי fibroblasts (HFF-1) היו בעבר קפוא 1 מ"ל של הקפאה פתרון בהיקף של 90% סרום שור עוברית (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד ( דימתיל סולפוקסיד) והם מאוחסנים חנקן נוזלי עד שימוש.
<ol><li>להפשיר בקבוקון קריוגני HFF-1 (1 מ"ל) במועט המבחנה באמבט מים 37 ° C.</li>
	<li>להוסיף את תכולת המבחנה קריוגני המופשרים ומחוממת מראש Dulbecco &#39; s נשר שונה &#39; s בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לעשות 1:10 דילול.</li>
	<li>זרע התאים מדולל (10 מ"ל) בבקבוקון T75 ואת תרבות אותן ב- CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>למחרת, לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.</li>
	<li>תרבות HFFs את ולשנות את המדיום כל 48 שעות עד התרבות מגיע השלב confluent. פעולה זו עשויה להימשך כ- 7 עד 10 ימים.</li>
	<li>להכין את הפתרון איון, לדלל מיטומיצין C ב- DMEM בתוספת 10% FBS-ריכוז סופי של 10 µg/mL. דגירה התאים עם הפתרון איון עבור h 3-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2.</li>
	<li>להסיר הפתרון איון ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) כדי לסלק שאריות מיטומיצין C.</li>
	<li>כדי לנתק את התאים מוחלש, להוסיף 1 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA ומחוממת מראש ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהן מנותק (10 x המטרה עם מפתח נומרי או נה 0.3). אם הם לא, דגירה אותם במשך עוד כמה דקות-CO 37 ° C ו-5% 2. בדוק את התאים שוב תחת המיקרוסקופ הפוך.</li>
	<li>Pipette את הפתרון עם פיפטה פסטר על מנת לבטל כגיהנום תא.</li>
	<li>לנטרל את הפתרון אנזימטי על-ידי הוספת 4 מ ל בתוספת 10% FBS ו resuspend DMEM.</li>
	<li>לקחת את aliquot של התליה תא ולעשות לדילול בטחונות ב- HBSS. כדי לקבוע את מספר התאים, טען µL 10 של הדילול נויבאואר &#39; s קאמרית. לספור את התאים הממוקם באחד הריבועים הגדול של התא תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 x המטרה עם נה 0.45).
	<ol><li>לחזור על הספירה סך של ארבעה ריבועים גדולים. לחשב את המספר הכולל של תאים (N) כמו N = מספר ממוצע של תאים ספרתי x הנפח הכולל x דילול x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuge לשאר המדגם למשך 5 דקות ב 200 x ג' להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מקפיא פתרון ריכוז 10 6 תאים לכל mL-</li>
	<li>Aliquot התליה של מבחנות הקפאה עם 10 6 תאים (1 מ"ל) כל. מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכל ההקפאה ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
	<li>למחרת, לאחסן את הבקבוקונים הקפאה בחנקן נוזלי.</li>
</ol> 2. תרבית תאים מזין <ol><li>1-4 ימים לפני התחלת תהליך נגזרת, הפשרה בקבוקון קריוגני המכיל 1 x 10 6 להשבית HFF-1 תאים בתוך אמבט מים ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לגרום לדילול 1:6 המופשרים HFF 1-מראש חימם DMEM בתוספת 10% FBS ולשמור הטמפרטורה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מלא בכל טוב של צלחת 4-ובכן עם 500 µL של ג'לטין מראש ומחוממת 0.2% מן העור חזירי ולשמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות</li>
	<li>להסיר את µL 500 של ג'לטין מן הבארות ולהוסיף 500 µL של דילול HFFs. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות אחידה של HFFs על החלק התחתון של הבארות. להימנע בתנועות סיבוביות, אחרת התאים יתרכז במרכז הבאר.</li>
	<li>דגירה את הצלחת לפחות 24 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי להשיג של טפט של HFFs לא מופעל כל היטב.</li>
	<li>למחרת, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה (10 X המטרה עם נה 0.3) ולבדוק כי הם מחוברים, homogeneously מבוזרת. לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 500 µL של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.</li>
</ol> 3. אוסף העובר ותרבות <ol><li>4 ימים לפני אוסף העובר, לנהל 5 IU של סוסה הרה &#39; s גונדוטרופין סרום בזריקה בקרום הבטן לעכברים נקבה שבוע 6-12. 
	הערה: השתמשנו נקבות 129S2 או זנים B6CFAF1, למרות נקבות מפני זנים אחרים העכבר יכול לשמש. ובכל זאת, כאשר עובדים עם הנקבות ממתירני זנים (למשל כקבוצת), בינוני יש להשלימה עם 2i כאמור בשלב 4.2.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, לנהל 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי על-ידי הזרקת בקרום הבטן, חבר הנקבות עם גברים, זקנים, ביחס של 1:1 לפחות 8 שבועות. להפריד בין הנקבות מן הזכרים למחרת.</li>
	<li>יום לפני איסוף העובר, להכין תרבות 35 מ מ תא צלחת פטרי עם מספר 40 טיפות µL בינוני KSOMaag בתוספת 4 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), למלא את הצלחת עם שמן מינרלי כדי כיסוי מלא הטיפות. דגירה המנה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי equilibrate של המדיום.</li>
	<li>להכין את העובר מניפולציה פיפטות, מחממים את חלק רזה זכוכית ארוך שקצהו פיפטה פסטר באמצעות מבער בונזן. ברגע רכים, מסירים אותה מן הלהבה ו להפריד את שני הקצוות. לשבור את זה עד לאורך הרצוי. הקוטר הפנימי בקצה צריך להיות 100-150 מיקרומטר.</li>
	<li>המתת חסד העכברים נקבה על ידי נקע בצוואר הרחם 45-48 h פוסט-coitum (p.c.).</li>
	<li>לנתח העכברים לחשוף את חלל הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים חדות מעוקלים חלקה ו של הצפק עם מספריים חדות ישר. תפוס את הרחם אחת עם מלקחיים, לחתוך את oviduct באמצעות מספריים חדות ישר, ולמקם אותו בינוני (HCZB) CZB Hepes באגירה 13-37 ° C. חזור על התהליך כדי להסיר את oviduct אחרים.</li>
	<li>סומק oviducts עם מזרק 1 מ"ל עמוסה HCZB שנערך במקום על ידי שען מלקחיים כדי לאסוף את העוברים 2-תא. 
	הערה: כדי להכין לקחת מחט שטיפה מחט תת-עורית 30 גרם, לחתוך את הקצה על הקרקע עד קצה קהה על אבן שוחקים.</li>
	<li>באמצעות המנגנון פיפטה בפה, לאסוף את העוברים, לכבס אותם במים HCZB, תרבות אותם בצלחת תרבות העובר מוכן קודם לכן ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עד לשלב הבלסטוציסט. עד 50 עוברי יכול להיות בתרבית בתוך כל טיפה 40 µL. לעקוב אחר התפתחות העובר בכל 24 שעות תחת stereomicroscope. 
	הערה: לחלופין, העוברים ניתן לאסוף בשלב הבלסטוציסט כדי לקצר במבחנה העובר תרבות. במקרה זה, המתת חסד הנקבות ביום 3.5-4.5 p.c., לנתח את הרחם. מדובר עם HCZB.</li>
</ol> 4. תא גזע נגזרת <ol><li>הכנה של הלוחות נגזרת <ol><li>ביום של העובר זריעה, להכין המדיום נגזרת על ידי שכשהם DMEM בינוני עם 100 מיקרומטר 2-β mercaptoethanol, 1 x חומצות אמינו שאינם חיוניים , 20% של החלפת סרום ו- 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>במידת הצורך, גם להוסיף 1 מיקרומטר של המדכא MEK PD0325901 ו-3 מיקרומטר של המדכא GSK3 CHIR99021 כדי לקבל מדיום 2i.</li>
		<li>לוקח את הצלחת 4-ובכן עם טפט של HFFs מוחלש (שלב 2.6) מ חממה. להסיר את המדיום ולהוסיף µL 800 נגזרת מראש ומחוממת בינוני כל טוב. להחזיר את הצלחת החממה.</li>
	</ol></li> <li>העובר זריעה וניקוי Zona pellucida <ol><li>הכנת תרבית תאים של 35 מ מ צלחת פטרי עם µL 30 שלוש טיפות של Tyrode חומצי &#39; s פתרון 14 ו- µL 30 שלוש טיפות של גזירת בינוני. לכסות את הטיפות עם שמן מינרלי ולשמור את המנה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קח את הצלחת תרבות העובר מן החממה. אחד אחרי השני, להעביר blastocysts את הטיפות התרבות Tyrode חומצי &#39; s פתרון טיפה באמצעות פיפטה מניפולציה של העובר. אם אפשר, בחר רק את blastocysts מורחבת כדי להתחיל את תהליך הערכת.</li>
		<li>לפקח על העיכול zona pellucida תחת stereomicroscope. ברגע pellucida zona נעלמת, להעביר את הבלסטוציסט ירידה בינונית נגזרת על מנת לשטוף את Tyrode חומצי &#39; פתרון s.</li>
		<li>לוקח את הצלחת 4-ובכן נגזרת מן החממה ואת זרע אחד נטול zona הבלסטוציסט במזין תאים היטב לכל.</li>
		<li>להחזיר את הצלחת נגזרת 4-ובכן חממה והתרבות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	</ol></li> <li>בינוני וצמיחה של תאי גזע ניטור לשנות <ol><li>לפקח על התרבויות כל 24 שעות תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 X המטרה עם נה 0.45). חשוב לשים לב אם קיימים סימנים של התמיינות תאי גזע, כגון נפוחות השבירה תאים המקיפים את תוצר או אפילו שדחקו את המזין תאים הצידה.</li>
		<li>בכל יום אחר, לשנות את המדיום של התרבות. לוקח את הצלחת 4-ובכן מן החממה, להסיר את המדיום מכל קידוח ולהוסיף µL 800 בינוני נגזרת מראש ומחוממת עם LIF ו- 2i, אם נעשה שימוש. לשמור על התרבות עד outgrowths שנצפו (6-8 ימים).</li>
	</ol></li></ol> 5. תא גזע תרבות ותחזוקה <ol><li>הכנת Kolle כמו ידיות, פיפטות מניפולציה תאי גזע. בצע צעד 3.4 להכין את תאי הגזע פיפטות מניפולציה בקוטר הפנימי בקצה של 250-300 מיקרומטר. השתמש החלק השני של פיפטה פסטר משך כדי להכין את הידית, כמו Kolle. מחממים ולעצב אותו עד קבלת וו.</li>
	<li>לוקח את הצלחת. ובכן 4 תרבות מתוך החממה ואתר את תוצר תחת stereomicroscope. להשתמש בידית כדי להרחיק את התאים הבדיל ומזינים את המקיפים את תוצר. 
	הערה: כדי להימנע בסופו של דבר הבידול של תוצר, חשוב להסיר את כל התאים הבדיל מהקצה של תוצר.</li>
	<li>וארוקן את תוצר עם פיפטה מניפולציה תאי גזע ולמקם אותו תבשיל חדש בטיפה טריפסין-EDTA 50 µL-</li>
	<li>השימוש באזמל לחתוך את תוצר בכמה חלקים על מנת disaggregate זה מכנית והן enzymatically.</li>
	<li>מיד, להעביר את שברי תוצר לתוך טיפה טריים של גזירת בינוני לנטרל טריפסין פעולה.</li>
	<li>להעביר השברים תוצר צלחת 4-ובכן חדשה עם טפט של מזינים. להעביר עד 10 קטעים מפוצלים טוב ואת תרבות אותם עם נביעה בינוני-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>לשמור על התרבויות תאי גזע דמוי לפחות שישה שבועות לפני בהתחשב הקו mESC הוקמה. לשנות המדיום. כל יום, תת-תרבות אחרים אותם פעם בשבוע.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li><li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer.">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies.">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+support+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li><li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+and+techniques+for+mouse+embryonic+stem+cell+derivation+and+culture.">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li><li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells.">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li><li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+(ES)+cell+lines.">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li><li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency.">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות mESC קו נגזרת היא הליך ידועים בשימוש שגרתי במעבדות רבות, היעילות שלה אינה גבוהה כמצופה לאור הגורמים מרובים יכולים להפריע pluripotency תחזוקה תמיד. במאמר הנוכחי אנו מציגים, צעד אחר צעד, כיצד להקים קווי mESC עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוטה ואמינה. היעילות אלה דומים לאלה שדווחו בספרות.
<p...

תאי גזע עובריים (ESC) הם תאים pluripotent נגזר של עוברי, אשר לשמור על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים1. בהתבסס על מאפיינים אלה, ESC הפכו להיות כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית מידול המחלה, לימודי הנדסת רקמות2.
ESC נשאבו בפעם הראשונה מעוברים עכבר של, שמקורם קווים העכבר ESC (mESC) עם3,הצלחה נמוך4. במשך שנים, היעילות נגזרת נשאר נמוך בשל הקושי של שמירה על pluripotency חוץ גופית בתוך. חוץ מזה הנוכחות של מזין תאים5, אשר לשפר את יעילות נגזרת, לקדם את המושבה המצורף, לשפר את יציבות karyotypic6, מספר שינויים ההפניה פרוטוקול על שיפור בתחזוקת pluripotency. החשוב ביותר היה התוספת של לוקמיה מעכבים מקדם (LIF) mESC תרבות בינוני7,8, השימוש של העוברים רקע מתירניות 129S29 ומוגדר התרבות של mESC בינונית בתוספת סרום, ללא פוטנציאל התמיינות גורמים10. לאחרונה, ראיות משכנעות הראו כי תוספת של קוקטייל של שני מאפננים מולקולה קטנה של איתות המסלולים למדיום תרבות mESC (המכונה 2i) הוא הטוב ביותר לשמור על pluripotency. 2i קוקטייל כוללת שילוב של החומר המדכא MEK PD0325901, אשר מפחית את האותות בידול על ידי עיכוב מסלול מופעל mitogen חלבון קינאז (MAPK), החומר המדכא GSK3β CHIR99021, אשר משפר הישרדות cell-צפיפות נמוכה על ידי הפעלת מסלול ונ ט11.
במאמר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ביעילות לנבוע mESC קווים העכבר blastocysts. אנו עוקבים אחר הליכים סטנדרטיים, culturing העוברים מן מתירניות זני מזין בתאים נגזרת בינוני עם LIF, החלפת סרום12. בעקבות זה לפרוטוקול, שורות mESC יכולות לנבוע עם היעילות מקבילה לאלו שהושגו 2i בינוני. למרות זאת, ניתן להוסיף 2i כדי למנוע בעיות אפשריות עם pluripotency תחזוקה או בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">1 mL sryringe</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:141px;">309628</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">2-&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:263px;">Acidic Tyrode&#39;s solution&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&#186;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&#186;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:263px;">Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-21200</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &#945;SMA and AFP mouse antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">CHIR990212</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1386</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CryoTube</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">3754518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">41640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>L0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&#186;C. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Flushing needle</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td>304000</td>
			<td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td>48724</td>
			<td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-11037</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">HBSS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">L0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Hepes-buffered CZB&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>See composition in Chatot et al, 1989</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Divasa-Farmavic</td>
			<td style="width:141px;">Veterin-Corion 3000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human foreskin fibroblasts</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:141px;">ATCCSCRC-1041</td>
			<td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td>&#160;10828-028</td>
			<td style="width:524px;">Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&#186;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">KSOMaag Evolve</td>
			<td style="width:199px;">Zenith Biotech</td>
			<td style="width:141px;">ZEKS-050</td>
			<td style="width:524px;">Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&#186;C and 5% CO2 a day prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:199px;">Merk Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:263px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Charles River/Harlan</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo tested. Photosensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:199px;">Serva</td>
			<td>2980501</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&#186;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse anti-tubulin &#946; III (Tuj1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:141px;">MMS-435P</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A5228</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-AFP</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">MAB1368</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti Oct3/4&#160;</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td style="width:141px;">Sc-5279</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">PD0325901</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1408</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (35mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Pregnant mare&#39;s serum gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Foligon</td>
			<td>Foligon-1000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Rabbit policlonal anti-Sox2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB5603</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">T75 falcon</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:141px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypsin-EDTA 10x</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">X0930</td>
			<td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

העכבר בתאי גזע עובריים (mESC) נגזרת הוא התהליך על ידי pluripotent אשר נקבעו שורות תאים מעוברים. קווים אלה שומרים על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים. בשל תכונות אלו, mESC הם כלי שימושי ב רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה ולימודי הנדסת רקמות. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט להשיג mESC קווים עם יעילות גבוהה נגזרת (60-80%) מאת culturing blastocysts מן העכבר מתירניות זני מזין בתאים במדיום מוגדר עם לוקמיה מעכבות פקטור. הפרוטוקול ניתן גם ליישם ביעילות שואבים mESC קווים העכבר מתירני זנים, תוספת פשוטה של קוקטייל של שני מעכבי מולקולה קטנה למדיום נגזרת (2i בינוני). הליכים מפורטים על ההכנה ועל התרבות של תאים מזין, איסוף של תרבות של העכבר עוברי, נגזרת של התרבות mESC קווים הינם מסופקים. פרוטוקול זה אינו מצריך ציוד מיוחד, יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם מומחיות תרבות בסיסיים בתרבית של תאים.

בעקבות פרוטוקול זה, מעל 95% תוצר היווצרות צריך להיות מושגת לאחר השבוע הראשון של תרבות (איור 1 א'). הקמת קווי mESC לאחר 6 מעברים הוא משתנה בין משכפל ניסיוני, עם הצלחה ממוצע של 60-80%. התוספת של 2i לא באופן משמעותי לשפר את התוצאות בעת עבודה עם עכבר מתירניות זנים, כגון אל...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

Video: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...