עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DA018109 ו MH78823, ו-NIH Neuroscience Blueprint Core גרנט P30NS057105 כדי אוניברסיטת וושינגטון.

תרבות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרביות תאים ניתק של תאים בהיפוקמפוס חולדה או עכבר מיום הלידה 0-3 חיות 1. הנוירונים שלנו לדבוק monolayer astrocyte הבסיסית, אשר בתורו שומרת על שכבת קולגן להתפשט על coverslip 0 מספר עובי. פלייט הנוירונים בצפיפות של כ 500 תאים לסנטימטר מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תרבויות לגדול במשך 10-14 ימים כדי לאפשר פיתוח התבגרות הסינפטי ו. פנקו את התרבויות ביום במבחנה 4 עם AraC antimitotic לעצור צמיחה גליה נוספת. הזנת אותם יום במבחנה 5 עם חילופי בינוני וחצי עם Neurobasal בינוני פלוס תוסף B27 כדי לשפר את ההישרדות עצביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התקופה תרבות, להציג טיפולים שנועדו לשנות את מספר הסינפסות השתיק תפקודית. אנו מוצאים כי אחד דרך נוחה להשתיק אחוז גדול (~ 80%) של סינפסות הגלוטמט הוא טיפול של 4 שעות עם אשלגן 30 מ&quot;מ. Incubations ארוכים עם גירויים depolarizing חלש להשרות 2 השתקה דומה. גירוי של 4 שעות עם 50 מיקרומטר forskolin, activator של cyclases adenylyl, יכול לשמש כדי לעורר את האוכלוסייה של מסופי שקט בתחילת המחקר 3. </li></ol> לדמיין סינפסות שותק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריך צפיפות נמוכה יחסית עם מופרדים היטב תהליכים מדלקת עצבים ביום במבחנה 10-14 כדי לאפשר ויזואליזציה של המסופים הסינפטיים בדידה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של 5 מ&quot;מ FM1-43FX במים מזוקקים. המניה יש לשמור בחושך ב 4 ° C. כל הניסויים באמצעות FM1-43FX צריך גם להתבצע בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתגר התרבויות במשך 2 דקות עם אשלגן כלוריד 45 מ&quot;מ מלוחים פתרון HEPES שנאגרו המכיל נתרן 100 mM כלוריד, סידן כלוריד 2 מ&quot;מ, מגנזיום כלוריד 1 מ&quot;מ, 10 גלוקוז מ&quot;מ, ו - 10 מיקרומטר FM1-43FX. פתרון זה אמור גם להכיל 1 מיקרומטר NBQX ו -25 מיקרומטר D-APV לחסום קולטנים postsynaptic ולמנוע איתות חוזרת. אתגר זה יהיה תווית המסופים הסינפטיים המסוגלים exocytosis ו אנדוציטוזה. השעה אתגר וכוח נועדו לגרום לפחות סיבוב אחד של exocytosis של כל שלפוחית ​​זמין 4 הבריכה מיחזור. עם זאת, האתגר אינו מספיק כדי לגרום השתקה נוספת של מסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את התרבות במשך 3 עד 5 שניות בלבד, תוך שימוש באותו HEPES שנאגרו מלוחים ללא אשלגן כלורי, אבל עם 500 מיקרומטר Advasep-7 להסיר צבע ספציפי 5. ראוי לציין, כי העיתוי של הצעד הזה היא קריטית כיישום ממושכת של Advasep-7 תגרום לאובדן של תיוג FM1-43FX כל. לשטוף הבאה HEPES שנאגרו מלוחים ללא Advasep-7 2 במשך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם paraformaldehyde 4% ו 0.2% ב glutaraldehyde PBS, pH 7.4 למשך 10 דקות. לשטוף את התאים לאחר זמן קצר עם PBS, אז דגירה במשך 15 דקות בתמיסה המכילה חוסם 4% נסיוב עז נורמלי טריטון 0.04% X-100 ב PBS. שים לב FM1-43FX הוא גם רגיש מאוד לסכום של טריטון X-100 השתמשו כאן ב צעדים מאוחר יותר. ככלל, FM1-43FX תיוג הוא הטוב ביותר בהיעדר טריטון X-100, אך חומר ניקוי כלשהו יש צורך permeabilize תאים immunostaining הבאים. יש לנו נקבעים אמפירית כי 0.04% Triton X-100 הוא אופטימלי לבדיקה של סינפסות שקט presynaptically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן העיקרי vGluT-1 בחסימת פתרון בריכוז של 1:2500. דגירה התאים עם סיבוב עדין רועד / ב בדילול vGluT-1 נוגדנים במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. הקפידו לכסות מנות התרבות שלך עם רדיד כדי למנוע הלבנת של צבע FM1-43FX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים PBS ואז דגירה התאים עם הנוגדנים נגד ניסיונות חזיר מצומדות כדי fluorophore עם מאפיינים ספקטרליים שונים FM1-43FX להבחין בשני כתמים. לצורך ניסוי שלנו, נשתמש אלקסה 555-מצומדות נגד ניסיונות נוגדן חזיר בשעה 1:500 בחסימת פתרון. דגירה התאים עם הנוגדנים המשני תוך רעד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים ארבע פעמים יותר PBS ואז הר להחליק לכסות על זכוכית שקופית באמצעות ירידה קטנה של Fluoromount-G. הקפד coverslip להתמצא כך התאים פני שקופיות. אפשר השקופיות לייבוש למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת אנחנו מוכנים לרכוש תמונות של סינפסות פעיל פעיל. הכן אובייקטיבית שמן x 60 עם צמצם 1.4 מספרית על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. המקום שקופיות על הבמה, על מנת להבטיח כי הצד coverslip פונה המטרה. לאחר התמקדות השקופית, למצוא שדה neurites זה לא צפוף מדי. מומלץ גם להימנע הדמיה סומה ליד התא, כמו צבע שיורי FM1-43FX יכול להישאר שם גם אחרי כביסה נרחב. לקבלת תמונות הניסוי שלנו, אנו בדרך כלל זום לגודל שדה של 51 51 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכושZ-ערימה של שדה נתון כיסוי לעומק של 7.8 מיקרון עם 27 0.3 מיקרון צעדים. טווח זה מספיק כדי לכסות את עובי של neurites בתרבות שלנו. לכל שלב בערימה-z, סרוק הראשון עם אור לייזר זה מלהיב immunofluorescence של נוגדן vGluT 1-לזהות את כל הסינפסות glutamatergic בתחום מיקרוסקופ. השדה אותו מחדש סרק בכל שלב של הקרינה FM1-43FX. הגדר סינון צפיפות ניטרלי ורווחי מכפיל בעקביות בין כל coverslips לניסוי נתון, תוך הימנעות הרוויה של האות. אנחנו בדרך כלל לרכוש ≥ 5 שדות לכל תנאי כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ניתוח, להמיר את Z-מחסנית לתוך תמונה מטוס בודד מרוכבים. תהליך אנו משתמשים עבור המרה זו מייצרת דימוי המבוסס על עוצמת מקסימום מהמטוס כל כל פיקסל. הדימוי מורכב הוא thresholded ו vGluT-1 מסופי מזוהים לניתוח, ללא התייחסות FM1-43FX הכתם. אזורים ויטראז, המכונה puncta, מסומנים כמו אזורים של עניין. אנחנו בדרך כלל לבחור 10 puncta לכל שדה. הבא בערוץ FM1-43FX הוא thresholded לבין אזורים של עניין הן על גבי. תוכנת הניתוח משמש לכמת את עוצמת הקרינה של כל אות, כמו גם את השטח של כל פונקטום. קריטריון פיקסל מוחלט או קריטריון פיקסל אחוז יכול לשמש כדי להבדיל בין הסינפסות פעיל פעיל. </li></ol> נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרבויות שלנו, אנו מוצאים כי 70-80% של סינפסות הגלוטמט, שהוגדר על ידי מכתים vGluT 1-, התערוכה לזיהוי FM1-43 מכתים 2, 6-8. בתמונות כיסו של ירוק FM1-43 פלואורסצנטי אדום vGluT-1 מכתים זו כפי שהיא משתקפת שפע של puncta צהוב: סינפסות עם שותף מקומי סמנים. אלו מסומנים על ידי החצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 20-30% של (אדום) puncta vGluT 1-חיובי ייכשל להיות (ירוק) FM1-43 הקרינה מעל הבסיס. אלה הם מסופי presynaptic פעילים, דוגמה מצוינת באמצעות ראש החץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוכלוסייה השלישית של סינפסות יהיה גם ציין. אלו הן חיוביות (ירוק) FM1-43 הקרינה אך ללא מכתים vGluT-1 (אדום). אלו סינפסות GABAergic פעיל דוגמה מצוינת באמצעות הכוכבית. אלו אינן נכללות מרבית הניתוחים שלנו, אבל ניתן ללמוד במפורש באמצעות נוגדן טרנספורטר שלפוחי GABA במקום את הנוגדן vGluT 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+and+synaptic+properties+of+hippocampal+neurons+grown+in+microcultures+and+in+mass+cultures.">Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures.</a> J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).</li><li>Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+activity+depresses+synaptic+function+through+an+effect+on+vesicle+priming.">Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming.</a> J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).</li><li>Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+role+for+Ca2+-dependent+adenylyl+cyclases+in+recovery+from+adaptive+presynaptic+silencing.">A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing.</a> J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).</li><li>Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+vesicle+recycling+supports+neurotransmission+during+sustained+stimulation+at+hippocampal+synapses.">Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).</li><li>Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans,+lamprey,+and+rat.">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 809-817 (1999).</li><li>Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+control+of+vesicle+priming+and+short-term+plasticity+by+Munc13+isoforms.">Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inactivation+of+a+fraction+of+excitatory+synapses+in+mice+deficient+for+the+active+zone+protein+bassoon.">Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon.</a> Neuron. 37, 787-800 (2003).</li><li>Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+overexpression+depresses+excitatory+transmission+through+both+presynaptic+and+postsynaptic+mechanisms.">Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).</li></ol>

משמעות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל סינפסות נחשבים פועלים על ידי שחרור משדר בהסתברות למדידה. עבודה על ידי עצמנו ואחרים עושה את זה ברור כי הסינפסות חלקם עקשן שחרור הנוירוטרנסמיטר, למרות מערך מלא של טרנספורטר הנוירוטרנסמיטר שלפוחי ושאר ס?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM1-43FX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-35355</td>
<td>A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing.</td>
</tr>
<tr>
<td>Advasep-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CyDex</td>
<td>AR-0A7-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>vGluT-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>AB5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa 647-conjugated anti-GP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-21450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotechnology Associates</td>
<td>0100-01</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

presynaptically silent synapses studied with light microscopy

פלסטיות בבסיס Synaptic סביר היכולת של מערכת העצבים ללמוד ולזכור ואולי גם לייצג ההסתגלות שמונעת אחרת עלבונות פגיעה מלהפוך neurotoxic. אנחנו כבר לומדים צורה של פלסטיות presynaptic כי הוא מעניין, בין השאר משום שהוא מבוטא מיתוג דיגיטלי לסירוגין היכולת מסוף s presynaptic לשחרר שלפוחית ​​המכילה את הנוירוטרנסמיטר גלוטמט. כאן אנו להדגים פרוטוקול המאפשר הדמיה מצב הפעילות של מסופי presynaptic בתרביות תאים ניתק מוכן מן ההיפוקמפוס מכרסמים. השיטה מסתמכת על גילוי סינפסות פעיל באמצעות מכתים עם צורה ניתן לתקן את צבע styryl FM1-43, נפוץ תווית שלפוחית ​​סינפטית. פרופיל זה מכתים הוא בהשוואה immunostaining של המסופים אותו עם נוגדן כנגד המשלח גלוטמט שלפוחי 1 (vGluT-1), כתם נועד תווית כל סינפסות הגלוטמט ללא קשר למצב ההפעלה. אנו מוצאים כי גירויים depolarizing להשרות השתקה presynaptic. האוכלוסייה של סינפסות כי הוא שותק בתנאי ההתחלה יכול להיות מופעל על ידי השתקת חשמל ממושכת או על ידי הפעלה של מסלולי איתות cAMP.

Watch this Scientific Journal Video about Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy at JoVE.com

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.

סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

presynaptically-silent-synapses-studied-with-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Views.  Washington University School of Medicine. סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.

Video: Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...