הפרוטוקול שלנו מציג כלי מותאם לחקר לב דג הזברה ב- vivo ומתאר הטמעת טכניקות אימוביליזציה יחד עם צינור רכישת הנתונים וניתוח להדמיית לב. דג זברה היא מערכת מודל לב עם פוטנציאל גדול ליישומים כמו מסך סמים. פרוטוקול המאפשר הדמיה עדינה בתנאים פיזיולוגיים חיוני בעת לימוד מחלות לב.
זרימת העבודה המוצגת כאן מתמקדת בהדמיית לב עוברי של דגי זברה, אך ניתן להחיל גרסה שונה על דגימות וניסויים שונים אחרים, כולל דיונון, תולעת והידרה. התחל על ידי איסוף העוברים המתקבלים מן הרבייה של הקווים הטרנסגניים הרצויים. שומרים את העוברים ב 28 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי מלאת דג E3 בינוני.
השתמש במחט זכוכית נשא רכוב על מיקרומניפולטור ומחובר מזרק פיקו להזריק 30 פיקוגרמות של אלפא-bungarotoxin mRNA לתוך החלמון של עובר שלב תא אחד או שניים כדי לשתק את הדג. שומרים את הביצים ב-28 מעלות בצלחת פטרי במילוי בינוני E3, ומעבירים את הביצים כל 24 שעות למנה חדשה המכילה בינוני E3 טרי עד להדמיה. כדי למנוע היווצרות פיגמנט, אם הרקע של דג הזברה אינו לבקן, העבר דגים ב 25 שעות לאחר ההפריה למנה חדשה המכילה E3 בינוני עם מעכב טירוסינאז 0.2 מילימול 1-פניל 2-תיוריאה, הידוע גם בשם PTU.
כדי ליישר את צינור אתילן פרופילן פלואורי למקם את הצינור בצינור בטוח זכוכית או פלדה autoclave עם הקוטר הפנימי הנכון כדי להתאים את צינורות הפולימר autoclave ב 180 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. ברגע שהצינורות מגיעים לטמפרטורת החדר, הסירו את צינור הפולימר המיישר. לניקוי הצינור, השתמש מזרק 50 מ"מ כדי לשטוף את הצינור פעמיים עם טוחנת אחת של נתרן הידרוקסיד.
לחתוך את הצינור לגודל של צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, למקם צינור צנטריפוגה מלא 0.5 טוחנת של נתרן הידרוקסיד ultrasonicate במשך 10 דקות. לשטוף את צינור אתילן פרופילן פלואורי עם מים מזוקקים כפולים, ואחריו 70% אתנול. צינורות העברה צינור צנטריפוגה טרי הכיל 70%אתנול ו ultrasonicate במשך 10 דקות.
לאחר ultrasonication, לשטוף את הצינור בפעם האחרונה עם מים מזוקקים כפולים, ולאחסן אותו בצינור צנטריפוגה המכיל מים מזוקקים כפולים. לאחר המסת נקודת התכה נמוכה agarose ב E3 בינוני לשפוך את agarose נמס בצלחת פטרי או פלסטיק לעשות מעיל אחד עד שני מילימטר. לאחר האגורוז הוא מוצק, בעדינות לשפוך את מדיום E3 על גבי אגר כדי למנוע ייבוש.
אוטמים את הצלחת עם סרט פרפין ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. להפשיר את פתרון המניות של tricaine ולהוסיף 0.02% tricaine למדיום E3 ללא מתיל כחול להשתמש כאמצעי הטמעה. השתמש פיפטה זכוכית חד פעמית כדי להעביר דגים למדיום הטמעה.
ודא שהדגים הפסיקו לזוז והלב פועם במהירות דומה בהשוואה לשליטה. חותכים את צינור האתילן פרופילן פלואורי עד האורך האידיאלי עם סכין גילוח. הכן מזרק עם צינורית קצה קהה.
מלא את המזרק באוויר, ואז לעלות את הצינור על המחט בעדינות לשטוף את כל המים הנותרים על ידי ריקון המזרק. לאחר מכן, מלאו את צינור האתילן פרופילן הפלואורית המותקנת על מזרק עם מדיה. הכנס עובר בצינור, שמירה על ראש הדג לסגור את קצה הצינור, הימנעות היווצרות בועה.
באמצעות סכין גילוח, לחתוך בזהירות את הצינור בקצה הצינורית הקצה קהה, או מחט. לאחר השלכת כל נוזל על החלק העליון של צלחת מצופה אגר, לצלול את הצינור ישר לתוך אגר. סובב את הצינור והוציא אותו כדי לשחרר את התקע ממיטת אגרוז.
אמת את נוכחותו של תקע אגר בסוף הצינור. להדמיה ארוכת טווח, לחתוך שלושה עד חמישה חורים לתוך הצינור בכל כיוון קרדינלי, לפחות חמישה מילימטרים מעל קצה הדג על ידי הצבת סכין גילוח בניצב לציר הצינור ולעשות חתך לתוך הצינור ב 30 מעלות עד להגיע למדיה הרכבה. לאחר מכן, לעשות חתך שני ב 180 מעלות כדי ליצור חור ולגלגל את הצינור כדי לדמיין את החתכים בבירור.
מעבירים את העובר הרכוב לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מדיה מוטבעת עד מוכן לתמונה. הר את הצינור במחזיק הדגימה ומלא את תא ההדמיה במדיה משובצת. מניחים את מחזיק המדגם על הבמה כשהדגימה טובלת בתא.
בדוק את הבריאות של דגים מוטבעים על ידי הערכה חזותית של קצב הלב, ואם פעימות הלב איטיות מדי להשליך את המדגם. השתמש תמיד באותה תנוחת דגימה להדמיה ניתנת לשחזור וסובב את הדג כך ששתי העיניים יהיו במישור המוקד. לאחר מכן, לסובב את הדגים כ 20 עד 30 מעלות נגד כיוון השעון במשך 48 שעות לאחר הדמיית ההפריה.
כאשר הדג הסתגל לכוח הלייזר, בחר את צד התאורה המעניק את איכות התמונה הטובה ביותר. בכל מישור Z, להקליט ארבע עד חמש פעימות לב ב 300 פריימים לשנייה, או יותר. כדי לתעד את הלב הפועם להזיז את המדגם צעד דרך גיליון האור ולהשתמש מרווח Z של אחד עד שני מיקרומטר כדי לכסות את כל עומק הלב.
טען את קובץ 4D לתוך תוכנת עיבוד 3D כדי לחקור את הנתונים וליצור סרטים של הלב דג זברה מעובד. ב 48 שעות לאחר ההפריה הלב רק עבר לולאה ויש לו שני תאים, החדר ואת האטריום, אבל עדיין לא לפתח את השסתומים. מבני הלב השונים כגון חדר, תעלת אטריוונטרקולרית, אטריום, דרכי זרימה ודרכי יציאה ניתנים להבחנה בקלות.
הנתונים הצביעו על פעימות מדויקות וחשפו אינטראקציות מורכבות בין שתי שכבות התא של הלב, שריר הלב, שכבת שריר תא בודד מתכווצת ומייצרת כוח, והאנדוקרדיום, שכבת תא בודד המחברת את הלב ל vasculature. החשוב ביותר הוא תמיד לאמת בריאות מדגם ודופק עקבי תחת סטריאוסקופ. בעוד טכניקות קונבנציונליות משפיעות לעתים קרובות על צורת הלב או הפונקציה, השיטות שלנו מספקות לנו נתונים דינמיים ללא הפרעה של הלב הפועם המסייעים לנו להבין את היסודות של הלב העוברי המוקדם.
