המחברים מבקשים להודות Demêmes דניאל דאגלס Cotanche ועל מאמציהם מלמד אותנו את השיטות לבידוד של האיבר של קורטי. בנוסף, אנו רוצים להודות ישמעאל Stefanov-וגנר להנדסת האלקטרודות electroporator: שרי לין עבור יצירות אמנות תורם לה אנימציה וידאו, ומתיו חנה, ג&#39;ייסון מיקר, ו קנדרה מרשל ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) להפקת וידאו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-Core MEEI תמיכה עבור שמיעה מחקר) מ NIDCD.

ביום 1. עיקור וציפוי של coverslips זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש לעקר מיקרוסקופ coverslips זכוכית החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips מעוקרים לשתי בארות של מנה טרום מעוקרים ארבע היטב תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל coverslips עם 01:01 poly-L-ornithine ו laminin בתוספת סרום 20% שור עוברית (FBS) לילה ב 4 ° C. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 μL poly-L-ornithine (פתרון 0.01% המאוחסן ב 4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 laminin μL (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון מאוחסנים aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 FBS μL (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום לעקר את הכלים לנתיחה לילה 150 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בינוני תרבות סרום המכיל 10% ו 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אמפיצילין. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 מ&quot;ל של Dulbecco השתנה הנשר בינוני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל FBS (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל סוס בסרום (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 אמפיצילין μL (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל פתרון מניות מאוחסנים 4 ° C) </li></ol></li></ol> יום 2. בידוד של האיבר של קורטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את האור UV במשך 20 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול ו לחכות 5 דקות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עכבר גור (P4) בבסיס מגנום foramen באמצעות מספריים ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הראש בצלחת 10 ס&quot;מ המכיל 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האפידרמיס בעזרת להב סכין המנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב סכין המנתחים ואז לחצות forebrain. לשמור על forebrain הזנב לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את, forebrain המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות דיסקציה קהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את העצמות הטמפורלית (תאנה 2A), לטבול אותם בקצרה אתנול 70%, ולהעבירם צלחת 3 מ&quot;מ המכיל HBSS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מפרשת petrous של העצם הטמפורלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את שבלול בצורת קונכייה (תאנה 2B) ולהפריד אותו מן המערכת הוסטיבולרית באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה של פיתוח, מבוך גרמי לא מסויד לחלוטין והוא גזור בקלות באמצעות מלקחיים. הסר את המבוך הגרמי של שבלול על ידי הפרדה זהירה החל בסוף הבסיס ומרגש apically באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועה הספירלה ואת איבר צמוד של קורטי הוא מפותל לאורך הספירלה של כישור (איור 2C). הסר בזהירות את האיבר של קורטי על ידי הבטחת רצועה ספירלה בשעה האזור וו הבסיס באמצעות מלקחיים ההתרה זה כאשר אתה מזיז apically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בבסיס, להסיר את הרצועה ספירלה מן האיבר של קורטי באמצעות מלקחיים # 55 דק (איור 2 ד). Micro-הבידוד של האיבר של האפיתל קורטי חושית (אופציונאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האיבר האזור וו קורטי הבסיס באמצעות שני מזרקים אינסולין ½ סמ&quot;ק עם U-100 28G מצורף לצמיתות ½ מחטים כמו מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בפסגת, להסיר את הספירלה לימבוס משורה של תאים שיער הפנימי והמשך basally (תאנה 2E-F). ציפוי האיבר של קורטי explant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון poly-L-ornithine/laminin/FBS מבארות תרבות ולהוסיף 130 μl של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת האיבר של קורטי גזור כדי coverslip הזכוכית מצופה בתרבות היטב המזרח explant כך cilia של תאים שיער מכוונים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום בתרבות גם באמצעות פיפטה 200 μL. ודא כי קרום basilar יוצר מגע עם מוצק coverslip הזכוכית מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 130 μL של המדיום תרבות לאיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 מ&quot;ל. החלת שתי טיפות על פני השטח של האיבר של קורטי ואז לאט לאט להוסיף את נפח הנותרים לצד coverslip. ודא כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C בנוכחות CO 5% 2. </li></ol> יום 3. Electroporation של הגן כתב לתוך איבר תרבותי של קורטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תרבות מאיבר של התרבות קורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 130 μL H 2 O דקות 1 ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה 200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של הכתב DsRed פלסמיד (2mg / מ&quot;ל H 2 O המאוחסן ב -20 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש את האלקטרודות של electroporator באמצעות micromanipulator כך האנודהקטודה nd הם משני צדי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור דופק (27V, 30 מילישניות משך, 10 רכבות הדופק) כדי electroporate הגן כתב לתוך איבר התרבות explant קורטי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להפוך את הקוטביות של הדופק כדי להבטיח electroporation של transgene על modiolar וגם רצועה ספירלית צידי explant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 130 μL של Fugene 6: פתרון ה-DNA (3 חלקים Fugene ל-DNA חלקי 2). פתרון זה אמור להיות מוכן לפני תחילת ההליך electroporation (שלב 20) באמצעות 3 התחתונה מ&quot;ל עגול פוליסטירן המבחנה במנדף זרימה למינרית. כדי להפוך את הפתרון הזה: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.4 μL של Opti-ממ (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.6 μL של מגיב 6 Fugene (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. הקפד להוסיף את Fugene ישירות Opti-ממ ולהימנע ממגע ישיר עם צדדים של המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.0 μL כתב DsRed פלסמיד DNA גדילי כפול (המאוחסן ב -20 ° C ב-DNA 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל H 2 aliquots O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל בינוני תרבות לתרבות היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים. </li></ol> נציג תוצאות אנו מציגים שיטה הבידוד של האיבר של קורטי מ - עכבר הלידה. ההליך יכול לשמש עכברים צעיר כמו יום עובריים 16 עד יום הלידה על 6, ובנקודה המבוך הגרמי הופך מסויד מספיק כדי להבהיר לנתיחה מסורבלת. לאחר האיבר של קורטי הוא גזור, זה עשוי להיות מצופה תרבותי או בשלמותה (איור 3) או אפיתל מיקרו מבודד חושית (איור 4). הצגנו עוד טכניקה כדי להביע את הגנים אקסוגניים באיבר תרבותי של קורטי. תרבות organotypic שימושית עבור סוגים רבים אחרים של מחקר, כגון ניתוח של איבר קורטי של ביטוי גנים באמצעות RT-PCR או הכלאה באתרו, איבר קורטי שיתוף התרבות תאים עם הגנגליון ספירלה או בתאי גזע ממקור חיצוני באמצעות מיקרו לבודד 3, או בניתוח חוץ גופית מוות שיער תא והתחדשות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /></a> באיור 1. הצלב סעיף של האיבר P4 Murine של קורטי. (א) חתך מ להפוך את הבסיס של שבלול cryosectioned המתקבל עכבר P4 ממחיש את מבנה כללי של שבלול Murine המתואר בפרוטוקול זה. התקשורת scala גובל רצועה הלולייניות stria vascularis רוחבית, הממברנה של Reissner superiorly, לימבוס ספירלה מדיאלית, ואת קרום basilar inferiorly. תיבת הצביע על האזור התרחב ב (ב) איבר קורטי ממוקם בצד מעולה של קרום basilar וכולל שורה אחת של תאים השיער הפנימיים, שלוש שורות של תאים השיער החיצונית, והתאים שלהם התומכים. קו מקווקו 1 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך איבר זה של דיסקציה קורטי. קו מקווקו 2 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך ההליך מיקרו הבידוד. גרין מציין תיוג immunohistochemical של calbindin, אשר תוויות תאים interdental של לימבוס ספירלה, תאים שיער שבלול, הגנגליון נוירונים ספירלה, כמו גם תאים של הרצועה ספירלה stria vascularis 7. תיוג DAPI של גרעיני הוא בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /></a> איור 2. איברים של דיסקציה קורטי. תמונות מתוך וידאו המלווה של האיבר של קורטי להדגיש דיסקציה) של מערכת שיווי המשקל ואת השבלול הממוקם בתוך העצם הטמפורלית מבודדים (אדום), ב &#39;) את המבוך הגרמי של שבלול, ג) את הרצועה ספירלה מצורף האיבר של קורטי לאחר הסרת המבוך הגרמי, ד) הסרת רצועה הלולייניות stria vascularis (אדום) של האיבר של קורטי, E) מיקרו הבידוד של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה (אדום), ו-F) מבודדים ספירלה לימבוס (משמאל) אפיתל סנסורי (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" /></a> איור 3. איבר תרבותי של קורטי explant. DIC התמונה מראה את איברקורטי של עכבר-P4 Atoh1 nGFP כי היה מבודד, מצופה, ותרבותי במשך חמישה ימים, כמתואר. עכבר זה כבר מהונדסים גנטית כך התאים המבטאים את הגן הפרו שיער תא homolog אטונלי 1 (aka Atoh1 Math1) התערוכה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא מקומי לגרעין 8. האיברים של קורטי מעכברים אלה תערוכה תווית ה-GFP גרעיני גרעיני כל תא שיער ולכן מאפשרים ראיה קל של האפיתל חושית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. הספירלה לימבוס גדול יחסית ניתן לראות לרוחב האפיתל חושית. תאים mesenchymal אשר מקורם האיבר של קורטי היגרו מן explant. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" /></a> איור 4. Micro-מבודדים אפיתל תחושתי. תמונה Epifluorescent המתקבל האפיתל חושית כי כבר מבודד איבר P4 Murine של קורטי כמתואר ותרבותיים בין לילה. מיקרו לבודד נקבע אז paraformaldehyde 4% ומעובד immunolabeling 7 א שרירן אשר תוויות בתאי השיער בשבלול. הערה העדר הספירלה לימבוס יחסית גדול מן הדמות 3. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="איור 5" border="0" /></a> איור 5. Electroporation של הגן כתב DsRed לתוך איבר תרבותי של קורטי. איברים שלמים של קורטי מן הגורים P4 Atoh1-nGFP עכבר בודדו, מצופה, ו electroporated אז עם הגן כתב DsRed כמתואר ואחר כך מתחת למיקרוסקופ epifluorescent. תאים של האיבר של קורטי explant כי הביע את חלבון מהונדס כתב DsRed התערוכה תאים פלואורסצנטי אנדוגני אדום התערוכה אפיתל סנסורי פלואורסצנטי ירוק גרעיני. התאים הטרנסגניים ניתן לראות ברחבי לימבוס ספירלה אפיתל תחושתי.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

ישנם כמה פרטים כי הם קריטיים להצלחת הליך זה. ככל שהזמן מהבידוד העצם הטמפורלית לאיבר של קורטי הדגירה, כך גובר הסיכוי כי האיברים יצרף coverslip והתוצאה בתרבויות איבר קיימא. לכן, חשוב להגביל את כמות הזמן בין לנתיחה ומיקום האיברים בחממה. הבחירה של אנטיביוטיקה היא קריטית גם, שכן אנטיביוטיקה aminoglycoside רבים ototoxic תגרום מוות של תאים שיער. אמנם עדיף לוותר על השימוש באנטיביוטיקה לגמרי, זה משאיר פתוחה את האפשרות של זיהום. לכן, אנו ממליצים על שימוש 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין ככלל להתגבר על בעיות זיהום פוטנציאליים. ההיבט המטריד ביותר של זה, הליכים אחרים לתרבות העיקרי של האיבר של קורטי, הוא הנטייה של איברים כדי לצוף מעל צלחות במהלך הדגירה. למרות תרבויות איבר צף יכול להישאר קיימא עבור 5-7 ימים, יש חסרונות של איברים culturing צף. למשל, בתרבויות איבר צף להתקפל לעתים קרובות על עצמם לאחר 4-5 ימים טיוח מיקרוסקופיה בעייתי. לאחר מכן, שלמות מבנית של איבר יכול להיות בסכנה בהשוואה לאיברים כי כבר מודבקת coverslip. מצאנו כי בטכניקות הבאות לעזור להבטיח כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. ראשית, זכוכית מעיל coverslips ב 01:01 polyornithine / laminin בתוספת 20% FBS כמתואר. הדגירה לילה קרא בפרוטוקול זה הזמן המינימלי כי הצלחת צריך להיות מצופה. במעבדה שלנו, אנחנו לעתים קרובות מעיל את כל הצלחות שאנו זקוקים למשך שבוע ולשמור אותם על 4 מעלות צלזיוס עד יום לפני השימוש, כאשר אנו להעביר אותם בחממה במשך הדגירה לילה. שנית, לאחר האיברים מועברים coverslips מצופה, המזרח explant כך cilia של תאים שיער הפנים כלפי מעלה. אוריינטציה זו תקל על דבקות של קרום basilar לצלחת התרבות. שלישית, להסיר את התקשורת בתוך הבאר לצרף explant אל צלחת מצופה. פעולה זו תבטיח קשר בין המנה תרבות הממברנה basilar ולשפר את היכולת של explants לדבוק הזכוכית. זה יהיה גם לסייע בשמירה על שלמות מבנית של שורות תאים שיער. לבסוף, בזהירות לטפטף 2 טיפות בינוני תרבות על פני השטח של האיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 קיבולת μL ואז לאט לאט למלא היטב על ידי טפטוף נפח הנותרים (של μL 130 סה&quot;כ) בצד של coverslip. חשוב לעבוד במהירות כדי להבטיח את הקובץ המצורף של האיבר של קורטי אל coverslip המצופה. מ חניכה של לנתיחה כדי הדגירה של explants, זה בדרך כלל לוקח 10 דקות עבור המפעיל מיומנת כדי להשלים את האיבר של ההליך בידוד קורטי. בפרוטוקול זה, אנו גם מציגים שיטה לבידוד מיקרו של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה של האיבר של קורטי. בהליך זה, לימבוס הספירלה הוא גזור מן האפיתל חושית באמצעות 28G ½ מחטים אינסולין ככלים לנתיחה. כתוצאה מכך מיקרו לבודד מורכב שורות של תאים השיער ואת התאים המתאימים תמיכה (איור 3). אפיתל סנסורי מבודד אז יכול להיות מתורבת, כמתואר בפרוטוקול זה. הליך זה מיקרו הבידוד צריך להיות לעומת ההפרדה האנזימטית של epithelia החושי מן הרקמה הסובבת 4. אצל יונקים, כמו גם מינים שאינם יונקים כגון תרנגולות, עיכול thermolysin שיווי המשקל של האיברים תוצאות מבודדים בבידוד של epithelia חושית מתאי מרתף mesenchymal 4. ב עכברוש שבלול, התוצאות thermolysin העיכול בהפרדה הרכס אפיתל יותר, רכס אפיתל פחותים epithelia חושית מלווה מן הקרום המרתף 5. עם זאת, לא ברור אם אפיתל סנסורי שבלול יכול לצרף את הצלחות בלי מצופים בתאים mesenchymal הנלווים. בעוד הן את שיטת בידוד מכני מיקרו עיכול אנזימטי שיטה לגרום להפרדת epithelia החושי מן לימבוס ספירלה, היתרונות של דיסקציה מיקרו לבודד את פני העיכול thermolysin לכלול בפרוטוקול קצר יחסית, ריאגנטים זול, מתח פוטנציאלי פחות explant בשל ההשפעות האנזימטית של העיכול. בנוסף, קרום המרתף נותר ללא שינוי בגישה זו, אשר עשוי לשפר את הקשר של האפיתל חושית הצלחת תרבות. החסרונות של שיטה זו כוללים את הצורך לפתח את הכישורים לנתיחה זה עדין נזק מכני פוטנציאל האפיתל חושית הנובע דיסקציה מיקרו. כדוגמה השירות של הליך זה, אנו גם מציגים דוגמה אחת לשימוש של איבר שלקורטי תרבויות; electroporation של גנים ממקור חיצוני לתוך התרבות explant. ההליך electroporation שתוארו לעיל מבוסס על שיטות קודמות של איבר electroporation קורטי. יש לציין, נג ו גאו (2000) לתאר את electroporation של איברים עכברוש מבודד של קורטי שבו explants מוחזקים מקום electroporation ידי חריץ יצוק של agarose ו מצופה מכן על קולגן שקופיות מצופה 8-LabTek היטב במדיום סרום ללא 2. היתרון של הגישה שלהם היא כי האיברים מכוונים כך משטחים העליון של explants פני הקתודה, אשר אמור תיאורטית לגרום הפצה גם של תאים electroporated ברחבי explant. בידיים שלנו לעומת זאת, השיטה שאנחנו מתארים שיפור על הליך זה, כי האיבר של קורטי נשאר מודבקת coverslip לאורך ההליך ובכך להפחית את המניפולציה של explant לאחר electroporation. בנוסף, אחוז גבוה יותר של איברים של קורטי נשאר קשור coverslips בשיטה זו המוצגים. השיטה שלנו נלקח ג&#39;ונס, et al. (2006) אשר משתמשת תוספת של מגיב 6 Fugene כדי להגביר את היעילות של ביטוי גנים לאחר electroporation. בפרוטוקול Jones et al. (2006), איברים הם electroporated, מודגרות במשך 5 דקות עם 100 μL של מגיב 6 transfection Fugene, ו 6 מצופה. השיטה שלנו שונה בשימוש יחס 3:02 של מגיב 6 Fugene ל-DNA פלסמיד, אשר מצאנו אמפירית לתת ביטוי מהונדס אופטימלי עם רעילות איבר מינימלי. אנחנו לא משתמשים חי Fugene מגיב 6, אשר עלולה לגרום לרעילות של תרבויות. תצורת אלקטרודה בפרוטוקול שלנו, כמו גם ג&#39;ונס et al. (2006), התוצאה היא ביטוי גנים העיקרי או הספירלה או לימבוס אפיתל סנסורי תלוי בעמדה של הקתודה. אמנם ישנם תאים חיובי DsRed בצד הרחוק של התרבות לקתודה, יש ריכוז גבוה של תאים מהונדס קרוב הקתודה. כדי להבטיח ביטוי מלא של transgene בשני צידי האיבר של קורטי explant, הזרם יכול להיות הפוך לרכבת הדופק השני על ידי היפוך פשוט מוביל. פרוטוקול התוצאות המוצגות ביטוי חזק של transgene לאורך האיבר של קורטי (איור 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

ב כל היונקים, אפיתל סנסורי לאודישן ממוקם לאורך האיבר של קורטי מתפתלת השוכן בתוך שבלול בצורת קונכייה של האוזן הפנימית (איור 1). תאים שיער של שבלול פיתוח, שהם תאים mechanosensory של מערכת השמיעה, מיושרים בשורה אחת של תאים שיער הפנימי שלושה (בבסיס לאמצע פונה) עד ארבעה (בתורו apical) שורות של תאים השיער החיצונית כי תוחלת אורך האיבר של קורטי. תאים שיער transduce קול-Induced תנודות מכניות של הממברנה basilar לאימפולסים עצביים שהמוח יכול לפרש. רוב המקרים של אובדן שמיעה sensorineural נגרמים מוות או תפקוד לקוי של תאים שיער שבלול. כלי חיוני יותר ויותר מחקרים שמיעתי הוא בידוד בתרבות במבחנה של explant האיבר 1,2,9. מבודדים פעם, explants עלול להיות מנוצל במספר דרכים על מנת לספק מידע בנוגע נורמטיבית, חריג, או הפיזיולוגיה טיפולית. התבטאות גנים, תנועתיות stereocilia, התא ביולוגיה מולקולרית, וכן גישות הביולוגי התחדשות התאים השיער הם דוגמאות של יישומים ניסיוני של איבר explants קורטי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי מעכברים הילוד. הווידאו הנלווה כולל כיוונים בשלבים עבור בידוד של העצם הטמפורלית מן הגורים העכבר, ובידוד הבאות של שבלול, רצועה ספירלית, ועל איבר קורטי. מבודדים פעם, האפיתל חושית יכול להיות מצופה תרבותי במבחנה בשלמותו, או כמו גזור נוספת מיקרו לבודד כי חסרה את הספירלה לימבוס ונוירונים ספירלה גנגליון. באמצעות שיטה זו, explants העיקרי יכול להישמר במשך 7-10 ימים. כדוגמה השירות של הליך זה, האיבר של קורטי explants יהיה electroporated עם הגן כתב אקסוגניים DsRed. שיטה זו מספקת שיפור פני שיטות אחרות שפורסמו משום שהוא מספק כיוונים לשחזור, חד משמעי, ועל בשלבים עבור הבידוד, microdissection, התרבות העיקרית של האיבר של קורטי.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.7K Views.  Harvard Medical School. הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

Video: Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation של mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

חשיפת דלקת מפרקים דלקתית: חקירת תפקודים של תאים סינוביאליים

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. It is important to understand the functions of both cell populations to reveal the mechanisms underlying pathological progression and remission in inflammatory arthritis. In general, in vitro experimental conditions should mimic the in vivo environment as much as possible. Primary tissue-derived cells have been used in experiments characterizing synovial fibroblasts in arthritis. In contrast, in experiments investigating the biological functions of macrophages in inflammatory arthritis, cell lines, bone marrow-derived macrophages, and blood monocyte-derived macrophages have been used. However, it is unclear whether such macrophages actually reflect the functions of tissue-resident macrophages. To obtain resident macrophages, previous protocols were modified to isolate and expand both primary macrophages and fibroblasts from synovial tissue in an inflammatory arthritis mouse model. These primary synovial cells may be useful for in vitro analysis of inflammatory arthritis.

מחבר זרקור: בידוד ותרבות של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין  

The present study provides a modified protocol to isolate synovial macrophages and fibroblasts from murine inflammatory arthritis tissue.

בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...