فإن الكتاب أود أن أشكر Demêmes دانييل وCotanche دوغلاس ولما بذلوه من جهود في مجال التدريس لنا الطرق لعزل الجهاز كورتي. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر إسماعيل ستيفانوف - فاغنر للهندسة الأقطاب electroporator ؛ شيري لين عن أعمالها الفنية التي تسهم في الرسوم المتحركة الفيديو ، ومتى شانا ، ميكر جيسون ، وكندرا مارشال ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) لإنتاج الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح (R03DC010065 - باركر ؛ RO1DC007174 الحافة ؛ P30DC05209 MEEI النواة لدعم أبحاث السمع) من NIDCD.

اليوم 1. التعقيم وطلاء الزجاج coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جاف coverslips ميكروسكوب في الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع coverslips تعقيمها في بئرين من قبل تعقيمها جيدا أربعة خلية طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف مع coverslips 01:01 بولي - L - الأورنيثين laminin وتستكمل مع مصل بقري جنيني من 20 ٪ (FBS) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 ميكرولتر بولي - L - الأورنيثين (محلول 0.01 ٪ المخزنة في 4 درجات مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 laminin ميكرولتر (50 ميكروغرام / مل محلول المخزون المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 ميكرولتر FBS (المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة تعقيم الأدوات تشريح بين عشية وضحاها في حاضنة 150 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مستنبت يحتوي على مصل الدم 10 ٪ و 10 الأمبيسيلين ملغ / مل. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 مل Dulbecco في التعديل النسر متوسطة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل FBS (المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل مصل الحصان (المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأمبيسيلين 10 ميكرولتر (10 ملغ / مل حل الأسهم المخزنة في 4 درجات مئوية) </li></ol></li></ol> اليوم 2. بمعزل عن جهاز كورتي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم تشريح تدفق إيجابي غطاء محرك السيارة. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش جميع الأسطح مع الايثانول 70 ٪ وانتظر 5 دقائق قبل الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفأر الجرو (P4) في قاعدة ماغنوم الثقبة باستخدام مقص التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لفترة وجيزة في الرأس في صحن 10 سم تحتوي على الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البشرة باستخدام شفرة المشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجمجمة على طول الدرز السهمي باستخدام شفرة المشرط ومن ثم تقسم على الدماغ المقدم. الإبقاء على الدماغ المقدم عجزي عن المزيد من التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ الأمامي ، والمخيخ وجذع الدماغ باستخدام تشريح حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العظام الزمنية (الشكل 2A) ، وتراجع لفترة وجيزة في الإيثانول منهم 70 ٪ ، ونقلها إلى طبق 3 ملم تحتوي على HBSS العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط ، إزالة الفقاعة والأنسجة المحيطة بها من الجزء الصخري للعظم الصدغي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد شكل محارة القوقعة (الشكل 2B) وفصلها عن النظام الدهليزي باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذه المرحلة من التنمية ، وليس متاهة العظمية متكلسة تماما ويتم تشريح بسهولة باستخدام ملقط. إزالة التيه العظمي من القوقعة التي فصل دقيق ابتداء من نهاية القاعدية وتتحرك apically باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وملفوف في الرباط الحلزوني وجهاز المرفقة كورتي على طول اللولب عماد القوقعة (الشكل 2C). إزالة بعناية جهاز كورتي من خلال تأمين في الرباط الحلزوني في المنطقة هوك في قاعدة الفك باستخدام ملقط وأنها تقوم بنقل apically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابتداء من القاعدة ، وإزالة الرباط دوامة من جهاز كورتي باستخدام الملقط غرامة # 55 (الشكل 2D). الجزئي بمعزل عن جهاز كورتي ظهارة حسية (اختياري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجهاز من منطقة كورتي هوك في قاعدة باستخدام اثنين مع 28G U - 100 يعلق بشكل دائم ½ الإبر والمحاقن ملقط الأنسولين ½ سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من قمة ، وإزالة الحوف دوامة من صف من خلايا الشعر الداخلي والمضي قدما basally (التين 2E - F). طلي الجهاز من يزدرع كورتي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل poly-L-ornithine/laminin/FBS من الآبار والثقافة ، وإضافة 130 ميكرولتر من المتوسط ​​الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجهاز تشريح كورتي إلى ساترة الزجاج المطلي في الثقافة بشكل جيد وتوجيه يزدرع بحيث أهداب من خلايا الشعر إلى الارتفاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة في الثقافة جيدا باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. تأكد من أن الغشاء القاعدي يجعل الاتصال متينة مع ساترة الزجاج المطلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بعناية 130 ميكرولتر من مستنبت للجهاز كورتي باستخدام ماصة مل 200. تطبيق نقطتين على سطح الجهاز كورتي ثم إضافة ببطء حجم المتبقية إلى جانب ساترة. تأكد من أن جهاز كورتي لا تطفو في وسائل الإعلام والثقافة ، لكنها لا تزال الملصقة على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في وجود 5 ٪ CO 2. </li></ol> اليوم 3. Electroporation من الجينات في الجهاز الصحافي المثقف كورتي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت من الجهاز للثقافة كورتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر 130 H 2 O : 1 دقيقة ثم إزالة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من مراسل DsRed البلازميد (2mg / مل H 2 O المخزنة في -20 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدم الأقطاب من electroporator باستخدام micromanipulator بحيث الأنود aالثانية هي الكاثود على جانبي الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد نبضة (27V ، و 30 مللي ثانية مدتها 10 نبضة القطارات) لمراسل electroporate الجين في الجهاز الثقافة يزدرع كورتي. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري : عكس القطبية للنبض لضمان electroporation من التحوير على modiolar كلا الجانبين والرباط دوامة من ازدراع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 130 ميكرولتر من Fugene 6 : حل الحمض النووي (3 أجزاء الحمض النووي للأجزاء Fugene 2). وينبغي إعداد هذا الحل قبل بدء الإجراء electroporation (الخطوة 20) باستخدام جولة 3 مل أسفل البوليسترين في أنبوب اختبار تدفق الصفحي هود. لجعل هذا الحل : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.4 ميكرولتر من OPTI - MEM (المخزنة في 4 درجات مئوية) في أنبوب اختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.6 ميكرولتر من 6 كاشف Fugene (المخزنة في 4 درجات مئوية) في أنبوب اختبار. تأكد من إضافة Fugene مباشرة إلى OPTI - MEM وتجنب الاتصال المباشر مع الجانبين للأنبوب اختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لمدة 1 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.0 ميكرولتر مراسل البلازميد DsRed مضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل (المخزنة في -20 درجة مئوية في الحمض النووي ميكروغرام / 100 مل aliquots H 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لمدة 1 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميليلتر من مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لمدة 1 ثانية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في ثاني 5 ٪ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل مستنبت للثقافة بشكل جيد واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 يوما. </li></ol> ممثل النتائج نقدم طريقة لعزل الجهاز كورتي من ماوس حول الولادة. ويمكن استخدام هذا الإجراء بالنسبة للفئران لم يتجاوزن اليوم الجنينية تصل إلى حوالي 16 يوما بعد الولادة 6 ، وعند هذه النقطة يصبح متكلسة بصورة كافية لجعل التيه العظمي تشريح مرهقة. مرة واحدة يتم تشريح الجهاز كورتي ، قد يكون مطلي انه مثقف وإما في مجملها (الشكل 3) أو الجزئي معزولة ظهارة حسية (التين 4). قدمنا ​​كذلك تقنية للتعبير جينات دخيلة في جهاز مثقف كورتي. ثقافة عضوي النمط مفيد لأنواع أخرى عديدة من الدراسة ، مثل جهاز تحليل التعبير الجيني كورتي باستخدام RT - PCR أو التهجين في الموقع ، جهاز كورتي شارك في الثقافة مع خلايا العقدة الحلزونية أو الخلايا الجذعية الخارجية باستخدام عزل متناهية الصغر 3 ، أو في التحليل المختبري من موت الخلايا الشعر والتجدد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /></a> الشكل 1. المقطع العرضي للجهاز P4 الفئران كورتي. (أ) من المقطع العرضي بدوره القاعدية من القوقعة cryosectioned تم الحصول عليها من ماوس P4 يوضح الهياكل العامة للالقوقعة الفئران الموصوفة في هذا البروتوكول. يحدها من قبل وسائل الإعلام سكالا في الرباط الحلزوني وعائي السطور أفقيا ، وغشاء Reissner ق متفوق ، وحوف دوامة بشكل إعلامي ، والغشاء القاعدي دون المستوى. وأشار مربع في المنطقة الموسعة في باء (B) ويقع الجهاز كورتي على الجانب العلوي للغشاء القاعدي ، ويشمل صف واحد من خلايا الشعر الداخلية ، ثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجي ، ودعم كل منها الخلايا. 1 يشير إلى خط متقطع الموقع على طول الغشاء القاعدي أن تتم إزالة هذا الجهاز خلال التشريح كورتي. 2 خط متقطع يشير الموقع على طول الغشاء القاعدي أن تتم إزالة أثناء إجراء الدقيقة العزلة. تشير العلامات الخضراء المناعى من calbindin ، التي تصف الخلايا بين الأسنان من دوامة حوف ، وخلايا شعر القوقعة ، العقدة العصبية لولبية ، وكذلك الخلايا في الرباط الحلزوني وعائي السطر 7. دابي وسم نوى في الزرقاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" border="0" /></a> الشكل 2. تشريح جهاز كورتي. صور من شريط الفيديو المرافق للجهاز من تسليط الضوء على تشريح كورتي أ) النظام الدهليزي القوقعة والتي تقع داخل العظم الصدغي معزولة (الحمراء) ، B) في متاهة من القوقعة العظمية ، C) في الرباط ودوامة المرفقة جهاز كورتي بعد إزالة المتاهة العظمية ، D) إزالة الرباط الحلزوني وعائي السطر (أحمر) من جهاز كورتي ، E) الصغيرة عزلة ظهارة حسية من دوامة حوف (الحمراء) ، وواو) معزولة دوامة حوف (يسار) وظهارة حسية (يمين). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="الشكل 3" border="0" /></a> الشكل 3. عضو مثقف من يزدرع كورتي. صورة تظهر مدينة دبي للإنترنت من الجهازكورتي للماوس Atoh1 - P4 nGFP التي كانت معزولة ، مطلي ، وتربيتها لمدة خمسة أيام كما هو موضح. وقد تم هذا الفأر وراثيا بحيث الخلايا التي تعبر عن الجين الخلايا الموالية للشعر واهن homolog 1 (الملقب Atoh1 Math1) يحمل بروتين الفلورية الخضراء التي يتم المترجمة إلى النواة 8. أجهزة كورتي من هذه الفئران يحمل تسمية GFP النووي في نواة الخلية كل الشعر ، وبالتالي السماح لرؤية سهلة للظهارة حسية باستخدام المجهر epifluorescent. ويمكن أن ينظر إلى دوامة كبيرة نسبيا حوف الوحشي للظهارة حسية. خلايا اللحمة المتوسطة هاجروا التي نشأت من جهاز كورتي بعيدا عن ازدراع. التسمية النووية الأزرق دابي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="الشكل 4" border="0" /></a> الشكل 4. الصغيرة المعزولة ظهارة حسية. Epifluorescent صورة تم الحصول عليها من ظهارة حسية الذي تم عزله من الجهاز P4 الفئران كورتي كما هو موضح والمثقف بين عشية وضحاها. تم إصلاح ثم عزل في الدقيقة بارافورمالدهيد 4 ٪ ومعالجتها للimmunolabeling 7A من الميوسين الذي تسميات خلايا الشعر القوقعة. لاحظ غياب حوف دوامة أكبر نسبيا من الرقم 3. التسمية النووية الأزرق دابي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="الشكل 5" border="0" /></a> الشكل 5. Electroporation من الجينات مراسل DsRed في الجهاز مثقف كورتي. عزلت أجهزة الجامعة كورتي من الجراء P4 الماوس Atoh1 - nGFP ، مطلي ، وelectroporated ثم مع الجين مراسل DsRed كما هو موضح ومن ثم ينظر تحت المجهر epifluorescent. خلايا جهاز كورتي يزدرع أن أعرب عن البروتينات المعدلة وراثيا مراسل DsRed يحمل خلايا الدم الحمراء ومضان الذاتية للمعرض ظهارة حسية ومضان أخضر النووية. ويمكن رؤية الخلايا المعدلة وراثيا في جميع أنحاء حوف دوامة وظهارة حسية.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

هناك العديد من التفاصيل التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح هذا الإجراء. وأقصر وقت من العزلة العظم الصدغي للجهاز حضانة كورتي ، زادت فرصة أن الأجهزة سوف نعلق على ساترة ، ويؤدي في الثقافات الجهاز قابلة للحياة. لذا ، فمن المهم للحد من مقدار الوقت بين التشريح ووضع الأجهزة في الحاضنة. اختيار المضادات الحيوية أمر حاسم أيضا ، لأن المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد كثيرة السامة ، وسوف يؤدي إلى موت الخلايا الشعر. على الرغم من أنه من الأفضل التخلي عن استخدام المضادات الحيوية تماما ، وهذا يترك الباب مفتوحا أمام إمكانية للتلوث. لذا ، نقترح استخدام 10 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين كقاعدة عامة للتغلب على مشاكل التلوث المحتملة. الجانب الأكثر إزعاجا من ذلك ، وغيرها من الإجراءات لثقافة الرئيسي للهيئة في كورتي ، والميل للأجهزة لتطفو قبالة لوحات أثناء الحضانة. على الرغم من الثقافات الجهاز عائمة يمكن أن تبقى صالحة لمدة 5-7 أيام ، وهناك عيوب أجهزة زراعة العائمة. على سبيل المثال ، والثقافات الجهاز العائمة أضعاف في كثير من الأحيان على أنفسهم بعد 4-5 أيام تقديم المجهري للمشاكل. بعد ذلك ، يمكن أن تصبح خطر على السلامة الهيكلية للجهاز بالمقارنة مع الأجهزة التي تم اضافته الى ساترة. لقد وجدنا أن تساعد الطرق التالية للتأكد من أن جهاز كورتي لا تطفو في وسائل الإعلام والثقافة ، لكنها لا تزال الملصقة على ساترة. أولا ، ومعطف الزجاج coverslips في polyornithine 1:1 / laminin تستكمل مع FBS 20 ٪ كما هو موضح. وبين عشية وضحاها حضانة دعا في هذا البروتوكول هو الحد الأدنى من الوقت الذي يجب أن تطلى اللوحة. في المختبر لدينا ، فإننا كثيرا ما معطف جميع لوحات أننا في حاجة لمدة اسبوع والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى قبل يوم ونحن لاستخدامه عند نقلها إلى حاضنة لتفريخ بين عشية وضحاها. الثانية ، بعد أن يتم نقلها إلى أجهزة coverslips المغلفة ، وتوجيه يزدرع بحيث أهداب من خلايا الشعر مواجهة. وهذا التوجه تسهيل انضمام الغشاء القاعدي للصحن الثقافة. ثالثا ، إزالة وسائل الإعلام داخل البئر ليضعوا على لازدراع الطبق المطلي. وهذا ضمان الاتصال بين الطبق والثقافة ، والغشاء القاعدي وتعزيز قدرة explants التمسك الزجاج. هذا سوف يساعد أيضا في الحفاظ على السلامة الهيكلية للصفوف من خلايا الشعر. أخيرا ، بالتنقيط بعناية 2 قطرات من الثقافة المتوسطة على سطح الجهاز كورتي باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ثم ملء ببطء البئر بواسطة نازف حجم المتبقية (من مجموع 130 ميكرولتر) على جانب من ساترة. من المهم أن نعمل بسرعة لضمان الحجز على الجهاز كورتي إلى ساترة المغلفة. من الشروع في تشريح لحضانة explants ، فإنه عادة ما يستغرق 10 دقائق لمشغل يمارس لإكمال هذا الجهاز الداخلي العزلة كورتي. في هذا البروتوكول ، نقدم أيضا وسيلة لعزل الجزئي للظهارة حسية من حوف دوامة جهاز كورتي. في هذا الإجراء ، يتم تشريح حوف دوامة بعيدا عن ظهارة حسية باستخدام إبر الأنسولين 28G ½ كأدوات تشريح. ويتكون الناتج الدقيقة عزل للصفوف من خلايا الشعر ويناظرها الخلايا الداعمة (الشكل 3). ويمكن عندئذ للظهارة حسية تكون معزولة مثقف كما هو موضح في هذا البروتوكول. وينبغي مقارنة هذا الإجراء العزل الجزئي للفصل الأنزيمية للظهائر الحسية من الأنسجة المحيطة 4. في الثدييات ، فضلا عن الأنواع غير الثدييات مثل الدجاج ، والهضم thermolysin معزولة النتائج الأجهزة الدهليزي في عزلة ظهائر الحسية من خلايا اللحمة المتوسطة قبو 4. في القوقعة الفئران ، ونتائج عملية الهضم thermolysin في فصل الحرف أكبر الظهارية ، والحرف أقل الظهارية ظهائر الحسية المصاحبة من الغشاء القاعدي 5. ومع ذلك ، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت قوقعة ظهارة حسية يمكن أن نعلق على لوحات مغلفة دون خلايا اللحمة المتوسطة المصاحبة. في حين أن كلا الميكانيكية الدقيقة العزلة الأسلوب والطريقة الأنزيمية نتيجة الهضم في فصل ظهائر الحسية من دوامة حوف ، مزايا التشريح الدقيقة عزل على الهضم thermolysin تشمل بروتوكول أقصر نسبيا ، وأرخص المواد الكاشفة ، والتوتر المحتمل أن تكون أقل ونتيجة للتأثيرات يزدرع الأنزيمية للهضم. بالإضافة إلى ذلك ، يتم ترك سليمة الغشاء القاعدي في هذا النهج ، الذي قد يؤدي إلى تعزيز مرفق للظهارة حسية إلى لوحة الثقافة. مساوئ هذا الأسلوب تشمل الحاجة لتطوير المهارات اللازمة لهذا التشريح الدقيق والأضرار الميكانيكية المحتملة للظهارة حسية الناتجة عن التشريح الجزئي. كمثال على فائدة هذا الإجراء ، ونحن أيضا تقديم مثال واحد على استخدام جهازكورتي الثقافات ، وelectroporation جينات دخيلة في ثقافة ازدراع. ويستند هذا الإجراء electroporation المذكورة أعلاه على الطرق السابقة من جهاز electroporation كورتي. على وجه الخصوص ، وتشنغ قاو (2000) وصفا لelectroporation الأجهزة الفئران المعزولة كورتي حيث يحتجز في مكان لexplants electroporation بواسطة أخدود مصبوب من agarose ومطلي ثم على الكولاجين المغلفة الشريحة LabTek 8 جيدا في المصل خالية المتوسطة 2. ميزة هذا النهج هو أنه موجهة الأجهزة بحيث السطوح أعلى explants مواجهة القطب السالب ، والتي ينبغي أن يؤدي نظريا في التوزيع حتى من الخلايا electroporated عبر ازدراع. في أيدينا إلا أن الطريقة التي وصفنا تحسن على هذا الإجراء لأن الجهاز كورتي بقيت الملصقة على ساترة في جميع أنحاء الداخلي مما يحد من التلاعب في يزدرع بعد electroporation. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال تعلق نسبة أعلى من أجهزة كورتي إلى coverslips باستخدام هذه الطريقة المعروضة. يؤخذ من أسلوبنا جونز ، وآخرون (2006) والذي يستخدم إضافة كاشف 6 Fugene لزيادة كفاءة في التعبير الجيني بعد electroporation. في بروتوكول جونز وآخرون (2006) ، وelectroporated أجهزة والمحتضنة لمدة 5 دقائق مع 100 ميكرولتر من كاشف Fugene ترنسفكأيشن 6 ، و 6 مطلي. أسلوبنا يختلف في استخدام نسبة 3:02 من 6 كاشف Fugene لبلازميد الحمض النووي ، الذي وجدناه تجريبيا لتوفير وراثيا التعبير الأمثل مع سمية الجهاز الأدنى. نحن لا نستخدم مخفف Fugene 6 كاشف ، التي يمكن أن تؤدي إلى تسمم في الثقافات. التكوين الكهربائي في بروتوكول لدينا ، فضلا عن جونز وآخرون (2006) ، والنتائج الأولية في التعبير الجيني في دوامة إما حوف ظهارة حسية أو تبعا للموقف الكاثود. على الرغم من أن هناك خلايا DsRed ايجابية على الجانب من الثقافة بعيدة إلى القطب السالب ، وهناك تركيز أعلى من الخلايا المعدلة وراثيا أقرب إلى الكاثود. لضمان التعبير الكامل للالتحوير في كلا الجانبين من جهاز ازدراع كورتي ، يمكن عكس التيار لقطار نبضة الثانية يقود عكس ببساطة. النتائج الواردة في بروتوكول تعبير قوي من التحوير في جميع أنحاء جهاز كورتي (الشكل 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

في جميع الثدييات ، ويقع ظهارة حسية عن الاختبار على طول الجهاز المتصاعد كورتي التي تتواجد داخل القوقعة في شكل محارة الأذن الداخلية (أنظر الشكل 1). يتم محاذاة خلايا الشعر في القوقعة النامية ، والتي هي الخلايا mechanosensory النظام السمعي ، في صف واحد من خلايا الشعر الداخلي وثلاثة (في منتصف القاعدة ويتحول) إلى أربعة (في مطلع القمي) صفوف من خلايا الشعر الخارجي التي تمتد على طول جهاز كورتي. خلايا الشعر تنبيغ الصوت الناجم عن الاهتزازات الميكانيكية في الغشاء القاعدي في النبضات العصبية التي يمكن للدماغ تفسيرها. هي سبب معظم حالات فقدان السمع الحسي عليها بالإعدام أو خلل في خلايا الشعر القوقعة. أداة أساسية على نحو متزايد في مجال البحوث السمعي هو العزلة والثقافة في المختبر لازدراع الجهاز 1،2،9 مرة واحدة معزولة ، يمكن الاستفادة من explants في عدة طرق لتوفير المعلومات المتعلقة المعيارية ، شاذة ، أو علم وظائف الأعضاء العلاجية. التعبير الجيني ، حركية أهداب ساكنة ، الخلية والبيولوجيا الجزيئية ، وكذلك النهج البيولوجية لتجديد خلايا الشعر هي أمثلة على التطبيقات التجريبية للجهاز explants كورتي. يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل وثقافة جهاز كورتي من الفئران حديثي الولادة. شريط الفيديو المرافق تشمل الاتجاهات متدرج للعزلة العظم الصدغي من الجراء الماوس ، والعزلة لاحقة من القوقعة ، الرباط لولبية ، وجهاز كورتي. مرة واحدة معزولة ، ويمكن مطلي ظهارة حسية وتربيتها في المختبر في مجمله ، أو في شكل تشريح أخرى. عزل الصغيرة التي تفتقر إلى حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحفاظ على explants الأولية لمدة 7-10 أيام. كمثال على فائدة هذا الإجراء ، سيتم electroporated جهاز explants كورتي مع الجين مراسل DsRed الخارجية. هذا الأسلوب يوفر تحسنا اكثر من غيرها من أساليب المنشورة لأنها توفر توجيهات يمكن استنساخه ، لا لبس فيها ، ومتدرج للعزلة ، microdissection والثقافة الأساسي للجهاز كورتي.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

يصف هذا الإجراء وسيلة لعزل والثقافة الجهاز الفئران كورتي مع أو بدون حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية. نظهر أيضا طريقة للتعبير عن الجينات مراسل الخارجية في جهاز ازدراع كورتي بواسطة electroporation.

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.7K Views.  Harvard Medical School. يصف هذا الإجراء وسيلة لعزل والثقافة الجهاز الفئران كورتي مع أو بدون حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية. نظهر أيضا طريقة للتعبير عن الجينات مراسل الخارجية في جهاز ازدراع كورتي بواسطة electroporation.

Video: Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation من مايكوباكتيريا

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

عزل وثقافة الكريات الكيراتينية الفموية الأولية من الحنك الفأري البالغ

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

كشف النقاب عن التهاب المفاصل: استكشاف وظائف الخلايا الزليلية

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. It is important to understand the functions of both cell populations to reveal the mechanisms underlying pathological progression and remission in inflammatory arthritis. In general, in vitro experimental conditions should mimic the in vivo environment as much as possible. Primary tissue-derived cells have been used in experiments characterizing synovial fibroblasts in arthritis. In contrast, in experiments investigating the biological functions of macrophages in inflammatory arthritis, cell lines, bone marrow-derived macrophages, and blood monocyte-derived macrophages have been used. However, it is unclear whether such macrophages actually reflect the functions of tissue-resident macrophages. To obtain resident macrophages, previous protocols were modified to isolate and expand both primary macrophages and fibroblasts from synovial tissue in an inflammatory arthritis mouse model. These primary synovial cells may be useful for in vitro analysis of inflammatory arthritis.

تسليط الضوء على المؤلف: عزل وثقافة الضامة الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران  

The present study provides a modified protocol to isolate synovial macrophages and fibroblasts from murine inflammatory arthritis tissue.

عزل وثقافة البلاعم الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...