We would like to acknowledge Dr. Bradley Schulte for comments on this protocol. This work was supported by National Institutes of Health grant R00 (5R00DC010220). This project was performed in a renovated laboratory space supported by Grant C06RR014516.

הערה: כל הפרוטוקולים באמצעות בעלי חיים חייבת להיות נבדקו ואושרה על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) וחייבת לעקוב אושרה שיטות לטיפול ולשימוש בחיות המעבדה באופן רשמי. כל הניתוחים צריכים להתבצע באמצעות טכניקה סטרילית על ספסל זרימה למינרית נקי. כפפות ומסיכה, אם תרצה בכך, יש ללבוש במהלך הליך זה. 1. Dissection של האוזן הפנימית עכבר עוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה לצורך האיבר של קורטי תרבויות explant: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע תרבית רקמת הזרימה למינרית ידי הפעלת אור UV למשך כ 30 דקות ולחטא את המשטח עם אתנול 70% לפני השימוש. בנוסף, לעקר את כל מכשירי הנתיחה כולל כלים לנתיחה משובחים ומנות מצופות Sylgard לנתיחה עובר באמצעות החיטוי או על ידי השרייה באתנול 70% לפחות 20 דקות לפני השימוש. יוצקים את אתנול 70% ולאפשר את הכלים ומכשירים לייבוש באוויר בזרימה למינרית קליאה נקייהספסל n לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח מאוזנת של האנק סטרילית (HBSS) / (4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic) תערובת (HEPES) על ידי הוספת 10% מ10x HBSS ו 0.5% HEPES ולהתאים את ה- pH של כ 7.2 ומסנן לעקר פתרון סופי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע את כל הניתוחים בפתרון HBSS / HEPES מקורר לשמר את הרקמה טובה יותר לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים מזכוכית מעיל תחתון עם מטריצת קרום במרתף על ידי הוספת 5 מיליליטר של הנשר בינוני השתנה הקר (4 ° C) סטרילי של Dulbecco (DMEM) לaliquot 300 μl של מטריצת קרום במרתף בצינור פוליפרופילן סטרילי 15 מיליליטר. מערבבים על ידי vortexing את התוכן ולהוסיף 150 μl של תערובת המטריצה-DMEM קרום במרתף למרכז של כל מנה תרבות, כך שהוא מכסה את כל התרבות גם בהווה במרכז הצלחת. לכסות את הכלים וחנות בחממה 37 ° C לפחות 45 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 4-5 מיליליטר מקורר HBSS לתוך הרי צלחות פטרי קלקר סטרילי ולהשאיר סגורים במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות בצינור 15 מיליליטר פוליפרופילן סטרילי על ידי הוספת 9 מיליליטר של DMEM, תוספי N2 100 μl, 10 גר &#39;/ מיליליטר Cipro ו 1 מיליליטר של FBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של עוברים: הערה: בהליך זה לculturing explants שבלול מעוברי עכברים, אוזניים פנימיות אסיף מיום עוברי (E) 13 עצמות זמניות עם היום לאחר הפריה נשקלות כ9 E1. גם הפרוטוקול ניתן להשתמש עם אוזניים פנימיות עכבר עוברי החל מE12 לE18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מתוזמן בהריון עם CO 2 ולהקריב את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם או פרוטוקולים שאושרו מתאימים. לבצע euthanization ממכסת מנוע בתרבית הרקמה למינרית זרימה כדי לשמור על סטריליות בחדר תרבית הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עכבר מורדמים על מגבת נייר עם בטן כלפי מעלה ולחטא בטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן על ידי גרירה עורעם מלקחיים מעוקלים ביד אחת ועור חתוך ושרירים לאורך קו האמצע עם מספריים באמצעות יד אחרת. שני חתכים בניצב משני הצדדים ולשלוף את הרחם בקפידה על ידי הרמת קרן רחם דו-צדדית עם מלקחיים ולנתק אותו ממתחת מספריים רקמות באמצעות חיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השרשרת העוברית בצלחת פטרי המכילה פתרון מקורר דיסקציה (תערובת HBSS / HEPES) והעברה לספסל הנקי מינרית הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עוברים בזהירות מהשליה ולהכניס אותם לתוך אחת מנות סטרילי פטרי המכילות פתרון לנתיחה. אם הפתרון הופך עקוב מדם, להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה. הערה: בשלב זה, יכול להיות מבוים עובר באמצעות מדריך היערכות Theiler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עוברים על ידי צביטה באזור הצוואר עם זוג מלקחיים או מספריים נקיים ומניח את הראשים בצלחת פטרי המכילה טרי פתרון לנתיחה מקורר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection של האוזניים הפנימיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> o מקוםראש עובר ne בצלחת sylgard סטרילית המכילה לנתח קר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון. עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח בהגדלה של ~ 1.6x, לשתק את ראש העובר על ידי הצבת סיכות Minutien מסביב או קרוב יותר לאזור עיניים (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני זוגות מלקחיים סטרילי להסיר בזהירות את העור ולפתוח את הגולגולת בצד הגב לאורך קו האמצע (איור 1). הסר מוח מחלל גולגולת ואוזניים פנימיות הנמצאות בתוך עצמות זמניות ניתן לזהות בשלב זה (איור 1 ג, ד). הציפוי הפנימי של כלי הדם, שהיא בדרך כלל נוכחים סביב האוזניים הפנימיות, יכול לשמש כנקודת ציון לזיהוי האוזן הפנימית בשלב זה (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האוזן הפנימית מהעצמות הזמניות על ידי הצבת המלקחיים מתחת לרקמה ובידוד האוזן הפנימית מבסיס הגולגולת וההעברה לצלחת חדשה המכילה פתרון לנתח קר (איור 1E, F). </li></ol></li></ol> 2. דור של איברים של תרבויות קורטי explant הערה: בשלב זה של התפתחות, רקמת סחוס היא ויכולה להיות גזור בקלות באמצעות מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט האוזן הפנימית, כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה (איור 2 א) ולייצב את האוזן הפנימית על ידי בעדינות להכניס את הקצה החד של סיכות Minutien דרך חלק שיווי המשקל באוזן הפנימית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים ultrafine באמצעות לחתוך את הסחוס שמעליה על ידי ביצוע חתך באמצעות קצה אחד של מלקחיים ליד החלון הסגלגל ובזהירות להסיר את הסחוס משבלול האוזן (איור 2 ג). הערה: חשוב לוודא כי מלקחיים אינם מוכנסים עמוק מדי לתוך הסחוס כסחוס שמעליה לעתים התמזגו עם צינור השבלול ובמקרה זה הוא מועיל להשתמש במלקחיים סגורים לשחרר סחוס מצינור השבלול הבסיסי על ידי גירוד מתחת ל surface של הסחוס. בשלב זה של התפתחות, ספירלת השבלול היא רק שלושה רבעים מתור באורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחשוף את האפיתל החושית על ידי הצבת המלקחיים באזור המועדף של צינור השבלול, או הבסיס או לכל הקודקוד, ומשייכתו בעדינות את הגג של השבלול (איור 2 ד). הערה: הגג של השבלול יש להסיר לחלוטין כפי שהוא יכול להסוות את האפיתל החושית פוגע הניתוח. הערה: הליך זה חייב להיעשות בעדינות כפי שהוא קל לקרוע את האפיתל החושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כצעד אחרון, להסיר בזהירות את רקמת חיבור הבסיסית מהאפיתל החושית החשופה, כך שהבסיס של explant השבלול הוא אחיד שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את השבלול גזור מחלק שיווי המשקל באוזן הפנימית באמצעות מלקחיים. זה יכול להתבצע לפני או אחרי 2.4 (2E איור) הצעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את האפיתל החושית השבלול גזור לתוך membra מרתףהתרבות גם באמצעות scooper סטרילי 1.5 מ&quot;מ (איור 2F) מצופה מטריצת ne. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט explant השבלול עם משטח lumenal של האפיתל פונה כלפי מעלה ולשאוב את פתרון המטריצה-DMEM קרום במרתף לשטח בזהירות את הרקמה ולהחליף אותו עם 150 μl של מדיום תרבות הטרי בעדינות על ידי הוספה לצלחת. יש להקפיד לוודא שכל explant שומר היטב לcoverslip הזכוכית המצופה ולא צף במדיום התרבות. ודא שקצה המלקחיים הוא הצביע למעלה בזמן ההדבקה ולזכוכית כדי למנוע נזק לexplant השבלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את המנה התרבות לתוך צלחת סטרילית 150 מ&quot;מ תרבות ומקום בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 לתקופה רצויה של זמן, בדרך כלל 3-6 ימים במבחנה (DIV). לאחר DIV 1, לבחון תרבויות תחת מיקרוסקופ לנתח לוודא כי explant השבלול דבק גם למנת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בcubation במבחנה לאורכים רצויים של זמן, תרבויות מעובדות אימונוהיסטוכימיה. הערה: תרבויות explant בדרך כלל טופחו במשך 6 DIV שהוא שווה ערך לשלב ההתפתחותי, P0. לאחר הדגירה במבחנה, יכולות להיות מעובד תרבויות עבור יישומים נוספים במורד הזרם כמו אימונוהיסטוכימיה (איור 3), RT-PCR, הכלאה באתר, ו / או כתם מערבי. </li></ol> 3. העברת גנים בתיווך Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה לצורך electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אחד 100 מ&quot;מ צלחת זכוכית sylgard מצופה על ידי מעוקר או טבילה באתנול 70% לכ -20 דקות ולאפשר לאוויר יבש בספסל נקי לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA מוקטור ביטוי של בחירה באמצעות ערכות maxi- או midi-הכנה מתאימות. וקטורי הביטוי בשימוש בפרוטוקול זה הם pIRES2-Atoh1.EGFP וpCLIG-NeuroD1.EGFP. הריכוז הסופי של ה- DNA צריך להיות מיקרוגרם / μl לפחות 1 בDNA סטרילי /-RNAse חופשית מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporating DNA לתוך explants שבלול עוברי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון ה- DNA פלסמיד לצלחת Sylgard מצופה 100 מ&quot;מ טרי ולהעביר explant גזור באופן מלא שבלול (המתקבל משלב 2.5) לפתרון ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם משטח lumenal של האפיתל פונה כלפי מעלה, להטות את השבלול מעט כל כך שזה ניצב למישור של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את משוטי אלקטרודה משני הצדדים של השבלול עם ההנעה שלילית (קתודה) לקראת האפיתל החושית וההנעה החיובית (אנודה) הממוקמת בסמוך לבסיס של השבלול. הערה: מאחר שה- DNA טעון שלילי, זה נודד משלילי להאלקטרודה חיובית ועל ידי הצבת סוף הקתודה של החללית בסמוך להאפיתל החושית; DNA בעיקר ילך דרך פני השטח של האפיתל החושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות electroporator, לספק 9 עד 10 פולסים של 24 mV, 30 משך דופק msec עם בורר דוושת רגל על ​​tהוא electroporator, ולאחר מכן להוסיף של מדיום תרבות החם 100 μl לשבלול Electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2.1-4 לכל explants השבלול ולDNA של כל הגנים של עניין ולהעביר את cochleae electroporated לתוך הצלחת מצופה מטריצת קרום במרתף לציפוי (שלב 2.7). כל cochleae תרבות electroporated ב-37 מעלות צלזיוס, 5% 2 חממה humidified CO לאורכים רצויים של זמן שלאחר מכן ניתן יהיה מעובד לimmunocytochemistry. הערה: השבלול מהמלטה שלמה של CD1 עכבר (כ 8-12 גורים) יכולה להיות מבודד, microdissected, electroporated ומצופית ב&lt; 4 שעות. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח של תרבויות השבלול explant הערה: התרבויות בדרך כלל טופחו במשך 6 DIV שהוא שווה ערך לשלב ההתפתחותי, P0. לאחר הדגירה במבחנה, התרבויות הם קבועים ומעובדים עבור immunocytochemistry. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אורך רצוי של incubation, להסיר בינוני תרבות ובמהירות לשטוף את explant השבלול שבנאגר מלוח פוספט (PBS) דגירה בparaformaldehyde 4% (מוכן בPBS) במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את מקבע על ידי PBS הוספה ולשטוף בPBS שלוש פעמים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize באמצעות PBS-T (Tween + 0.5% PBS) למשך 30 דקות לפני החסימה עם PBS-T המכיל סרום עיזים 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בפתרון נוגדן ראשוני המכילה נוגדן ראשוני בPBS-T עם 1% עזים בסרום הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השבלול שלוש פעמים בטמפרטורת חדר באמצעות PBS-T 15 דקות כל אחד לפני שמוסיף את נוגדנים משני Alexa מצומדות- מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז explant השבלול הוא בתרבית על coverslip זכוכית יכול להיות מטופלים בנפרד על ידי בידוד coverslip מצלחת והרכבה בשקופית. זו יכולה להיות מושגת על ידי השרייה המנה התרבות בOS30 ממס במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר. באמצעות סכין גילוח סטרילי, לנתק את coverslip מדאיש והר בשקופית ולדמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+development+of+the+organ+of+Corti+in+culture.">Organotypic development of the organ of Corti in culture.</a> J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes1+is+a+negative+regulator+of+inner+ear+hair+cell+differentiation.">Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation.</a> Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).</li><li>Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+regulates+development+of+the+sensory+epithelium+in+the+mammalian+cochlea.">Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea.</a> Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).</li><li>Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+differentiation+and+DNA+binding+(Ids)+regulate+Math1+and+hair+cell+formation+during+the+development+of+the+organ+of+Corti.">Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti.</a> J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).</li><li>Dabdoub, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+signaling+in+prosensory+domain+specification+and+subsequent+hair+cell+differentiation+in+the+developing+cochlea.">Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).</li><li>Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hey2+regulation+by+FGF+provides+a+Notch-independent+mechanism+of+maintaining+pillar+cell+fate+in+the+organ+of+Corti.">Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti.</a> Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).</li><li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+cochlea.">Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea.</a> J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1995).</li><li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse.">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).</li><li>Torres, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+vertebrate+inner+ear.">The development of the vertebrate inner ear.</a> Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).</li><li>Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+inner+ear+induction.">Molecular basis of inner ear induction.</a> Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).</li><li>Puligilla, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+world&#8217;s+best+hearing+aid;+regulation+of+cell+fate+in+the+cochlea.">Building the world&#8217;s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).</li><li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).</li><li>Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral-mediated+gene+transfer+to+study+the+molecular+physiology+of+the+mammalian+inner+ear.">Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).</li><li>Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+hair+cells+and+support+cells+of+the+murine+cochlea.">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea.</a> Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

כל התאים בתוך המבוך הקרומי של האוזן הפנימית העכבר כוללים חושי, nonsensory וכל הנוירונים הגנגליון הספירלה נגזרים מplacodally-נגזר otocyst ממוקם בסמוך למוח האחורי של האאקטודרם, סביב 10-14 E8. בE11, אזור הגחון של otocyst משתרע ליצירת צינור השבלול וכפיתוח ממשיך, קבוצה של תאי האפיתל בשבל?...

The mammalian organ of Corti is comprised of a mosaic of specialized cell types, including two types of mechanosensory hair cells as well as at least four types of nonsensory supporting cells making it an ideal model system to study normal cellular processes like proliferation, fate specification, differentiation and patterning. In addition, the normal development of these different cell types is essential for normal hearing function. Hence, it is crucial to understand the factors, both molecular and cellular, that regulate their development. However, the small size of the mouse cochlea as well as its inaccessibility poses a particular challenge for gene expression studies. Moreover, most of the cell fate specification and patterning events occur during embryonic time periods and are mostly completed before birth. Therefore, identification and characterization of signaling events during embryonic time periods is essential to gain insight into the molecular basis of cochlear morphogenesis. 
Here, we demonstrate a method to culture intact cochlea in vitro from embryonic mouse inner ears. The rationale behind the use of this technique is that cultured cochleae maintain their molecular and morphological characteristics thereby providing a valuable model for investigating potential candidate genes and exploring the mechanisms involved in cochlear morphogenesis. Although transgenic mice can be used for gene expression studies, an in vitro system is often needed for monitoring specific gene functions. Moreover, cochlear cultures can be established from transgenic mouse embryos so that their in vitro development and response to various soluble factors and antagonists can be studied. Although embryos at day 13 (E13) are used in this protocol, cultures from E12 or E14 to early postnatal inner ears can give similar results. 
We also present a gene transfer technique in cultured embryonic cochlear explants using square wave electroporation. Following the isolation of the cochlear explants, electroporation can be used to express DNA plasmids of gene(s) of interest in individual cells within the cochlear duct. This technique serves as a complementary approach to studies utilizing transgenic mice to gain insight into the molecular pathways underlying cellular phenotype. Using this method of gene transfer, a variety of epithelial cell types within the embryonic cochlea are transfected, thereby enabling loss-and gain-of-function analyses at the single-cell level. In addition, electrophysiological studies can also be performed in cochlear explant cultures8. This method of in vitro electroporation is relatively simple and straightforward, combined with minimal damage to the tissue, has resulted in a rapid expansion of this technique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="836">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14065-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Dulbecco&#8217;s Modified Medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">12430-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">10082</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">N-2 Supplement (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Ciprofloxacin Hydrochloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Cellgro</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">61-277-RF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Glass Dish 60mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Kimble Chase</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">23062-6015/23064-6015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Glass Dish 100 mm</td>
			<td dir="LTR">Kimble Chase</td>
			<td style="width:161px;">23064-10015/23062-10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">26002-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Dumont # 5 Forceps</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Fine Science Tools</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">11251-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Pulse Generator&#160;</td>
			<td dir="LTR">Protech International Inc</td>
			<td style="width:161px;">CUY21Vivo-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">MatTek</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">P35G-0-10-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Matrigel Matrix</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">356237</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Culture Dish, 60 X 15 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:161px;">353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Tissue&#160; Culture Dishes</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:161px;">639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">OS-30</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Dow Corning</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">4021768</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:316px;">Fluoromount</td>
			<td dir="LTR" style="width:192px;">Southern Biotech</td>
			<td dir="LTR" style="width:161px;">0100-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Conical Tubes, 15ml</td>
			<td style="width:192px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:161px;">188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Myosin 6</td>
			<td>Proteus Biosciences Inc</td>
			<td style="width:161px;">25-6791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">Myosin 7a</td>
			<td style="width:192px;">Proteus Biosciences Inc</td>
			<td style="width:161px;">25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:316px;">TuJ1</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We describe a method to isolate cochlea from embryonic inner ears and micro-dissect to expose the sensory epithelium. Once dissected, it may be plated and cultured as an intact cochlear duct (Figure 3) and analyzed by immunohistochemistry. The cultured cochlear explants provide a useful assay to examine the effect of variety of soluble factors and pharmacological drugs on cochlear development. Following dissection of cochlear explants, electroporation technique can be used to misexpress genes of interest...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation at JoVE.com

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

culture-embryonic-mouse-cochlear-explants-gene-transfer

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Views.  Medical University of South Carolina, College of Medicine. We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development. 

Video: Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: