ברצוננו להודות תמיכה של ארה&quot;ב National Institutes of Health מענקים R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 ו R01EB007279 ו American Heart Association מענק 0855772D.

1. שדה רחב של הדמיה לאור pO2 ב vasculature קליפת המוח של חולדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות (250 גרם -350 גרם) הם בתחילה הרדים עם isoflurane, ואת עורק וריד הירך הם צינתור כדי לפקח על קצב הלב, לחץ הדם, וגזים בדם, כמו גם עבור עירוי תוך ורידי. טמפרטורת הגוף נשמר 37 ± 0.1 ° C. ההנשמה מתבצעת, וחולדות מאוורר בתערובת של אוויר וחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות דם למדידת גזים בדם נלקחים כל 30-45 דקות ו אוורור הרדמה מותאמים לשמור על גזים בדם בטווח פיזיולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון גולגולתי סגור על 4 מ&quot;מ עצם הקודקודית x 4 מ&quot;מ בגודל מוכן הדמיה. העצם הדורה יוסרו החלון גולגולתי מלא agarose 1.5% ונחתם coverslip מיקרוסקופ. נוספים 1 2 מ&quot;מ חור בר על העצם הפרונטלית משמש כדי לגרום CSD ידי microinjection intracortical של KCl (~ 10 μl, 1 מ &#39;). זהירות קיצוניים צריך לנקוט כדי למנוע נזק בכלי הדם של קליפת המוח. עודף חום, לחץ מכני, או תקופה קצרה של היפוקסיה עלול לפגוע במוח דם המכשול לגרום דליפה של צבע מן vasculature לחלל ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסכה מחומר אטום אופטית ממוקם סביב חלון גולגולתי. מטרת המסכה היא לקלוט אות זרחני כי מגיע לצבוע כי דלף לתוך הרקמה מקצות העניין הדורה. צבע במרחב ביניים הוא מקור זרחני בהיר מאוד שיכולים לקלקל את המדידה. בהירות מוגברת של צבע במרחב ביניים היא תוצאה של הצטברות של צבע בסביבה עם לחץ חמצן נמוך בשיעור נמוך מרווה. הנזק של vasculature בניסוי ולכן הוא מוכר בקלות על ידי הופעת כתמים זרחני בהיר, ובמקרה נתונים ניסיוניים נדחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הניתוח, isoflurane הוא הופסק הרדמה הוא עבר alphachloralose (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג בולוס תוך ורידי ואחריו 40 מ&quot;ג / (ק&quot;ג ח) עירוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים מועבר על עגלה עם לחץ דם, הנשמה וניטור טמפרטורה. תוך כדי שאיפת אוויר חדר, החיה מועברת במהירות ההתקנה הדמיה כדי לחבר מחדש flowmeter עם תערובת מתאימה של אוויר וחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המסגרת stereotaxic שמחזיק את החיה תחת המטרה. החלון גולגולתי מרוכז בתחום להציג תחת המטרה ואת מיקומו מקביל למישור המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר פעמו מופעלת ומוגדרת אנרגיה דופק מינימלי. קרן אופטית מכוונת מד דופק אנרגיה ואנרגיה הדופק נמסר המדגם הוא מותאם להיות לא יותר מ 10 mJ / 2 ס&quot;מ. ISS קרן ממוקדת על חלון הגולגולת עם זווית אלכסונית שכיחות של ~ 60 מעלות לייזר ISS כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז דם מדידות והתאמות של אוורור ושל הרדמה מבוצעות עד שכל הפרמטרים הפיזיולוגיים של החיה היו בטווח פיזיולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהנחה כי נפח הדם הוא כ 7% ממשקל הגוף, הכמות המתאימה של R3 בדיקה זרחני Oxyphor מומס 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח כדי להשיג 4 x 10 -5 M הריכוז בדם של החללית. הפתרון בדיקה מוזרק דרך וריד הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 1 M של אשלגן כלורי הוא מוכן ~ 1 ul מוזרק עם המזרק דרך החור בר על העצם הקדמית כדי לגרום CSD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלייזר מופעל הדמיה הוא התחיל מיד לאחר ההזרקה של הפתרון KCl. הדמיה של זרחני מבוצעת במהלך 10 דקות ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה נוספת גז דם מבוצעת כדי לאשר פרמטרים פיזיולוגיים חיה עדיין בתוך הטווח הנורמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיים זרחני מתקבלים עבור כל פיקסל על ידי מתאים דעיכה מעריכית יחיד שימוש הולם מרובע ליניארית עם שקלול סטטיסטי ב-Matlab. חיים זרחני מומרים pO2 ערכים באמצעות יחסים אמפירי שטרן Volmer כמו (אינפרא vide). </li></ol> 2. ברזולוציה גבוהה שני הפוטונים pO2 הדמיה vasculature מיקרו קליפת המוח של העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מורדמים עם עורק isofluorene ו הירך הוא צינתור כדי לפקח על קצב הלב, לחץ הדם, וגזים בדם, כמו גם לניהול של צבע. טמפרטורת הגוף נשמר 37 ± 0.1 מעלות צלזיוס, בעלי חיים ספונטני נשימה תערובת של אוויר וחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון גולגולתי מוכן על פי טכניקה שפותחה לראשונה על ידי דיוויד קליינפלד ואת Winfried Denk. טיפול טוב יש לנקוט כדי למנוע נזק של כלי הדם כדי למנוע זליגה אפשרית של צבע לחלל ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות דם כמה למדידת גזים בדם נלקחים במהלך הליך ההכנה כולה אוורור הרדמה מותאמים לשמור על גז דםes בטווח פיזיולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיה מועברת ההגדרה הדמיה. מסגרת stereotaxic שונה שמחזיק את החיה תחת המטרה. החלון גולגולתי מרוכז בתחום להציג תחת המטרה אולימפוס 4X ואת מיקומו מקביל למישור המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה של חלון גולגולתי הוא שצולמו במצלמה דיגיטלית דרך מהעיניות, לבין המטרה 4X מוחלפת במטרה אולימפוס 20X (NA = 0.95). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז דם מדידות והתאמות של אוורור ושל הרדמה מבוצעות עד שכל הפרמטרים הפיזיולוגיים של בעל החיים הם בטווח פיזיולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהנחה כי נפח הדם הוא כ 7% ממשקל הגוף, הכמות המתאימה של זרחני בדיקה PTP-C343 הוא מומס 0.2 מ&quot;ל של תמיסת מלח כדי להשיג דם ~ 15 מיקרומטר ריכוז של החללית. הפתרון בדיקה מוזרק דרך עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הניסוי ידי הגדרת מרווחי הזמן הרצוי עבור עירור לצבוע ואיסוף פליטת כל פיקסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת סריקה סקר אשר סריקה איטית 2 ממדי סריקה של ריקבון עוצמת זרחני המציג את מבנה vasculature בעומק הנוכחי. המטרה היא עברה בניצב לחלון גולגולתי (ציר Z) ואיטי סריקות סקר 2D של עוצמת זרחני נלקחים באמצעות כוח לייזר מינימלי ב 840 ננומטר למצוא את microvessels במישור הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעומק כל הדמיה, המבוסס על סריקה הסקר של זרחני בעומק זה, קבוצה של נקודות בתוך vasculature הם נבחרים, ורישום דועך זרחני בכל נקודה חוזרת עבור מספר מוגדר מראש של ממוצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הסכום הרצוי בממוצע, רווח מדידה, משך הניסוי ולהתחיל המדידה. ת.ד. 2 מדידות נרכשים במיקומים נבחרים במרווח המדידה המפורטים למשך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך המדידות, התוכנה מחדש מכוון את הלייזר עירור על המיקומים שנבחרו על ידי שינוי המיקום של המראות סריקה גלונומטר. שליטה על סורקים גלונומטר, אפנן אלקטרו אופטי, וכל ציוד אחר מבוצעות על ידי תוכנה בהתאמה אישית ב LabVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיים זרחני מתקבלים עבור כל הנקודות שנבחרו על ידי מתאים דעיכה מעריכית יחיד שימוש הולם מרובע קוי ב-Matlab. חיים זרחני מומרים pO2 ערכים באמצעות יחסים אמפירי שטרן Volmer כמו (אינפרא vide). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף הנתונים בעומקים שונים בקליפת המוח, להזריק dextran-מצומדות צבע פלואורסצנטי לתוך vasculature הדמיה המבנה microvasculature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ערימה של תמונות המבנית של vasculature ידי ביצוע הדמיה שני פוטונים של הקרינה FITC להשתמש בערוץ הירוק גלאי ארבע הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ועדת המשנה החולים הכללי מסצ&#39;וסטס על טיפול בבעלי חיים למחקר. </li></ol> 3. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. תרשים לוח (א) בצד שמאל של נתון זה מציג שדה רחב של נוף תמונה של לחץ חמצן לפני ההגעה של גל CSD. לוח (ב) בצד ימין ניתן לראות את האבולוציה הזמני של לחץ החמצן הממוצע במהלך התפשטות CSD בתוך האזור של עניין מסומן בלוח (א). איור 2 (avi סרט): סרט זה מציג את האבולוציה הזמני של לחץ החמצן בחלון הגולגולת כולה במהלך התפשטות של הגל CSD. בר מציין סולם לחץ החמצן מילימטרים של כספית. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הקרנת 3D של מחסנית vasculature הדמיה. גוונים של אפור מייצגים מסכה כלי נפח, שנוצר על בסיס התמונה מבניים. נמדד ת.ד. 2 ערכים מסומנים בצבעים. בר סולם הוא 200 מיקרומטר. התפרסם באישור קבוצת פרסום הטבע 7.

<ol>
	<li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y., Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+occlusion+to+surface+and+deep+vessels+in+neocortex+via+linear+and+nonlinear+optical+absorption,+Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries.">Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries.</a> Contemporary Neuroscience Series. , (2007).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems.">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials &#38; Interfaces. , (2009).</li><li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence.">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li><li>Sakad&#382;i&#263;, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression.">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li><li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy.">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li><li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li></ol>

הראינו שתי בקשות המדידה pO2 ב microvasculature קליפת המוח מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני. בעוד השיטה הראשונה מבוססת על CCD הדמיה מספקת בתחום רחב של ניטור לאור pO2, מדידת הלחץ החלקי של החמצן microvasculature קליפת המוח על בסיס מיקרוסקופיה 2-פוטון מספקת רזולוציה נימי ומאפשר הדמיה לעומק....

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycopyrrolate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Regent Inc.</td>
<td>NDC 0517-4605-25</td>
<td>Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lidocaine HCL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc.</td>
<td>NDC 0409-4277-01</td>
<td>Used as the local anesthesia during surgeries.</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Baxter Healthcare Corp.</td>
<td>NDC 10019-360-40</td>
<td>Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Chloralose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0128</td>
<td>Used as a general anesthesia during experiments with rats.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein isothio-cyanate&#x2013;dextran</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>FD2000S</td>
<td>Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cerebral blood oxygenation measurement based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence

ניטור מאפייני spatiotemporal הדם המוחיים חמצון רקמות הוא חיוני להבנה טובה יותר של מערכת היחסים נוירו מטבולית-וסקולרית. פיתוח שיטות חדשות למדידת pO2 עם ניטור סימולטני של pO2 בתחומים יותר של נוף עם רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ו / או הזמני יאפשר להבין טוב יותר את תפקודו של המוח נורמלי תהיה גם השפעה משמעותית על אבחון וטיפול של מחלות כגון neurovascular שבץ, מחלת אלצהיימר, וכן פגיעת ראש. שיטות הדמיה אופטית הראו פוטנציאל גדול כדי לספק רזולוציה גבוהה spatiotemporal הדמיה כמותי של pO2 מבוסס על ספיגת המוגלובין בטווח אינפרא אדום לעין וליד של הספקטרום האופטי. עם זאת, המדידה multispectral של חמצון הדם במוח מסתמך על הגירה פוטון דרך רקמת המוח פיזור מאוד. שערוך דוגמנות של פרמטרים רקמות אופטי, אשר עשוי לעבור שינויים דינמיים במהלך הניסוי, נדרש בדרך כלל עבור הערכה מדויקת של חמצון בדם. מאידך גיסא, הערכת הלחץ החלקי של החמצן (pO2) מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני לא אמור להיות מושפע באופן משמעותי על ידי שינויים בפרמטרים אופטיים של הרקמה ומספק אמצעי המוחלט של pO2. מערכות ניסיוני לנצל חמצן רגיש צבעים הוכחו במחקרים vivo בתוך הרקמה perfused כמו גם לניטור תכנים חמצן בתרביות רקמה, מראה כי מרווה זרחני היא טכנולוגיה חזק המסוגל חמצן הדמיה מדויקת בטווח pO2 פיזיולוגיים. כאן אנו מפגינים עם שתי שיטות הדמיה שונות כיצד לבצע מדידת pO2 ב vasculature קליפת המוח מבוסס על הדמיה החיים זרחני. בהפגנה הראשונה שאנחנו מציגים בתחום רחב של הדמיה לאור pO2 על פני קליפת המוח של חולדה. זו שיטת הדמיה התקנה ניסיונית פשוטה יחסית המבוססת על מצלמת CCD ו לייזר ירוק פעמו. דוגמה ניטור דיכאון הפצת קליפת המוח מבוסס על חייו של צבע זרחני R3 Oxyphor הוצג. בהפגנה השנייה אנו מציגים ברזולוציה גבוהה שני הפוטונים pO2 הדמיה vasculature מיקרו קליפת המוח של העכבר. הגדרת הניסוי כולל מותאם אישית בנוי 2-פוטון מיקרוסקופ עם לייזר femtosecond, אלקטרו אופטיים אפנן ו-פוטון לספור מכפיל שפופרת תמונה. אנו מציגים דוגמה של הדמיה ההטרוגניות pO2 ב microvasculature קליפת המוח כולל נימים, באמצעות רומן PTP-C343 עם צבע משופר 2-פוטון חתך עירור. לחץ כאן כדי להציגו הקשורות <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">סינתזה כיול של nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence at JoVE.com

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

אנו מציגים הליך הניסוי למדידת הלחץ החלקי של החמצן (pO2) בתוך כלי הדם המוחיים מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני. הכנת בעלי חיים ונהלים הדמיה שהותוו הן עבור שדה גדול של הדמיה מבוססי CCD לאור pO2 בחולדות 2-פוטון הדמיה מבוססת עירור של pO2 בעכברים.

הדם במוח חמצון מדידה על בסיס מרווה חמצן תלויי של זרחני

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. אנו מציגים הליך הניסוי למדידת הלחץ החלקי של החמצן (pO2) בתוך כלי הדם המוחיים מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני. הכנת בעלי חיים ונהלים הדמיה שהותוו הן עבור שדה גדול של הדמיה מבוססי CCD לאור pO2 בחולדות 2-פוטון הדמיה מבוססת עירור של pO2 בעכברים.

Video: Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

מודל עכברוש של זילוח תוך רחמי קלה עם היצרות Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

הזרקת הלחי מודל עבור מדידה בו של כאב התנהגויות הקשורות בגירוד

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

מיפוי זרימת דם מוחית ושדות חשמליים: מיקום אלקטרודות בעכברים

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

מחבר זרקור: גישה מבוססת גירוי לשיפור זרימת הדם במוח במודל של אלצהיימר 

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

מיקום אלקטרודות מעוררות חוץ-גולגולתיות ומדידת זרימת דם מוחית ושדות חשמליים תוך גולגולתיים בעכברים מורדמים

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...